新生隐球菌的PCR指纹分析
作者：顾菊林 廖万清 柴建华
单位：200003 上海，第二军医大学长征医院皮肤科(顾 菊林 廖万清)；复旦大学遗传学研究所(柴建华)
关键词：
中华皮肤科杂志980518 传统的新生隐球菌的分型主要采用依据荚膜抗原决定簇的血清分型方法。 但仅能分成数种血清型，用于菌株间的变异分析显得无能为力。有资料表明相同血清 型的新生隐球菌菌株可呈现明显不同的病理、生理反应[1，2] 。我们采用PCR指纹技术对新生隐球菌不同分离株进行了DNA多态性分析，现将结果报道如下 。
一、材料与方法
(一)菌株：新生隐球菌参考菌株D48、ATCC64538、ATCC64528为A血清型，RV45981、RV59939 、RV60047、RV43185为D血清型，RV52643、RV54135为B血清型，RV52646、RV45978为C血清 型，除D48株为WHO赠送外，其余均为比利时热带病研究所赠送。白念珠菌ATCC76615由美国 辉瑞公司赠送。罗伦特隐球菌CZ18由我科真菌室保藏。14株本科真菌室从1981年至1994年分 离或获赠新生隐球菌临床分离菌株用于本项研究，包括5对各分离自同一例患者的10株分离 株。主要培养来源为脑脊液，个别菌株为血和脑组织。
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(二)方法：
1.真菌DNA的制备：所有真菌DNA制备采用高盐法[3]。
2.PCR指纹分析：微卫星核苷酸序列5′-(GACA)4-3′用作PCR反应的单引物。经PCR条 件的优化，最终采用的扩增反应体系为，引物0.5μmol/L，Mg2.0mmol/L，10mmo l/L Tris HCl，pH9.0，50mmol/L KCl，dNTP每种200μmol/L，DNA聚合酶2.0单位(Gibco BRL)，模板1μl(约10～50ng)，总体积50μl。反应在PT-150 PCR扩增仪(MJ Research)中 进行，采用热启动程序，即在初始96℃ 5分钟变性后，在80℃以上加入DNA聚合酶，加酶后 进行35个循环：92℃变性20秒，42℃退火40秒，72℃延伸1分30秒。最后一轮反应后72℃延 伸10分钟。取15μl扩增产物进行2.0%琼脂糖、1×TAE凝胶电泳，观察结果、照相。
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二、结果
采用微卫星引物5′-(GACA)4-3′所有实验菌株均能得到有效扩增，产生长度范围为0 .5～4.0kb多达16条带的PCR指纹。为了评价PCR指纹反应的稳定性，两株菌株白念珠菌ATC C76615及罗伦特隐球菌CZ18，经6次亚培养获得相同的PCR指纹(图1)。
1：阴性对照；2～5：依次为罗伦特隐球菌CZ 18初始菌株，罗伦特隐球菌 CZ18亚培养菌株，白念珠菌ATCC76615初始菌株，白念珠菌ATCC76615亚培养菌株；M： 核苷酸分子量标记pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ和λDNA-HindⅢ
图1 新生隐球菌PCR指纹分析重复性评价
11株不同血清型的新生隐球菌参考菌株在种、血清型和菌株水平上存在变异(图1、2)。白念 珠菌、罗伦特隐球菌和新生隐球菌的PCR指纹存在明显差异。新生隐球菌的不同血清型也表 现出一定程度的血清型间的特异性和血清型内的保守性。另外相同血清型的不同菌株也呈现 不同程度的变异性。
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泳道1～11依次为新生隐球菌D48，ATCC6453 8，ATCC64528(sero type A)，RV45981，RV59939，RV60047，RV43185(serotype D)，RV52643，RV54135(seroty pe B)，RV52646，RV45978(serotype D)。泳道M1为核苷酸分子量标记pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ ；泳道M2为核苷酸分子量标记λDNA-HindⅢ
图2 新生隐球菌参考菌株PCR指纹
14株临床分离株进行了PCR指纹分析。9株临床分离株具有相似的PCR指纹而与A血清型参考菌 株指纹相一致，提示为A血清型；3株分离株(D45，D47，Nangjng)较前9株存在较小差异，而 与B、C、D血清型参考株相差显著，考虑为A血清型；另有2株分离株(D56、D57)其PCR指纹比 较独特，而与B参考菌株的指纹比较接近，推测它们的血清型为B。比较5对各自分离自同一 患者的10株新生隐球菌，其中4对分离株具有完全一致的PCR指纹，而另有一对分离株(D45、 D47)在部分条带存在差异，重复实验获得相同的结果，提示它们不是同一菌株，而该两株菌 株是在同一患者的同一份脑脊液中分离获得的(图3)。
泳道1～14依次为新生隐球菌D4 0，D41，D44，2029 ，941329，94131 0，D56，D57，940113，940234，D45，D47，Nanjing，D19。泳道M为核苷酸分子量标记pGEM -3Zf(+)/HaeⅢ和λDNA-HindⅢ
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图3 新生隐球菌临床分离株PCR指纹
三、讨论
PCR指纹技术是随着DNA指纹技术和PCR技术的发展而有机结合的产物。PCR指纹技术克服了传 统DNA指纹技术操作繁琐且费时的缺点，同时由于应用较长引物(15～17bp)，比RAPD方法(使 用的单引物一般为9～10bp)重复性好。我们采用PCR指纹技术对11株不同血清型的 新生隐球菌参考菌株进行了DNA多态性分析，结果在种、血清型以及菌株水平上 呈现特征性的扩增产物。Meyer等[4]观察到B、C血清型间具有 较高的相似率，不易 获得区分，但选用其它引物可获得良好鉴定，且其部分参考菌株血清型尚未完全鉴定。通过 对临床分离株和参考菌株的PCR指纹进行比较分析，可以鉴定不同的临床分离株，可以对先 前用血清学方法不能分型的菌株进行分型。例如，新生隐球菌D19株用血清学方法不能确定 分型，而通过PCR扩增后获得的DNA指纹与A血清型参考菌株相同从而获得鉴定。实验 还发现 一例隐球菌复发病例，其初始分离株D56和复发分离株D57其PCR指纹相同，说明为同一菌株 ，提示隐球菌病的复发是原始菌株的复燃所致，而不是新菌株的感染所为。这与S pitzer等观察到的结果一致[5]。实验还发现从同一患者的 同一份脑脊液标本分离到的两株新生隐球菌其PCR指纹存在差异。推测为两株不同的新生隐 球菌，提示该患者至少存在两株不同的新生隐球菌感染。Haynes等[6]也观察到同样的结果。
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参考文献 1 Bolanos B, Mitchell TG. Killing of Cryptococcus neoformans by rat alveolar macrophages. J Med Vet Mycol, 1989,27∶203-2 17.
2 Small JM, Mitchell TG. Strain variation in antiphagocytic activity of c apsular polysaccharides from Cryptococcus neoformans serotype A. Infect Immun, 1989,57∶3751-3756.
3 Chartier FL, Keer JT, Sutcliffe MJ, et al. Construction of a mouse yeas t artifi cial chromosome library in a recombination-deficient strain of yeast. Nature Ge net, 1992,1∶132.
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4 Meyer W, Mitchell TG, Freedman EZ, et al. Hybridization probes for conv entional DNA fingerprinting used as single primers in the polymerase chain reaction to d istinguish strains of Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol, 1993,31∶2274-2278.
5 Spitzer ED, Spitzer SG. Use of a dispersed repetitive DNA element to di stinguis h clinical isolates of Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol , 1992,30∶1094-1097.
6 Haynes KA, Sullivan DJ, Coleman DC, et al. Involvement of multiple Cryp tococcus neoformans strains in a single episode of cryptococcosis and re infection with novel strains in recurrent infections demonstrated by random ampl ification of polymorphic DNA and DNA fingerprinting. J Clin Microbiol, 1995,33∶ 99-102., 百拇医药
单位：200003 上海，第二军医大学长征医院皮肤科(顾 菊林 廖万清)；复旦大学遗传学研究所(柴建华)
关键词：
中华皮肤科杂志980518 传统的新生隐球菌的分型主要采用依据荚膜抗原决定簇的血清分型方法。 但仅能分成数种血清型，用于菌株间的变异分析显得无能为力。有资料表明相同血清 型的新生隐球菌菌株可呈现明显不同的病理、生理反应[1，2] 。我们采用PCR指纹技术对新生隐球菌不同分离株进行了DNA多态性分析，现将结果报道如下 。
一、材料与方法
(一)菌株：新生隐球菌参考菌株D48、ATCC64538、ATCC64528为A血清型，RV45981、RV59939 、RV60047、RV43185为D血清型，RV52643、RV54135为B血清型，RV52646、RV45978为C血清 型，除D48株为WHO赠送外，其余均为比利时热带病研究所赠送。白念珠菌ATCC76615由美国 辉瑞公司赠送。罗伦特隐球菌CZ18由我科真菌室保藏。14株本科真菌室从1981年至1994年分 离或获赠新生隐球菌临床分离菌株用于本项研究，包括5对各分离自同一例患者的10株分离 株。主要培养来源为脑脊液，个别菌株为血和脑组织。
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(二)方法：
1.真菌DNA的制备：所有真菌DNA制备采用高盐法[3]。
2.PCR指纹分析：微卫星核苷酸序列5′-(GACA)4-3′用作PCR反应的单引物。经PCR条 件的优化，最终采用的扩增反应体系为，引物0.5μmol/L，Mg2.0mmol/L，10mmo l/L Tris HCl，pH9.0，50mmol/L KCl，dNTP每种200μmol/L，DNA聚合酶2.0单位(Gibco BRL)，模板1μl(约10～50ng)，总体积50μl。反应在PT-150 PCR扩增仪(MJ Research)中 进行，采用热启动程序，即在初始96℃ 5分钟变性后，在80℃以上加入DNA聚合酶，加酶后 进行35个循环：92℃变性20秒，42℃退火40秒，72℃延伸1分30秒。最后一轮反应后72℃延 伸10分钟。取15μl扩增产物进行2.0%琼脂糖、1×TAE凝胶电泳，观察结果、照相。
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二、结果
采用微卫星引物5′-(GACA)4-3′所有实验菌株均能得到有效扩增，产生长度范围为0 .5～4.0kb多达16条带的PCR指纹。为了评价PCR指纹反应的稳定性，两株菌株白念珠菌ATC C76615及罗伦特隐球菌CZ18，经6次亚培养获得相同的PCR指纹(图1)。
1：阴性对照；2～5：依次为罗伦特隐球菌CZ 18初始菌株，罗伦特隐球菌 CZ18亚培养菌株，白念珠菌ATCC76615初始菌株，白念珠菌ATCC76615亚培养菌株；M： 核苷酸分子量标记pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ和λDNA-HindⅢ图1 新生隐球菌PCR指纹分析重复性评价
11株不同血清型的新生隐球菌参考菌株在种、血清型和菌株水平上存在变异(图1、2)。白念 珠菌、罗伦特隐球菌和新生隐球菌的PCR指纹存在明显差异。新生隐球菌的不同血清型也表 现出一定程度的血清型间的特异性和血清型内的保守性。另外相同血清型的不同菌株也呈现 不同程度的变异性。
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泳道1～11依次为新生隐球菌D48，ATCC6453 8，ATCC64528(sero type A)，RV45981，RV59939，RV60047，RV43185(serotype D)，RV52643，RV54135(seroty pe B)，RV52646，RV45978(serotype D)。泳道M1为核苷酸分子量标记pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ ；泳道M2为核苷酸分子量标记λDNA-HindⅢ
图2 新生隐球菌参考菌株PCR指纹
14株临床分离株进行了PCR指纹分析。9株临床分离株具有相似的PCR指纹而与A血清型参考菌 株指纹相一致，提示为A血清型；3株分离株(D45，D47，Nangjng)较前9株存在较小差异，而 与B、C、D血清型参考株相差显著，考虑为A血清型；另有2株分离株(D56、D57)其PCR指纹比 较独特，而与B参考菌株的指纹比较接近，推测它们的血清型为B。比较5对各自分离自同一 患者的10株新生隐球菌，其中4对分离株具有完全一致的PCR指纹，而另有一对分离株(D45、 D47)在部分条带存在差异，重复实验获得相同的结果，提示它们不是同一菌株，而该两株菌 株是在同一患者的同一份脑脊液中分离获得的(图3)。
泳道1～14依次为新生隐球菌D4 0，D41，D44，2029 ，941329，94131 0，D56，D57，940113，940234，D45，D47，Nanjing，D19。泳道M为核苷酸分子量标记pGEM -3Zf(+)/HaeⅢ和λDNA-HindⅢ, 百拇医药
图3 新生隐球菌临床分离株PCR指纹
三、讨论
PCR指纹技术是随着DNA指纹技术和PCR技术的发展而有机结合的产物。PCR指纹技术克服了传 统DNA指纹技术操作繁琐且费时的缺点，同时由于应用较长引物(15～17bp)，比RAPD方法(使 用的单引物一般为9～10bp)重复性好。我们采用PCR指纹技术对11株不同血清型的 新生隐球菌参考菌株进行了DNA多态性分析，结果在种、血清型以及菌株水平上 呈现特征性的扩增产物。Meyer等[4]观察到B、C血清型间具有 较高的相似率，不易 获得区分，但选用其它引物可获得良好鉴定，且其部分参考菌株血清型尚未完全鉴定。通过 对临床分离株和参考菌株的PCR指纹进行比较分析，可以鉴定不同的临床分离株，可以对先 前用血清学方法不能分型的菌株进行分型。例如，新生隐球菌D19株用血清学方法不能确定 分型，而通过PCR扩增后获得的DNA指纹与A血清型参考菌株相同从而获得鉴定。实验 还发现 一例隐球菌复发病例，其初始分离株D56和复发分离株D57其PCR指纹相同，说明为同一菌株 ，提示隐球菌病的复发是原始菌株的复燃所致，而不是新菌株的感染所为。这与S pitzer等观察到的结果一致[5]。实验还发现从同一患者的 同一份脑脊液标本分离到的两株新生隐球菌其PCR指纹存在差异。推测为两株不同的新生隐 球菌，提示该患者至少存在两株不同的新生隐球菌感染。Haynes等[6]也观察到同样的结果。
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参考文献 1 Bolanos B, Mitchell TG. Killing of Cryptococcus neoformans by rat alveolar macrophages. J Med Vet Mycol, 1989,27∶203-2 17.
2 Small JM, Mitchell TG. Strain variation in antiphagocytic activity of c apsular polysaccharides from Cryptococcus neoformans serotype A. Infect Immun, 1989,57∶3751-3756.
3 Chartier FL, Keer JT, Sutcliffe MJ, et al. Construction of a mouse yeas t artifi cial chromosome library in a recombination-deficient strain of yeast. Nature Ge net, 1992,1∶132.
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4 Meyer W, Mitchell TG, Freedman EZ, et al. Hybridization probes for conv entional DNA fingerprinting used as single primers in the polymerase chain reaction to d istinguish strains of Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol, 1993,31∶2274-2278.
5 Spitzer ED, Spitzer SG. Use of a dispersed repetitive DNA element to di stinguis h clinical isolates of Cryptococcus neoformans. J Clin Microbiol , 1992,30∶1094-1097.
6 Haynes KA, Sullivan DJ, Coleman DC, et al. Involvement of multiple Cryp tococcus neoformans strains in a single episode of cryptococcosis and re infection with novel strains in recurrent infections demonstrated by random ampl ification of polymorphic DNA and DNA fingerprinting. J Clin Microbiol, 1995,33∶ 99-102., 百拇医药