淋球菌L型的诱导及基本生物学性状的研究
作者：唐宁枫 宋宁静 林特夫 黄谷良 吴绍熙
单位：210042 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤 病研究所(唐宁枫 吴绍熙)；安徽蚌埠市第三人民医院(宋宁静)；蚌埠医学院微生物教研室 (林特夫 黄谷良)
关键词：
中华皮肤科杂志980524 淋病奈瑟菌(简称淋球菌，NG)体内外可发生L型变异[1，2 ]。我们用抗生素诱导获得淋球菌L型，并对其生物学性状与原菌进行了比较， 旨在了解淋球菌L型有何特性以便为临床提供治疗依据。为了实验的需要，我们也对其保存 进行了研究。
一、材料与方法
1.菌株：淋球菌标准菌株29400，购自卫生部药品生物制品检定所。NG1和NG2株为临 床分离并经系统鉴定。
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2.淋球菌L型培养基：以牛肉浸液为基础，加1%蛋白胨，1% NaCl，7% PVP，1%琼脂，10%小 牛血清。调整pH至7.2～7.5。
3.诱导剂的浓度范围：不同浓度的苯唑青霉素加入淋球菌L型培养基中。其最终浓度依次为1 200、1000、800、600、400、200、100、50、10、5、1μg/ml。将标准株、NG1株和NG 2株分别接种于上述L型平板上，培养48小时，观察L型菌落形成的情况。
4.传代与回复试验：诱导成的L型于L型平板上传代时，在平板上贴苯唑青霉素纸片(500μg/ 片)，以获稳定的L型。取传不同代数的L型移种于不含抗生素的L型平板上，观察回复情况。
5.氧化酶试验：取不同传代数的L型菌落，滴加氧化酶试剂观察菌落颜色变化情况。
6.糖发酵试验：采用淋球菌L型糖发酵管，1%蛋白胨，1%糖，7% PVP，10%小牛血清，青霉素 50U/ml。以溴甲酚紫为指示剂。取不同传代数的三株淋球菌L型接种于三种糖发酵管中，培 养24、48、72小时观察颜色变化。
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7.滤过性：将标准株的细菌型和L型制成菌悬液，比浊法测定浓度为5×109/ml，使细 菌型和L型 菌液分别经孔径为0.45μm的除菌膜滤过。滤液涂布于L型平板上，培养48小时观察生长情 况。
8.药敏试验：分别将标准株的细菌型、稳定L型和于含抗生素平板上传5代后的回复株在L型 及普通平板上按常规纸片法做药敏试验。
9.淋球菌L型的保存：采用保存淋球菌细菌型的方法[3]。将培 养24小时标准株NG1和NG2的稳定L型分别从L型平板上刮下，加入已脱脂的牛奶，调整 浓度至3×109/ml，置于-25℃冰箱中。经5、10、15、20、25、30天后取牛奶管解冻， 取0.05ml含细菌的牛奶均匀涂于淋球菌L型平板上，培养24小时。计算每个平板上的细菌数 。
二、结果
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1.苯唑青霉素诱导L型的浓度范围：苯唑青霉素可诱导29400，NG1与NG2三株淋球菌形 成L型的浓度范围分别为5～800μg/ml、10～800μg/ml、50～1000μg/ml。在上述浓度范围 内细菌出现明显的多形性，菌落中有丝状体、巨形体及圆球体。
2.L型的传代及回复：淋球菌L型在含有苯唑青霉素L型平板上可连续传代，形成油煎蛋样菌 落，L型在含有苯唑青霉素的L型平板上传10代以内容易回复，在不含苯唑青霉素平板上传1 ～5代即可回复为原菌，在含苯唑青霉素平板上传15代后L型基本稳定。
3.氧化酶试验：籍滴加氧化试剂后，L型菌落颜色有无改变及深浅判断。随传代次数的增加 ，L型氧化酶反应逐渐减弱，10代以后为阴性反应。
4.糖发酵试验：L型随着传代次数的增加，其分解葡萄糖的能力逐渐减弱，但传至20代时仍 呈弱阳性，与原菌一样，L型各代均不分解麦芽糖和蔗糖。
, 百拇医药
5.滤过性：取L型通过0.45μm滤膜的滤液涂布于平板上，培养后见菌落生长，经涂片可见L 型。细菌型的滤液涂布于平板上培养后无菌生长。
6.药敏试验结果见表1。
表1 淋球菌细菌型、L型及回复株药敏试验 抗 生 素
细菌型
L型
回复株
青霉素G
-
+
氨苄青霉素
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+
-
+
羧苄青霉素
+
-
+
先锋霉素Ⅴ
-
红 霉 素
-
, 百拇医药
-
四 环 素
-
+
-
壮观霉素
+
+
氟 哌 酸
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氟 嗪 酸
+
+
头孢三嗪
注：为高度敏感，+为中度敏感，-为耐药
7.淋球菌L型的保存结果见表2。
表2 淋球菌L型保存时间与复苏菌落数的关系 菌 株
, 百拇医药
保存时间(天)
5
10
15
20
25
30
29400 L型
>104
>500
247
66
7
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-
NG1 L型
>104
>500
178
41
2
-
NG2 L型
>104
>500
144
, http://www.100md.com
35
-
-
注：-表示无菌生长
三、讨论
淋球菌L型的产生与诱导剂的浓度有关，浓度为5～800μg/ml的苯唑青霉素均可诱导三株淋 球菌形成L型。NG2在浓度为1000μg/ml时仍可变为L型。尽管在 治疗的过程中青霉素使用的剂量较大，但其能在很大的浓度范围内诱导淋球菌L 型的形成，这给淋病的治疗带来困难。
淋球菌L型细胞壁不同程度的缺失而呈高度的多形性，细菌易变形，可通过除菌滤膜，是造 成临床上淋病漏诊、误诊的重要原因。人工诱导所获得的L型稳定程度往往与在含有诱导剂 的培养基中的传代次数有关。稳定L型的形成可能是由于细胞壁成分完全缺失，细菌失去了 为新细胞壁合成的引物，也可能是由于诱导因素长期存在，细菌发生了基因突变，产生的细 胞壁缺陷株经抗生素的选择，即可获得稳定的L型[2]。随传代 次数的增加，淋球菌L型的生化反应发生了一定程度的改变，提示由于细胞壁的缺陷，使嵌 于细胞壁膜上的酶发生丢失[2]。
, 百拇医药
由于细胞壁的缺陷，L型对作用于细胞壁合成的抗生素敏感性降低。由于L型细胞壁的不完整 而通透性变大，故对作用于胞质内蛋白质及脱氧核糖核酸合成的抗生素的敏感性增加[2]。回复株和原菌的耐药性接近。
三株淋球菌L型在-25℃下保存20天未死，且能在平板上复苏相当数量的菌落，说明采用该方 法保存淋球菌L型有效保存期为20天。
参考文献 1 关超, 汤秀兰, 张正银, 等. L型淋球菌性前列腺炎63例报告. 中华泌尿外科杂志, 1994,15∶125.
2 林特夫. 细菌L型的生物学性状与致病性. 见: 黄谷良主编. 细胞L型与疾病. 北 京: 学苑出版社, 1991.66-68.
3 叶顺章. 性病实验检查技术. 见: 叶干运主编. 实用性病学. 北京: 人民卫生出 版社, 1991.218-220., http://www.100md.com
单位：210042 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤 病研究所(唐宁枫 吴绍熙)；安徽蚌埠市第三人民医院(宋宁静)；蚌埠医学院微生物教研室 (林特夫 黄谷良)
关键词：
中华皮肤科杂志980524 淋病奈瑟菌(简称淋球菌，NG)体内外可发生L型变异[1，2 ]。我们用抗生素诱导获得淋球菌L型，并对其生物学性状与原菌进行了比较， 旨在了解淋球菌L型有何特性以便为临床提供治疗依据。为了实验的需要，我们也对其保存 进行了研究。
一、材料与方法
1.菌株：淋球菌标准菌株29400，购自卫生部药品生物制品检定所。NG1和NG2株为临 床分离并经系统鉴定。
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2.淋球菌L型培养基：以牛肉浸液为基础，加1%蛋白胨，1% NaCl，7% PVP，1%琼脂，10%小 牛血清。调整pH至7.2～7.5。
3.诱导剂的浓度范围：不同浓度的苯唑青霉素加入淋球菌L型培养基中。其最终浓度依次为1 200、1000、800、600、400、200、100、50、10、5、1μg/ml。将标准株、NG1株和NG 2株分别接种于上述L型平板上，培养48小时，观察L型菌落形成的情况。
4.传代与回复试验：诱导成的L型于L型平板上传代时，在平板上贴苯唑青霉素纸片(500μg/ 片)，以获稳定的L型。取传不同代数的L型移种于不含抗生素的L型平板上，观察回复情况。
5.氧化酶试验：取不同传代数的L型菌落，滴加氧化酶试剂观察菌落颜色变化情况。
6.糖发酵试验：采用淋球菌L型糖发酵管，1%蛋白胨，1%糖，7% PVP，10%小牛血清，青霉素 50U/ml。以溴甲酚紫为指示剂。取不同传代数的三株淋球菌L型接种于三种糖发酵管中，培 养24、48、72小时观察颜色变化。
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7.滤过性：将标准株的细菌型和L型制成菌悬液，比浊法测定浓度为5×109/ml，使细 菌型和L型 菌液分别经孔径为0.45μm的除菌膜滤过。滤液涂布于L型平板上，培养48小时观察生长情 况。
8.药敏试验：分别将标准株的细菌型、稳定L型和于含抗生素平板上传5代后的回复株在L型 及普通平板上按常规纸片法做药敏试验。
9.淋球菌L型的保存：采用保存淋球菌细菌型的方法[3]。将培 养24小时标准株NG1和NG2的稳定L型分别从L型平板上刮下，加入已脱脂的牛奶，调整 浓度至3×109/ml，置于-25℃冰箱中。经5、10、15、20、25、30天后取牛奶管解冻， 取0.05ml含细菌的牛奶均匀涂于淋球菌L型平板上，培养24小时。计算每个平板上的细菌数 。
二、结果
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1.苯唑青霉素诱导L型的浓度范围：苯唑青霉素可诱导29400，NG1与NG2三株淋球菌形 成L型的浓度范围分别为5～800μg/ml、10～800μg/ml、50～1000μg/ml。在上述浓度范围 内细菌出现明显的多形性，菌落中有丝状体、巨形体及圆球体。
2.L型的传代及回复：淋球菌L型在含有苯唑青霉素L型平板上可连续传代，形成油煎蛋样菌 落，L型在含有苯唑青霉素的L型平板上传10代以内容易回复，在不含苯唑青霉素平板上传1 ～5代即可回复为原菌，在含苯唑青霉素平板上传15代后L型基本稳定。
3.氧化酶试验：籍滴加氧化试剂后，L型菌落颜色有无改变及深浅判断。随传代次数的增加 ，L型氧化酶反应逐渐减弱，10代以后为阴性反应。
4.糖发酵试验：L型随着传代次数的增加，其分解葡萄糖的能力逐渐减弱，但传至20代时仍 呈弱阳性，与原菌一样，L型各代均不分解麦芽糖和蔗糖。
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5.滤过性：取L型通过0.45μm滤膜的滤液涂布于平板上，培养后见菌落生长，经涂片可见L 型。细菌型的滤液涂布于平板上培养后无菌生长。
6.药敏试验结果见表1。
表1 淋球菌细菌型、L型及回复株药敏试验 抗 生 素
细菌型
L型
回复株
青霉素G
-
+
氨苄青霉素
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+
-
+
羧苄青霉素
+
-
+
先锋霉素Ⅴ
-
红 霉 素
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四 环 素
-
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壮观霉素
+
+
氟 哌 酸
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氟 嗪 酸
+
+
头孢三嗪
注：
为高度敏感，+为中度敏感，-为耐药7.淋球菌L型的保存结果见表2。
表2 淋球菌L型保存时间与复苏菌落数的关系 菌 株
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保存时间(天)
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29400 L型
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NG1 L型
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NG2 L型
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注：-表示无菌生长
三、讨论
淋球菌L型的产生与诱导剂的浓度有关，浓度为5～800μg/ml的苯唑青霉素均可诱导三株淋 球菌形成L型。NG2在浓度为1000μg/ml时仍可变为L型。尽管在 治疗的过程中青霉素使用的剂量较大，但其能在很大的浓度范围内诱导淋球菌L 型的形成，这给淋病的治疗带来困难。
淋球菌L型细胞壁不同程度的缺失而呈高度的多形性，细菌易变形，可通过除菌滤膜，是造 成临床上淋病漏诊、误诊的重要原因。人工诱导所获得的L型稳定程度往往与在含有诱导剂 的培养基中的传代次数有关。稳定L型的形成可能是由于细胞壁成分完全缺失，细菌失去了 为新细胞壁合成的引物，也可能是由于诱导因素长期存在，细菌发生了基因突变，产生的细 胞壁缺陷株经抗生素的选择，即可获得稳定的L型[2]。随传代 次数的增加，淋球菌L型的生化反应发生了一定程度的改变，提示由于细胞壁的缺陷，使嵌 于细胞壁膜上的酶发生丢失[2]。
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由于细胞壁的缺陷，L型对作用于细胞壁合成的抗生素敏感性降低。由于L型细胞壁的不完整 而通透性变大，故对作用于胞质内蛋白质及脱氧核糖核酸合成的抗生素的敏感性增加[2]。回复株和原菌的耐药性接近。
三株淋球菌L型在-25℃下保存20天未死，且能在平板上复苏相当数量的菌落，说明采用该方 法保存淋球菌L型有效保存期为20天。
参考文献 1 关超, 汤秀兰, 张正银, 等. L型淋球菌性前列腺炎63例报告. 中华泌尿外科杂志, 1994,15∶125.
2 林特夫. 细菌L型的生物学性状与致病性. 见: 黄谷良主编. 细胞L型与疾病. 北 京: 学苑出版社, 1991.66-68.
3 叶顺章. 性病实验检查技术. 见: 叶干运主编. 实用性病学. 北京: 人民卫生出 版社, 1991.218-220., http://www.100md.com