阴道念珠菌菌株的分型和相似性分析
作者：秦振宇 姚聪君 谭升顺 吴绍熙
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所[秦振宇 吴 绍熙(指导者)]；西安医科大学第二临床医学院[姚聪君 谭升顺(指导者)]
关键词：念珠菌；生化反应；染色
中华皮肤科杂志980506 【摘要】 目的 探讨阴道念珠菌病发病与念珠菌菌 株的关系。方法 选择两组白念珠菌，A组来源于健康妇女阴道分 泌物，B组来源于阴道念珠菌病患者。选用自动微生物诊断鉴别系统和氨基黑染色法两种表 型识别技术检测受检菌株生化反应及蛋白酶分泌参数，进而用数值分类技术行相似性分析。结果 A、B两组间福寿草醇存在显著性差异(P< 0.0 5)，也进一步证实蛋白酶的分泌能力在两组间存在显著性差异(P<0.01) 。56株白念珠菌共产生41型，可大致分为7类，c、f和g类以B组分离株为主，b和d类以A组分 离株为主。结论 福寿草醇和蛋白酶的升高可能与阴道念珠菌病 发病相关。数值分类技术在菌株相似性分析时，有其优越性，有待进一步总结。
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Classification and Analogous Analysis of Candida Strains Isolate d from Vulvovaginal Candidiasis Qin Zhenyu, Yao Congjun, Tan Shen gshu n, et al. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To study the correlation between Candid a strains and vulvovaginal candidiasis. Methods Two groups of Candida albicans strains were chosen. Strains of group A and gro up B were isolated from vaginal discharge of normal women and of patients with c an didal vaginitis respectively. The two methods, AMS (automated microbiological de t ection and identification system) and amino black stain, were applied to detect two phenotypic parameters, biochemical reaction of the strains and secretory cap acity of the proteinases respectively, and analogous analysis was performed then . Results There was a significant difference in the levels of a donitol (P<0.05) between group A and B, and further study proved that the difference in the secretory capacity of proteinase was significant between t hem ([ WTBX〗P<0.01). By using the method of analogous analysis, 56 strains o f Candida albicans were classified into 41 types, and could be approximately divided into 7 sub-groups. The strains in the s ub-group c, f and g were mainly in group B and the su b-group b and d mainly in group A. Conclusion Increase in the levels of adonitol and proteinase may be related to the development of vulvovaginal candidiasis. At the same time, the a dv antage of using numerical taxonmic technique in stratin analysis is discussed.
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【Key words】 Candida Biochemical reaction Staining
目前，对阴道念珠菌病研究主要集中于患者因素，对菌株因素的研究报道较 为少见。菌株间表型或基因型的差异也可能产生不同的致病性。为此，我们应用自动微生物 诊断鉴别系统(AMS)、氨基黑染色法两种技术检测了阴道念珠菌病患者和正常人阴道分离白 念珠菌的碳源同化及蛋白酶分泌，对此问题做了一些探讨。
材料和方法
一、菌株来源、鉴定及保存
菌株分为A和B两组，A组菌株来源于205例健康妇女阴道分泌物，阳性22例(10.7%)，编号1 ～22；B 组菌株来源于33例阴道念珠菌病患者，阳性33例(100%)，编号24～56。取材时，分 别 以无菌生理盐水棉签擦拭被检者阴道后，接种于含氯霉素(50μg/ml)的葡萄糖蛋白胨琼脂培 养基表面，置30℃恒温培养3天后观察结果，若无生长可观察最长至两周。标准菌株白念珠 菌ATCC 10231(西安医科大学第二临床医学院细菌室提供)，编号23。菌落分纯2次，经常规 方法鉴定为白念珠菌后，蒸馏水中保存于-20℃备用。白念珠菌的常规鉴定包括沙堡培养基( SDA)上的典型菌落颜色和形态；玉米粉琼脂培养基上长出的顶端圆形厚壁孢子；人血清芽管 形成实验阳性。同时参考酵母生化卡 (YBC, BioMerieux Vitek, Inc, USA)中半乳糖、乳糖 、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖同化反应结果。
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二、AMS检测白念珠菌对26种碳源的同化能力[1]
1.碳源同化反应：YBC含有30个反应池，其中 26个为同化反应池，4个为对照池。用于同化试验的26种碳源包括半乳糖、蔗糖、麦芽糖、 卟拉醇(palations)、葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、落叶糖、卫矛醇、红鲜醇、木质糖、闵蜜 糖、植物蜜糖、乙酰氨基葡萄糖、肌醇、尿素、纤维双糖、甲基葡萄糖、木质醇、甘油、山 梨醇、木蜜二糖、环已胺、硝酸盐、酮基葡萄糖和福寿草醇。
2.菌株接种量：菌株在SDA上培养48小时(30℃)后，选取4个直径在3mm左右的菌落，用1.8m l 0.5%的盐水稀释，再用电子比浊器(BioMerieux Vitek, Inc, USA)调整其浓度为2个麦氏 单位。然后用吸管将菌液种入YBC中。
3.同化反应终值判定：在30℃恒温箱中培养48小时，放入AMS读数器(BioMerieux Vitek, In c, USA)中，读数器按光学扫描原理，测定同化反应池中指示剂的显色及浊度，并通过计算 机与预定的阈值相比较，高于阈值为阳性。
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三、氨基黑染色法检测白念珠菌蛋白酶分泌[2]
1.接种：菌株在SDA上培养24小时，然后以无菌生理盐水制成菌悬液，通过电子比浊器调整 其浓度在2个麦氏单位。在牛血清白蛋白(BAS)培养基(葡萄糖2%，酵母提取物0.01%，BAS 0 .20%，琼脂2%)上，滴入10μl菌悬液。平皿在37℃培养48小时。
2.染色：将氨基黑染色液(氨基黑1g；醋酸盐缓冲液900ml)轻轻倒入BAS培养基中，染色24小 时后，弃去氨基黑染色液，并倒入染色洗涤液(蒸馏水830ml，醋酸20ml，甘油150ml)，每20 分钟换一次，直到不含蛋白质部分的琼脂褪色为止。
3.结果判定：从培养基底部进行观察，按Ruchel的方法对蛋白酶活力进行分级[ 即，-或±：在菌落上无或极模糊地看见蛋白溶解；+：可明显地看到蛋白 溶解(1～2mm)；++：蛋白溶解已超过菌落的边缘(3～5mm)]。
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四、统计学处理
对碳源同化结果进行Fisher精确检验，蛋白酶分泌试验结果进行χ2检 验，以比较A组和B组的统计学差异。统计分析采用SAS软件Version 6.04(SAS Institute, Inc, USA)。根据碳源同化结果和蛋白酶分泌试验结果对菌株间相似性的分析，由我们所编 制的相应程序完成[3]，并绘制树状图。
结 果
一、A、B两组间阴道分离白念珠菌碳源同化的比较
半乳糖、蔗糖、麦芽糖、卟拉醇和葡萄糖A、B两组碳源同化反应均为阳性。乳糖、阿拉伯糖 、落叶糖、卫矛醇、红鲜醇、肌醇和尿素A、B两组碳源同化反应均为阴性。纤维双糖A组阳 性0例， B组阳性6例；甲基葡萄糖A组阳性22例，B组阳性28例；木质糖A组阳性20例，B组阳性24例； 植物蜜糖A组阳性3例，B组阳性6例；闵蜜糖A组阳性17例，B组阳性24例；乙酰氨基葡萄糖A 组阳性22例，B组阳性31例；木质醇A组阳性20例，B组阳性28例；甘油A组阳性20例，B组阳 性30例；山梨醇A组阳性19例，B组阳性29例；木蜜二糖A组阳性3例，B组阳性8例；环已胺A 组阳性19例，B组阳性31例；硝酸盐A组阳性4例，B组阳性3例；酮基葡萄糖A组阳性22例，B 组阳性32例。这些碳源A、B两组间均无显著性差异(P>0.05)。福寿草醇A 组阳性7例，B组阳性29例，A、B两组间存在显著性差异(P<0.05)。
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二、A、B两组间阴道分离白念珠菌分泌蛋白酶能力的比较
-或±级中A组10例，B组2例；+级中A组11例，B组12例；级中A组1例，B组19例。A、B两 组间存在显著性差异(χ2=20.184，P<0.01)。
三、A、B两组间阴道分离白念珠菌菌株间相似性分析
由附图可见，56株白念珠菌共产生41型，可大致分为7类，第c、f和g类以B组分离株为主， 第b和d类以A组分离株为主。
*图左侧字母a～g为菌株分类，1～56为分离菌株 编号
附图 56株白念珠菌菌株的树状图
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讨 论
阴道念珠菌病是一种常见的阴道炎症。据统计，主诉白带增多的非孕妇女中 约10%及孕妇中1/3的阴道中有此菌寄生。本病多见于孕妇、糖尿病患者及接受大量雌激素治 疗者。如长期应用抗生素，亦易使念珠菌得以繁殖而引起感染。近来研究发现表型或基因型 不同的菌株产生的致病性也存在差异。
碳源同化试验实质是反映酵母菌株分解和利用相应碳水化合物的能力，其原理在于酵母菌含 有特异的酶系统，提供其利用碳水化合物作为培养基内碳的唯一生长来源，同时分解该碳水 化合物使培养基内所含指示剂变色。Boerlin等[4]发现HIV阳性患 者分离的白念珠菌被明显的分为两组：一组具有非典型的糖同化试验结果，分离自无症状的 HIV阳性吸毒者的口腔，毒力较弱；另一组缺乏β-葡萄糖酶活性，来自HIV阳性的念珠菌性 食管炎和HIV阴性的侵袭性念珠菌病患者，毒力较强。AMS本身是酵母快速生化鉴定系统的一 种，能自动的对结果进行读数和解释，鉴于其能在相同碳源量、相同接种量、相同终值判别 标准下分析的特点，我们将其引入白念珠菌的分型中。AMS技术具有重复性好，易于标准化 等优点。研究发现，福寿草醇在正常组与疾病组间有差异。此外，我们证实蛋白酶分泌能力 两组间存在差异，这与国外研究一致，进一步证实蛋白酶中存在致病成分，如分泌型天冬氨 酸蛋白酶。
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菌株数值分类是从统计学角度对大量观察数据进行分析，使得观察数据中所包含的信息得以 尽可能多地释放出来，对于资料的再利用是很有意义的。数值分类技术被认为是临床微生物 学研究从定性走向定量的锐器。本研究中，56株白念珠菌共产生41型，可大致分为7类，一 部分以疾病组分离株为主，另一部分以正常人分离株为主。从理论上，利用AMS技术对白念 珠菌分型，可有226型，利用蛋白酶分泌差异，可有32型，两者结合可有2 26×32型。
志谢 西安医科大学第二临床学院陈庭梅技师和王冬云医师协助
本实验在西安医科大学第二临床医学院完成
参考文献 1 秦振宇, 谭升顺, 陈庭梅, 等. 18株白念珠菌26种生化反应变异 的研究. 中国皮肤性病学杂志, 1997,11∶133-134.
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2 Cassone A, De Bernardis F, Mondello F, et al. Evidence for a correlatio n betwee n proteinase secretion and vulvovaginal candidiasis. J Infect Dis, 1987,156∶777 -784.
3 秦振宇, 谭升顺, 党少农, 等. 菌株数值分类程序设计及其在白念珠菌菌株相似 性分析中的初步应用. 中国皮肤性病学杂志, 1997,11∶270-271.
4 Boerlin P, Boerlin-Petzold F, Durussel C, et al. Cluster of oral atypi cal Candida albicans isolates in a group of human immunodeficiency virus -positive drug users. J Clin Microbiol, 1995,33∶1129-1135., 百拇医药
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所[秦振宇 吴 绍熙(指导者)]；西安医科大学第二临床医学院[姚聪君 谭升顺(指导者)]
关键词：念珠菌；生化反应；染色
中华皮肤科杂志980506 【摘要】 目的 探讨阴道念珠菌病发病与念珠菌菌 株的关系。方法 选择两组白念珠菌，A组来源于健康妇女阴道分 泌物，B组来源于阴道念珠菌病患者。选用自动微生物诊断鉴别系统和氨基黑染色法两种表 型识别技术检测受检菌株生化反应及蛋白酶分泌参数，进而用数值分类技术行相似性分析。结果 A、B两组间福寿草醇存在显著性差异(P< 0.0 5)，也进一步证实蛋白酶的分泌能力在两组间存在显著性差异(P<0.01) 。56株白念珠菌共产生41型，可大致分为7类，c、f和g类以B组分离株为主，b和d类以A组分 离株为主。结论 福寿草醇和蛋白酶的升高可能与阴道念珠菌病 发病相关。数值分类技术在菌株相似性分析时，有其优越性，有待进一步总结。
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Classification and Analogous Analysis of Candida Strains Isolate d from Vulvovaginal Candidiasis Qin Zhenyu, Yao Congjun, Tan Shen gshu n, et al. Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To study the correlation between Candid a strains and vulvovaginal candidiasis. Methods Two groups of Candida albicans strains were chosen. Strains of group A and gro up B were isolated from vaginal discharge of normal women and of patients with c an didal vaginitis respectively. The two methods, AMS (automated microbiological de t ection and identification system) and amino black stain, were applied to detect two phenotypic parameters, biochemical reaction of the strains and secretory cap acity of the proteinases respectively, and analogous analysis was performed then . Results There was a significant difference in the levels of a donitol (P<0.05) between group A and B, and further study proved that the difference in the secretory capacity of proteinase was significant between t hem ([ WTBX〗P<0.01). By using the method of analogous analysis, 56 strains o f Candida albicans were classified into 41 types, and could be approximately divided into 7 sub-groups. The strains in the s ub-group c, f and g were mainly in group B and the su b-group b and d mainly in group A. Conclusion Increase in the levels of adonitol and proteinase may be related to the development of vulvovaginal candidiasis. At the same time, the a dv antage of using numerical taxonmic technique in stratin analysis is discussed.
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【Key words】 Candida Biochemical reaction Staining
目前，对阴道念珠菌病研究主要集中于患者因素，对菌株因素的研究报道较 为少见。菌株间表型或基因型的差异也可能产生不同的致病性。为此，我们应用自动微生物 诊断鉴别系统(AMS)、氨基黑染色法两种技术检测了阴道念珠菌病患者和正常人阴道分离白 念珠菌的碳源同化及蛋白酶分泌，对此问题做了一些探讨。
材料和方法
一、菌株来源、鉴定及保存
菌株分为A和B两组，A组菌株来源于205例健康妇女阴道分泌物，阳性22例(10.7%)，编号1 ～22；B 组菌株来源于33例阴道念珠菌病患者，阳性33例(100%)，编号24～56。取材时，分 别 以无菌生理盐水棉签擦拭被检者阴道后，接种于含氯霉素(50μg/ml)的葡萄糖蛋白胨琼脂培 养基表面，置30℃恒温培养3天后观察结果，若无生长可观察最长至两周。标准菌株白念珠 菌ATCC 10231(西安医科大学第二临床医学院细菌室提供)，编号23。菌落分纯2次，经常规 方法鉴定为白念珠菌后，蒸馏水中保存于-20℃备用。白念珠菌的常规鉴定包括沙堡培养基( SDA)上的典型菌落颜色和形态；玉米粉琼脂培养基上长出的顶端圆形厚壁孢子；人血清芽管 形成实验阳性。同时参考酵母生化卡 (YBC, BioMerieux Vitek, Inc, USA)中半乳糖、乳糖 、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖同化反应结果。
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二、AMS检测白念珠菌对26种碳源的同化能力[1]
1.碳源同化反应：YBC含有30个反应池，其中 26个为同化反应池，4个为对照池。用于同化试验的26种碳源包括半乳糖、蔗糖、麦芽糖、 卟拉醇(palations)、葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、落叶糖、卫矛醇、红鲜醇、木质糖、闵蜜 糖、植物蜜糖、乙酰氨基葡萄糖、肌醇、尿素、纤维双糖、甲基葡萄糖、木质醇、甘油、山 梨醇、木蜜二糖、环已胺、硝酸盐、酮基葡萄糖和福寿草醇。
2.菌株接种量：菌株在SDA上培养48小时(30℃)后，选取4个直径在3mm左右的菌落，用1.8m l 0.5%的盐水稀释，再用电子比浊器(BioMerieux Vitek, Inc, USA)调整其浓度为2个麦氏 单位。然后用吸管将菌液种入YBC中。
3.同化反应终值判定：在30℃恒温箱中培养48小时，放入AMS读数器(BioMerieux Vitek, In c, USA)中，读数器按光学扫描原理，测定同化反应池中指示剂的显色及浊度，并通过计算 机与预定的阈值相比较，高于阈值为阳性。
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三、氨基黑染色法检测白念珠菌蛋白酶分泌[2]
1.接种：菌株在SDA上培养24小时，然后以无菌生理盐水制成菌悬液，通过电子比浊器调整 其浓度在2个麦氏单位。在牛血清白蛋白(BAS)培养基(葡萄糖2%，酵母提取物0.01%，BAS 0 .20%，琼脂2%)上，滴入10μl菌悬液。平皿在37℃培养48小时。
2.染色：将氨基黑染色液(氨基黑1g；醋酸盐缓冲液900ml)轻轻倒入BAS培养基中，染色24小 时后，弃去氨基黑染色液，并倒入染色洗涤液(蒸馏水830ml，醋酸20ml，甘油150ml)，每20 分钟换一次，直到不含蛋白质部分的琼脂褪色为止。
3.结果判定：从培养基底部进行观察，按Ruchel的方法对蛋白酶活力进行分级[ 即，-或±：在菌落上无或极模糊地看见蛋白溶解；+：可明显地看到蛋白 溶解(1～2mm)；++：蛋白溶解已超过菌落的边缘(3～5mm)]。
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四、统计学处理
对碳源同化结果进行Fisher精确检验，蛋白酶分泌试验结果进行χ2检 验，以比较A组和B组的统计学差异。统计分析采用SAS软件Version 6.04(SAS Institute, Inc, USA)。根据碳源同化结果和蛋白酶分泌试验结果对菌株间相似性的分析，由我们所编 制的相应程序完成[3]，并绘制树状图。
结 果
一、A、B两组间阴道分离白念珠菌碳源同化的比较
半乳糖、蔗糖、麦芽糖、卟拉醇和葡萄糖A、B两组碳源同化反应均为阳性。乳糖、阿拉伯糖 、落叶糖、卫矛醇、红鲜醇、肌醇和尿素A、B两组碳源同化反应均为阴性。纤维双糖A组阳 性0例， B组阳性6例；甲基葡萄糖A组阳性22例，B组阳性28例；木质糖A组阳性20例，B组阳性24例； 植物蜜糖A组阳性3例，B组阳性6例；闵蜜糖A组阳性17例，B组阳性24例；乙酰氨基葡萄糖A 组阳性22例，B组阳性31例；木质醇A组阳性20例，B组阳性28例；甘油A组阳性20例，B组阳 性30例；山梨醇A组阳性19例，B组阳性29例；木蜜二糖A组阳性3例，B组阳性8例；环已胺A 组阳性19例，B组阳性31例；硝酸盐A组阳性4例，B组阳性3例；酮基葡萄糖A组阳性22例，B 组阳性32例。这些碳源A、B两组间均无显著性差异(P>0.05)。福寿草醇A 组阳性7例，B组阳性29例，A、B两组间存在显著性差异(P<0.05)。
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二、A、B两组间阴道分离白念珠菌分泌蛋白酶能力的比较
-或±级中A组10例，B组2例；+级中A组11例，B组12例；级中A组1例，B组19例。A、B两 组间存在显著性差异(χ2=20.184，P<0.01)。
三、A、B两组间阴道分离白念珠菌菌株间相似性分析
由附图可见，56株白念珠菌共产生41型，可大致分为7类，第c、f和g类以B组分离株为主， 第b和d类以A组分离株为主。
*图左侧字母a～g为菌株分类，1～56为分离菌株 编号
附图 56株白念珠菌菌株的树状图
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阴道念珠菌病是一种常见的阴道炎症。据统计，主诉白带增多的非孕妇女中 约10%及孕妇中1/3的阴道中有此菌寄生。本病多见于孕妇、糖尿病患者及接受大量雌激素治 疗者。如长期应用抗生素，亦易使念珠菌得以繁殖而引起感染。近来研究发现表型或基因型 不同的菌株产生的致病性也存在差异。
碳源同化试验实质是反映酵母菌株分解和利用相应碳水化合物的能力，其原理在于酵母菌含 有特异的酶系统，提供其利用碳水化合物作为培养基内碳的唯一生长来源，同时分解该碳水 化合物使培养基内所含指示剂变色。Boerlin等[4]发现HIV阳性患 者分离的白念珠菌被明显的分为两组：一组具有非典型的糖同化试验结果，分离自无症状的 HIV阳性吸毒者的口腔，毒力较弱；另一组缺乏β-葡萄糖酶活性，来自HIV阳性的念珠菌性 食管炎和HIV阴性的侵袭性念珠菌病患者，毒力较强。AMS本身是酵母快速生化鉴定系统的一 种，能自动的对结果进行读数和解释，鉴于其能在相同碳源量、相同接种量、相同终值判别 标准下分析的特点，我们将其引入白念珠菌的分型中。AMS技术具有重复性好，易于标准化 等优点。研究发现，福寿草醇在正常组与疾病组间有差异。此外，我们证实蛋白酶分泌能力 两组间存在差异，这与国外研究一致，进一步证实蛋白酶中存在致病成分，如分泌型天冬氨 酸蛋白酶。
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菌株数值分类是从统计学角度对大量观察数据进行分析，使得观察数据中所包含的信息得以 尽可能多地释放出来，对于资料的再利用是很有意义的。数值分类技术被认为是临床微生物 学研究从定性走向定量的锐器。本研究中，56株白念珠菌共产生41型，可大致分为7类，一 部分以疾病组分离株为主，另一部分以正常人分离株为主。从理论上，利用AMS技术对白念 珠菌分型，可有226型，利用蛋白酶分泌差异，可有32型，两者结合可有2 26×32型。
志谢 西安医科大学第二临床学院陈庭梅技师和王冬云医师协助
本实验在西安医科大学第二临床医学院完成
参考文献 1 秦振宇, 谭升顺, 陈庭梅, 等. 18株白念珠菌26种生化反应变异 的研究. 中国皮肤性病学杂志, 1997,11∶133-134.
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3 秦振宇, 谭升顺, 党少农, 等. 菌株数值分类程序设计及其在白念珠菌菌株相似 性分析中的初步应用. 中国皮肤性病学杂志, 1997,11∶270-271.
4 Boerlin P, Boerlin-Petzold F, Durussel C, et al. Cluster of oral atypi cal Candida albicans isolates in a group of human immunodeficiency virus -positive drug users. J Clin Microbiol, 1995,33∶1129-1135., 百拇医药