287株致病性着色霉菌实验室观察与分析
作者：戴文丽 陈瑞娥 任忠芬 万俊增
单位：250021济南，山东省立医院皮肤科
关键词：着色霉菌病；培养；显微镜；电子
中华皮肤科杂志980503 【摘要】 目的 研究山东省章丘县及其周围地区着色霉菌病的菌种组成。方法 采用葡萄糖蛋白胨琼脂培养基进行试管法培养，将培养阳性菌落分别进行葡萄糖蛋白胨琼脂、葡萄糖玉米粉琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂钢圈小培养，观察其分生孢子梗形态；应用扫描电镜观察了卡氏枝孢霉的产孢方式。结果 共鉴定出283株卡氏枝孢霉、2株裴氏着色霉、1株疣状瓶霉及1株未定瓶霉。结论 山东省章丘县及其周围地区着色霉菌病的致病菌种以卡氏枝孢霉为主。这一结果进一步证实我国北方该病致病菌种主要为卡氏枝孢霉。
Laboratory Observation and Analysis of 287 Strains of Fu ngi in Patients with Chromoblastomycosis Dai Wenli, Chen Ruie, Ren Zhongfen, et al. Department of Dermatology, Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021
, 百拇医药
【Abstract】 Objective Two hundred and eighty seven strains o f fungi isolated from the cutaneous lesions in patients with chromoblastomycosis from Zhang Qiu county and its surrounding region were observed and analyse d. Methods The fungi were cultured and the morphologic characte rs of colonies were observed under scanning electron microscope. Resu lts Th ere were 283 strains of C.carrionii, 2 strains of F.pedr osoi, 1 strain of P.verru cosa and 1 strain of undeterminate phialophora sp.were identificated.Conclusion The predominant pathogenic fungi isolated from patient s with chromoblastomycosis in Zhang Qiu county and its surrounding region were C.carrionii which confirms that the pathogenic fungi in nothern China is C.carrionii.
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【Key words】 Chromomycosis Culture Microscope, electron
致病性着色霉菌为暗色孢科真菌(Dematiaceousfungi)，种类繁多，形态各异，鉴定和鉴别均有一定困难。在人工培养时无论培养基种类更换或多次多代培养其菌落呈暗黑色特性不变，故称此类真菌为黑色真菌[1]。它引起的疾病统称为着色霉菌病。现将我科所分离的287株着色芽生菌病的致病菌实验室观察结果报道如下。
资料和方法
(一)菌株来源：所有菌株均从着色芽生菌病患者病损处分离而得。经鉴定为卡氏枝孢霉283株，裴氏着色霉2株，疣状瓶霉1株，未定种瓶霉1株。
(二)培养基：葡萄糖蛋白胨琼脂(SDA)、1%葡萄糖玉米粉琼脂(CMA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，明胶培养基。
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(三)培养方法：
1.试管培养：将所取标本接种于SDA、PDA培养基，分别置26℃和37℃培养箱内，进行初代培养，观察4周。
2.平皿培养：将试管培养3周之菌落再转种SDA平皿中心处，分别置26℃和37℃培养箱培养。
3.明胶液化试验，将菌落接种于明胶培养基，按该试验方法观察并用标准菌株做对照。
4.钢圈小培养：将菌落接种于钢圈内，显微镜下观察其生长形态，每周观察记录，共4周。
(四)扫描电镜观察：将4株卡氏枝孢霉成熟菌落制成标本，进行电镜观察，并拍照。
结 果
一、培养皿培养观察结果
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卡氏枝孢霉在26℃培养下，菌落在1周左右开始生长，但较缓慢。第1周，菌落中央有灰褐色颗粒状高起，周围圈线状凹陷，再向外平坦生长。第2～4周，菌落面积逐渐长大，中心部呈乳头状隆起，有的在乳头状突起的中心点又有一小颗粒状隆起，其四周凹陷。整个乳头状隆起的周围又有一线环凹，其外稍隆起或平坦。菌落表面披盖的菌丝，有的疏松如天鹅绒状，有的呈细沙样平绒状。其色泽往往是中心部较深，呈深褐色、深棕色或深灰至灰黑色；外周颜色深浅相间，形成环状外观。少数菌落中央较隆起，从中心斜向四周生长，或有少许沟纹、皱褶，整个菌落面积较小，稍隆起。所有菌落的外周，均有一鲜明的墨黑线环，无明显下沉，背面为墨黑色。菌落生长速度在第1～4周直径分别为0.5、1.2、1.7、2.0cm。
在37℃(SDA)培养下，菌落均较小、较紧，表面平绒状，气生菌丝一般为黑灰色或黑棕色，菌落生长速度在第1～4周直径分别为0.2、0.4、0.5、0.6cm。
裴氏着色霉与疣状瓶霉，在37℃亦较26℃时生长较慢。因菌株太少，未记录其平均生长速度。菌落外观形态与卡氏枝孢霉无明显特征性区别。
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三、微量培养光学显微镜观察
所有菌株在接种后4～5天开始生长，在3种培养基上生长情况大致相同，但在PDA及CMA上，产孢和分生孢子梗较SDA为好，培养2～3周后均见典型的分生孢子梗。卡氏枝孢霉分生孢子梗直立，由菌丝顶端或侧端垂直或不垂直长出，枝链长短不一，一般较长，伸展，呈树枝状。孢子椭圆呈链状排列，大小不一致，早期较圆，2～3周后一般皆为椭圆形。分生孢子壁光滑、淡棕色，平均长4.8μm、宽2.8μm。卡氏枝孢霉仅见枝孢型分生孢子梗，观察4周未见瓶型及喙枝孢型分生孢子梗。孢子连接处均可见一亮点。
裴氏着色霉除枝孢型分生孢子梗外，还有喙枝孢型(rhinocladiella type)，亦称剑顶型和瓶型(phialide type)分生孢子梗。但后二者中以前者多见，其特点是侧生于菌丝两侧或其顶端，形成不规则的膨大和突起。孢子连接处可见一亮点。
疣状瓶霉分生孢子梗只是瓶状，生于菌丝末端或侧面，基底及腹部较宽大，到顶端变窄，呈领口状杯口，可见许多分生孢子聚集于瓶口及周围。在PDA及CMA上，上述形态较SDA为好，观察4周无其它分生孢子梗生长。1株未定种的瓶霉，其形态学均不同于所见到的瓶霉，故未定种。
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四、电镜观察
在扫描电镜下观察到4株卡氏枝孢霉单个菌丝发育形成了分生孢子梗，其顶端膨大，逐渐长大变为椭圆形，形成孢子。在此孢子顶端再出芽形成二级孢子，二级孢子上再发芽，再形成孢子，为向顶性产孢方式继续产孢，形成树枝状分枝，呈长链状。孢子脱落后端部可见环痕。
讨 论
皮肤着色霉菌病病原菌一般最适合的生长温度为12℃～25℃，在37℃生长不佳，39℃以上不生长。国内外报道均以裴氏着色霉最为多见，广州地区报道的不足40例中有33例分离出裴氏着色霉[2]。文献报道，裴氏着色霉喜潮湿，多分布在年降雨量2000～3000mm的热带和亚热带地区。本文287株菌中只分离出2株裴氏着色霉，绝大多数为卡氏枝孢霉，患者多来自山东章丘县及其周围。章丘县位于山东中部，其年平均气温12.9℃，年平均雨量627.9mm，一般在500～700mm。山区占30.7%，丘陵占25.9%，平原占30.7%，洼地占12.7%。卡氏枝孢霉喜生长在雨量少(年平均雨量500～600mm)、沙地的条件下。故本文中卡氏枝孢霉占绝大多数，是否与章丘地区的自然环境有关，值得探讨。据国内文献记载，北方着色霉菌病病原菌以卡氏枝孢霉为多，而我国南方尤其两广、福建一带以裴氏着色霉为多[3]，我们认为这与菌的习性和南、北方自然环境的不同有关。
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以上菌株仅从菌落外观上鉴别很困难。目前对皮肤着色霉菌的鉴定在我国主要还是依据微量培养光学显微镜下形态学来进行区别。裴氏着色霉有3种类型的分生孢子梗即枝孢型、喙枝孢型和瓶型[4]。在我们的2株裴氏着色霉中，三种类型的分生孢子梗均可见到，每一株菌同时具有两种类型分生孢子梗方确定为裴氏着色霉。卡氏枝孢霉只有树枝型分生孢子梗，我们所有的菌株经4周观察，均未发现其它型分生孢子梗。疣状瓶霉只有一种瓶型分生孢子梗，其特点是分生孢子梗基底较宽大，瓶口较大，瓶颈明显，分生孢子圆形，聚集在瓶口，形成球形且不易散开的孢子团。我们分离出的1株疣状瓶霉具有上述特点。此外，另一株瓶霉其形态与一般常见瓶霉不同，故菌种未能确定。紧密着色霉的特点是可见到枝孢型及瓶型分生孢子梗，无喙枝孢型，分生孢子圆形，于分生孢子梗顶端紧密排列成球状且不易散开，而不呈链状。在我们的菌株中，未分离出该株。本组所有菌株都是从患者病损中分离出的，无疑是致病性着色霉菌，另外明胶液化试验亦证实为致病性着色霉菌。我们认为，对该菌种进行鉴定，形态学观察至关重要，若能使用电镜观察其细微结构及产孢方式，将有助于确切地作出菌种鉴定。
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参考文献 1 Rippon JW. Chromoblastomycosis. In: Medical mycology. Ph iladelphia: Saunders, 1988.276-279.
2黄醒亮,鲁长明.皮肤着色霉菌病36例临床分析.新医学,1987,18∶579-580.
3 Wang DL, Li RY, Dai WL. Dematiaceous fungal infections in China. Curr T op Med Mycol, 1996,6∶291-292.
4 Wang DL, Li RY, Wang WH. Observations of sporulation in Fonseca ea and Phialophora by scanning electron microscopy. Mycopatholog ia, 1987,98∶105-109., 百拇医药
单位：250021济南，山东省立医院皮肤科
关键词：着色霉菌病；培养；显微镜；电子
中华皮肤科杂志980503 【摘要】 目的 研究山东省章丘县及其周围地区着色霉菌病的菌种组成。方法 采用葡萄糖蛋白胨琼脂培养基进行试管法培养，将培养阳性菌落分别进行葡萄糖蛋白胨琼脂、葡萄糖玉米粉琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂钢圈小培养，观察其分生孢子梗形态；应用扫描电镜观察了卡氏枝孢霉的产孢方式。结果 共鉴定出283株卡氏枝孢霉、2株裴氏着色霉、1株疣状瓶霉及1株未定瓶霉。结论 山东省章丘县及其周围地区着色霉菌病的致病菌种以卡氏枝孢霉为主。这一结果进一步证实我国北方该病致病菌种主要为卡氏枝孢霉。
Laboratory Observation and Analysis of 287 Strains of Fu ngi in Patients with Chromoblastomycosis Dai Wenli, Chen Ruie, Ren Zhongfen, et al. Department of Dermatology, Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021
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【Abstract】 Objective Two hundred and eighty seven strains o f fungi isolated from the cutaneous lesions in patients with chromoblastomycosis from Zhang Qiu county and its surrounding region were observed and analyse d. Methods The fungi were cultured and the morphologic characte rs of colonies were observed under scanning electron microscope. Resu lts Th ere were 283 strains of C.carrionii, 2 strains of F.pedr osoi, 1 strain of P.verru cosa and 1 strain of undeterminate phialophora sp.were identificated.Conclusion The predominant pathogenic fungi isolated from patient s with chromoblastomycosis in Zhang Qiu county and its surrounding region were C.carrionii which confirms that the pathogenic fungi in nothern China is C.carrionii.
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【Key words】 Chromomycosis Culture Microscope, electron
致病性着色霉菌为暗色孢科真菌(Dematiaceousfungi)，种类繁多，形态各异，鉴定和鉴别均有一定困难。在人工培养时无论培养基种类更换或多次多代培养其菌落呈暗黑色特性不变，故称此类真菌为黑色真菌[1]。它引起的疾病统称为着色霉菌病。现将我科所分离的287株着色芽生菌病的致病菌实验室观察结果报道如下。
资料和方法
(一)菌株来源：所有菌株均从着色芽生菌病患者病损处分离而得。经鉴定为卡氏枝孢霉283株，裴氏着色霉2株，疣状瓶霉1株，未定种瓶霉1株。
(二)培养基：葡萄糖蛋白胨琼脂(SDA)、1%葡萄糖玉米粉琼脂(CMA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，明胶培养基。
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(三)培养方法：
1.试管培养：将所取标本接种于SDA、PDA培养基，分别置26℃和37℃培养箱内，进行初代培养，观察4周。
2.平皿培养：将试管培养3周之菌落再转种SDA平皿中心处，分别置26℃和37℃培养箱培养。
3.明胶液化试验，将菌落接种于明胶培养基，按该试验方法观察并用标准菌株做对照。
4.钢圈小培养：将菌落接种于钢圈内，显微镜下观察其生长形态，每周观察记录，共4周。
(四)扫描电镜观察：将4株卡氏枝孢霉成熟菌落制成标本，进行电镜观察，并拍照。
结 果
一、培养皿培养观察结果
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卡氏枝孢霉在26℃培养下，菌落在1周左右开始生长，但较缓慢。第1周，菌落中央有灰褐色颗粒状高起，周围圈线状凹陷，再向外平坦生长。第2～4周，菌落面积逐渐长大，中心部呈乳头状隆起，有的在乳头状突起的中心点又有一小颗粒状隆起，其四周凹陷。整个乳头状隆起的周围又有一线环凹，其外稍隆起或平坦。菌落表面披盖的菌丝，有的疏松如天鹅绒状，有的呈细沙样平绒状。其色泽往往是中心部较深，呈深褐色、深棕色或深灰至灰黑色；外周颜色深浅相间，形成环状外观。少数菌落中央较隆起，从中心斜向四周生长，或有少许沟纹、皱褶，整个菌落面积较小，稍隆起。所有菌落的外周，均有一鲜明的墨黑线环，无明显下沉，背面为墨黑色。菌落生长速度在第1～4周直径分别为0.5、1.2、1.7、2.0cm。
在37℃(SDA)培养下，菌落均较小、较紧，表面平绒状，气生菌丝一般为黑灰色或黑棕色，菌落生长速度在第1～4周直径分别为0.2、0.4、0.5、0.6cm。
裴氏着色霉与疣状瓶霉，在37℃亦较26℃时生长较慢。因菌株太少，未记录其平均生长速度。菌落外观形态与卡氏枝孢霉无明显特征性区别。
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三、微量培养光学显微镜观察
所有菌株在接种后4～5天开始生长，在3种培养基上生长情况大致相同，但在PDA及CMA上，产孢和分生孢子梗较SDA为好，培养2～3周后均见典型的分生孢子梗。卡氏枝孢霉分生孢子梗直立，由菌丝顶端或侧端垂直或不垂直长出，枝链长短不一，一般较长，伸展，呈树枝状。孢子椭圆呈链状排列，大小不一致，早期较圆，2～3周后一般皆为椭圆形。分生孢子壁光滑、淡棕色，平均长4.8μm、宽2.8μm。卡氏枝孢霉仅见枝孢型分生孢子梗，观察4周未见瓶型及喙枝孢型分生孢子梗。孢子连接处均可见一亮点。
裴氏着色霉除枝孢型分生孢子梗外，还有喙枝孢型(rhinocladiella type)，亦称剑顶型和瓶型(phialide type)分生孢子梗。但后二者中以前者多见，其特点是侧生于菌丝两侧或其顶端，形成不规则的膨大和突起。孢子连接处可见一亮点。
疣状瓶霉分生孢子梗只是瓶状，生于菌丝末端或侧面，基底及腹部较宽大，到顶端变窄，呈领口状杯口，可见许多分生孢子聚集于瓶口及周围。在PDA及CMA上，上述形态较SDA为好，观察4周无其它分生孢子梗生长。1株未定种的瓶霉，其形态学均不同于所见到的瓶霉，故未定种。
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四、电镜观察
在扫描电镜下观察到4株卡氏枝孢霉单个菌丝发育形成了分生孢子梗，其顶端膨大，逐渐长大变为椭圆形，形成孢子。在此孢子顶端再出芽形成二级孢子，二级孢子上再发芽，再形成孢子，为向顶性产孢方式继续产孢，形成树枝状分枝，呈长链状。孢子脱落后端部可见环痕。
讨 论
皮肤着色霉菌病病原菌一般最适合的生长温度为12℃～25℃，在37℃生长不佳，39℃以上不生长。国内外报道均以裴氏着色霉最为多见，广州地区报道的不足40例中有33例分离出裴氏着色霉[2]。文献报道，裴氏着色霉喜潮湿，多分布在年降雨量2000～3000mm的热带和亚热带地区。本文287株菌中只分离出2株裴氏着色霉，绝大多数为卡氏枝孢霉，患者多来自山东章丘县及其周围。章丘县位于山东中部，其年平均气温12.9℃，年平均雨量627.9mm，一般在500～700mm。山区占30.7%，丘陵占25.9%，平原占30.7%，洼地占12.7%。卡氏枝孢霉喜生长在雨量少(年平均雨量500～600mm)、沙地的条件下。故本文中卡氏枝孢霉占绝大多数，是否与章丘地区的自然环境有关，值得探讨。据国内文献记载，北方着色霉菌病病原菌以卡氏枝孢霉为多，而我国南方尤其两广、福建一带以裴氏着色霉为多[3]，我们认为这与菌的习性和南、北方自然环境的不同有关。
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以上菌株仅从菌落外观上鉴别很困难。目前对皮肤着色霉菌的鉴定在我国主要还是依据微量培养光学显微镜下形态学来进行区别。裴氏着色霉有3种类型的分生孢子梗即枝孢型、喙枝孢型和瓶型[4]。在我们的2株裴氏着色霉中，三种类型的分生孢子梗均可见到，每一株菌同时具有两种类型分生孢子梗方确定为裴氏着色霉。卡氏枝孢霉只有树枝型分生孢子梗，我们所有的菌株经4周观察，均未发现其它型分生孢子梗。疣状瓶霉只有一种瓶型分生孢子梗，其特点是分生孢子梗基底较宽大，瓶口较大，瓶颈明显，分生孢子圆形，聚集在瓶口，形成球形且不易散开的孢子团。我们分离出的1株疣状瓶霉具有上述特点。此外，另一株瓶霉其形态与一般常见瓶霉不同，故菌种未能确定。紧密着色霉的特点是可见到枝孢型及瓶型分生孢子梗，无喙枝孢型，分生孢子圆形，于分生孢子梗顶端紧密排列成球状且不易散开，而不呈链状。在我们的菌株中，未分离出该株。本组所有菌株都是从患者病损中分离出的，无疑是致病性着色霉菌，另外明胶液化试验亦证实为致病性着色霉菌。我们认为，对该菌种进行鉴定，形态学观察至关重要，若能使用电镜观察其细微结构及产孢方式，将有助于确切地作出菌种鉴定。
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参考文献 1 Rippon JW. Chromoblastomycosis. In: Medical mycology. Ph iladelphia: Saunders, 1988.276-279.
2黄醒亮,鲁长明.皮肤着色霉菌病36例临床分析.新医学,1987,18∶579-580.
3 Wang DL, Li RY, Dai WL. Dematiaceous fungal infections in China. Curr T op Med Mycol, 1996,6∶291-292.
4 Wang DL, Li RY, Wang WH. Observations of sporulation in Fonseca ea and Phialophora by scanning electron microscopy. Mycopatholog ia, 1987,98∶105-109., 百拇医药