琼脂柱法测定抗真菌药物对皮肤癣菌的MIC
作者：李少平 刘维达 王红
单位：210042 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤 病研究 所[李少平(杨森培训计划高级进修医师，现在天津长征医院) 刘维达(指导者) 王红]
关键词：
中华皮肤科杂志980528 因抗真菌药物敏感 性测定(MIC)影响因素多而难以标准化，尤其是接种菌的精确定量一直未能解决。最近But ty等 [1]推荐一种琼脂柱法，我们参照此方法并做了改进，获满意的结果， 现报道如下。
一、材料和方法
(一)材料：
1.菌株：20株受试皮肤癣菌菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。其中 有8株红色毛癣菌为临床新分离株。菌株的鉴定主要依据菌落特征及镜下形态学特点。
, http://www.100md.com
2.培养基：沙堡氯霉素琼脂(SDA)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。
3.药物：酮康唑粉由南京第二制药厂提供，批号94037，生产日期1994年4月，含量99.71% 。
4.药敏板：直径2cm的24孔Nanclon细胞培养板(丹麦产)，一次性使用或消毒后重复使用。
(二)方法：
1.挑取纯菌落点种在直径9cm SDA(琼脂含量分别为1%、2%)和PDA平皿的中心，28℃保湿培养 15天。
2.称取6.4mg酮康唑粉，溶于500μl二甲基亚砜中作为母液，然后用去离子水按1∶9比例稀 释，再做10级倍比稀释，分别与一定量不同硬度SDA及PDA培养基在50℃水浴混匀，最终获工 作浓度6.4～0.012μg/ml。
, 百拇医药
3.取不同稀释度含药琼脂(50℃)1ml，分别注入细胞培养板的孔洞中，同时做对照(溶媒及空 白对照)。冷凝后用直径0.6cm打孔器在培养板孔内琼脂中央打孔洞。
4.同上述方法，用同直径的打孔器在长有菌落的琼脂上打孔，位置约在平皿菌落中心至边缘 距离的外1/3处，将覆有菌落的琼脂柱小心置入培养板孔的等径小洞中。
5.接种后的药敏板置28℃培养，于第3天和第7天观察结果。3天后，对照孔接种的琼脂柱边 可见接种菌呈花冠样毛边生长，其它含药孔若呈此种特征判为阳性，否则判为阴性，其开始 孔浓度即为MIC。培养7天后，菌落直径等于或大于0.8cm(即接种菌生长直径)判为阳性，否 则判为阴性。
6.按照Butty等[1]方法将带菌琼脂柱接种在平皿内含药的琼脂 空洞中，空洞距平皿边缘2cm，彼此相距>2cm，余同上。
, 百拇医药
7.将本法所测的MIC与微量稀释法进行比较，探讨琼脂硬度及不同培养基对MIC的影响。
二、结果
1.不同皮肤癣菌在SDA的琼脂柱上于接种后第7天菌落大小明显不同，在本实验中，若菌落直径<1.5cm(如絮状表皮癣菌等)，接种后7天观察结果，其余在3天后观 察(如红色毛癣菌)。
2.改良琼脂柱法结果见图1。A和B为须癣毛癣菌，C和D则为犬小孢子菌，A6、B6、C6 、D6为两菌株的空白对照。药物浓度按A5、C5→B5、D5→A4、C4顺序由0.0 12μg/ml倍比增加。须癣毛癣菌和犬小孢子菌的MIC孔分别为B2和D3，即MIC值为1.6μ g/ml和0.8μg/ml。
, 百拇医药
图1 将接种菌琼脂柱接种在含药24孔Manclon
板上，7天生长情况(改良法)
3.20株皮肤癣菌用两种方法及不同琼脂硬度在体外对酮康唑的敏感性测定结 果见附表。从中可知琼脂柱法测定MIC值一般比微量稀释法高1～2个稀释度；2% SDA MIC值高于1 % SDA。PDA由于在第7天仍无菌落生长而未能记录。
附表 20株皮肤癣菌体外对酮康唑敏感性测定结果(MIC，μg/ml) 菌 种
菌株
方 法
琼脂硬度
琼脂柱法
微量稀释法
, 百拇医药
1% SDA
2% SDA
红色毛癣菌
9
0.128*
0.067*
0.803*
0.108*
许兰氏毛癣菌
1
0.10
0.05
, 百拇医药
0.10
0.02
紫色毛癣菌
1
0.40
0.10
0.20
0.40
断发毛癣菌
1
0.80
0.40
0.40
, http://www.100md.com
0.80
须癣毛癣菌
2
1.60*
0.40*
0.80*
1.60*
铁锈色毛癣菌
1
0.20
0.20
0.20
, http://www.100md.com
0.20
石膏样小孢子菌
2
0.30*
0.20*
0.30*
0.40*
犬小孢子菌
1
0.80
0.20
0.20
, 百拇医药
0.40
奥杜盎小孢子菌
1
0.40
0.20
0.40
0.40
絮状表皮癣菌
1
0.80
0.40
0.80
0.80
, http://www.100md.com
均 值
20
0.553
0.22
0.348
0.531
*为均值
三、讨论
关于丝状真菌的药物敏感性测定，目前常用的方法有琼脂稀释法和液体稀释法，其共同不足 之处 是接种物不易准确定量，分生孢子与菌丝比例不易控制。本文方法的最大优点是在不 改变接种真菌自然生长状态的前题下定量取材，保证菌丝与分生孢子间比例一致，较好地解 决了上述问题。我们对Butty等报道方法[1] 所做的改进是用24 孔培养板(见图1)代替培养皿作为药敏试验载体，将同一药物浓度不同菌种的传统模 式(纸片法)改为同一菌种不同药物浓度模式(类似于微量稀释法)。我们体会有以下好处：① 节省材料；②易于对结果判读；③因暴露面积减少降低了污染的机会；④减少了各菌落间的 交叉污染；⑤皮肤癣菌在较硬的固相状态下生长选用2%的SDA为宜，结果更易观察。
参考文献
1 Butty P, Lebecg T-C, Mallie M, et al. Evaluation of the susceptibility of dermatophytes to antifungal: a new technique. J Med Vet Mycol , 1995,33∶403-409., 百拇医药
单位：210042 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤 病研究 所[李少平(杨森培训计划高级进修医师，现在天津长征医院) 刘维达(指导者) 王红]
关键词：
中华皮肤科杂志980528 因抗真菌药物敏感 性测定(MIC)影响因素多而难以标准化，尤其是接种菌的精确定量一直未能解决。最近But ty等 [1]推荐一种琼脂柱法，我们参照此方法并做了改进，获满意的结果， 现报道如下。
一、材料和方法
(一)材料：
1.菌株：20株受试皮肤癣菌菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供。其中 有8株红色毛癣菌为临床新分离株。菌株的鉴定主要依据菌落特征及镜下形态学特点。
, http://www.100md.com
2.培养基：沙堡氯霉素琼脂(SDA)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。
3.药物：酮康唑粉由南京第二制药厂提供，批号94037，生产日期1994年4月，含量99.71% 。
4.药敏板：直径2cm的24孔Nanclon细胞培养板(丹麦产)，一次性使用或消毒后重复使用。
(二)方法：
1.挑取纯菌落点种在直径9cm SDA(琼脂含量分别为1%、2%)和PDA平皿的中心，28℃保湿培养 15天。
2.称取6.4mg酮康唑粉，溶于500μl二甲基亚砜中作为母液，然后用去离子水按1∶9比例稀 释，再做10级倍比稀释，分别与一定量不同硬度SDA及PDA培养基在50℃水浴混匀，最终获工 作浓度6.4～0.012μg/ml。
, 百拇医药
3.取不同稀释度含药琼脂(50℃)1ml，分别注入细胞培养板的孔洞中，同时做对照(溶媒及空 白对照)。冷凝后用直径0.6cm打孔器在培养板孔内琼脂中央打孔洞。
4.同上述方法，用同直径的打孔器在长有菌落的琼脂上打孔，位置约在平皿菌落中心至边缘 距离的外1/3处，将覆有菌落的琼脂柱小心置入培养板孔的等径小洞中。
5.接种后的药敏板置28℃培养，于第3天和第7天观察结果。3天后，对照孔接种的琼脂柱边 可见接种菌呈花冠样毛边生长，其它含药孔若呈此种特征判为阳性，否则判为阴性，其开始 孔浓度即为MIC。培养7天后，菌落直径等于或大于0.8cm(即接种菌生长直径)判为阳性，否 则判为阴性。
6.按照Butty等[1]方法将带菌琼脂柱接种在平皿内含药的琼脂 空洞中，空洞距平皿边缘2cm，彼此相距>2cm，余同上。
, 百拇医药
7.将本法所测的MIC与微量稀释法进行比较，探讨琼脂硬度及不同培养基对MIC的影响。
二、结果
1.不同皮肤癣菌在SDA的琼脂柱上于接种后第7天菌落大小明显不同，在本实验中，若菌落直径<1.5cm(如絮状表皮癣菌等)，接种后7天观察结果，其余在3天后观 察(如红色毛癣菌)。
2.改良琼脂柱法结果见图1。A和B为须癣毛癣菌，C和D则为犬小孢子菌，A6、B6、C6 、D6为两菌株的空白对照。药物浓度按A5、C5→B5、D5→A4、C4顺序由0.0 12μg/ml倍比增加。须癣毛癣菌和犬小孢子菌的MIC孔分别为B2和D3，即MIC值为1.6μ g/ml和0.8μg/ml。
, 百拇医药
图1 将接种菌琼脂柱接种在含药24孔Manclon
板上，7天生长情况(改良法)
3.20株皮肤癣菌用两种方法及不同琼脂硬度在体外对酮康唑的敏感性测定结 果见附表。从中可知琼脂柱法测定MIC值一般比微量稀释法高1～2个稀释度；2% SDA MIC值高于1 % SDA。PDA由于在第7天仍无菌落生长而未能记录。
附表 20株皮肤癣菌体外对酮康唑敏感性测定结果(MIC，μg/ml) 菌 种
菌株
方 法
琼脂硬度
琼脂柱法
微量稀释法
, 百拇医药
1% SDA
2% SDA
红色毛癣菌
9
0.128*
0.067*
0.803*
0.108*
许兰氏毛癣菌
1
0.10
0.05
, 百拇医药
0.10
0.02
紫色毛癣菌
1
0.40
0.10
0.20
0.40
断发毛癣菌
1
0.80
0.40
0.40
, http://www.100md.com
0.80
须癣毛癣菌
2
1.60*
0.40*
0.80*
1.60*
铁锈色毛癣菌
1
0.20
0.20
0.20
, http://www.100md.com
0.20
石膏样小孢子菌
2
0.30*
0.20*
0.30*
0.40*
犬小孢子菌
1
0.80
0.20
0.20
, 百拇医药
0.40
奥杜盎小孢子菌
1
0.40
0.20
0.40
0.40
絮状表皮癣菌
1
0.80
0.40
0.80
0.80
, http://www.100md.com
均 值
20
0.553
0.22
0.348
0.531
*为均值
三、讨论
关于丝状真菌的药物敏感性测定，目前常用的方法有琼脂稀释法和液体稀释法，其共同不足 之处 是接种物不易准确定量，分生孢子与菌丝比例不易控制。本文方法的最大优点是在不 改变接种真菌自然生长状态的前题下定量取材，保证菌丝与分生孢子间比例一致，较好地解 决了上述问题。我们对Butty等报道方法[1] 所做的改进是用24 孔培养板(见图1)代替培养皿作为药敏试验载体，将同一药物浓度不同菌种的传统模 式(纸片法)改为同一菌种不同药物浓度模式(类似于微量稀释法)。我们体会有以下好处：① 节省材料；②易于对结果判读；③因暴露面积减少降低了污染的机会；④减少了各菌落间的 交叉污染；⑤皮肤癣菌在较硬的固相状态下生长选用2%的SDA为宜，结果更易观察。
参考文献
1 Butty P, Lebecg T-C, Mallie M, et al. Evaluation of the susceptibility of dermatophytes to antifungal: a new technique. J Med Vet Mycol , 1995,33∶403-409., 百拇医药