寻常型银屑病皮损TNFα、核因子κB及诱生型NO合成酶表达
作者：林俊萍 张士发 毕桂娇 张欣 顾绍裘
单位：林俊萍 毕桂娇 张欣 顾绍裘 110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院皮肤科；张士发 沈阳军区总医院皮肤科
关键词：银屑病；诱生型一氧化氮合成酶；NF-κB；肿瘤坏死因子
中华皮肤科杂志990214 【摘 要】 目的 探讨诱生型NO合成酶(iNOS)在银屑病皮损中表达的调节机制。方法 应用免疫组化技术对寻常型银屑病皮损中肿瘤坏死因子(TNFα)、核因子(NF)κB及iNOS表达进行了检测。结果 15例正常人皮肤均不表达NFκB，5例于毛囊、汗腺、皮脂腺或立毛肌处表达TNFα，9例表皮全层较弱且均匀表达iNOS，5例真皮内单一核细胞(MNCs)弱表达iNOS。26例寻常型银屑病皮损表皮角质形成细胞及真皮内MNCs均表达TNFα、NFκB及iNOS，在Munro微脓疡处表达较强。角质形成细胞及真皮内MNCs上TNFα与iNOS表达强度呈显著正相关(rs′分别为0.526和0.665，P分别小于0.01和0.001)，而NFκB与TNFα和iNOS之间无明显相关(P均 >0.05)。结论 TNFα以NFκB非依赖性机制诱导寻常型银屑病皮损表皮角质形成细胞及真皮内MNSs表达iNOS，而在Munro微脓疡处则可能以NFκB依赖性机制诱导中性粒细胞表达iNOS。
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Expression of Tumor Necrosis Factor α, Nuclear Factor κBand
Inducible Nitric Oxide Synthetase in Lesional Skin
of Psoriasis Vulgaris
LIN Junping, ZHANG Shifa, BI Guijiao, et al.
Department of Dermatology, No. 1 Hospital of China Medical University, Shenyang 110001
【Abstract】 Objective To explore the regulatory mechanism of inducible nitric oxide synthetase (iNOS) expression in lesional skin of psoriasis. Methods The expression of tumor necrosis factor α (TNFα), nuclear factor κB (NF κB) and iNOS was detected by immunohistochemical technique. Results Fifteen skin samples of healthy controls did not express NF κB, 5 of them expressed TNFα in hair follicles, sweat glands, sebaceous glands or arrectores pilorum, 9 of them slightly and evenly expressed iNOS in all layers of epidermis, 5 of them also slightly expressed iNOS on mononuclear cells (MNCs) in dermis. The TNFα, NF κB and iNOS were expressed on epidermal keratinocytes and dermal MNCs, and strongly expressed in Munro′s microabscess in lesional skin of 26 cases of psoriasis vulgaris. The intensity of expression of TNFα and iNOS was significantly correlated between keratinocytes and dermal MNCs (rs′were 0.526 and 0.665, respectively, P<0.01 and 0.001, respectively), and the intensity of expression of NF κB was not correlated to TNFα or iNOS between two kinds of cells in psoriasis vulgaris. Conclusion TNFα induces iNOS expression on keratinocytes and MNCs in lesional skin of psoriasis vulgaris through NF κB-independent mechanism, and on neutrophils in Munro′s microabscess through NF κB-dependent mechanism.
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【Key words】 Psoriasis Inducible nitric oxide synthetase NF-kappa B Tumor necrosis factor
一氧化氮(NO)在银屑病皮损中高表达，与银屑病表皮角质形成细胞的增殖、分化和T淋巴细胞功能异常有关[1]。银屑病皮损中诱生型NO合成酶(iNOS)表达与局部NO水平呈显著正相关[2]。为此，我们对寻常型银屑病皮损肿瘤坏死因子(TNF)α、核因子κB(NFκB)及iNOS的表达进行了免疫组化检测。
资料与方法
1.病例： 26例进行期寻常型银屑病患者，男18例，女8例；年龄18～56岁；病程1～8年；皮损范围10%～65%。另取15例正常人皮肤作对照。
2.取材及标本处理：切取典型皮损，OCT包埋，液氮速冻，-80℃冰箱中保存。所有病例均经临床及常规病理确诊。正常人皮肤处理同前。
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3.试剂：SPTM试剂盒由Zymed公司(美国)生产；兔抗人TNFα多抗由Field博士(英国)惠赠，工作浓度为1∶100；兔抗人NFκB及iNOS多抗由Santa Crutz公司(美国)生产，工作浓度均为1∶50。
4.实验步骤：恒冷切片机连续切取6μm厚组织片，丙酮固定。免疫组化染色步骤按SPTM试剂盒说明书。阴性对照以PBS代替1抗，其余步骤同前。
5.观察指标：DAB显色，细胞染成深黄色为(+)，浅棕黄色为(++)，深棕黄色为(+++)。
6.统计方法：相关性检验采用等级相关分析。
结 果
TNFα表达：15例正常人皮肤表皮角质形成细胞未见表达，5例皮肤附属器可见表达，分别见于毛囊(4/8，+～++)、汗腺(5/10，+～+++)、皮脂腺(4/7，+～++)和立毛肌(3/4，+～++)；26例银屑病皮损多有表达(24/26)，其中Munro微脓疡均强表达(12/12，+++)，从基底细胞层向上表达逐渐增强(24/26，+～+++)。真皮内浸润单一核细胞(MNCs)亦多表达(23/26，+～+++)。血管内皮细胞(6/6，+～+++)、毛囊(7/9，+～+++)、皮脂腺(5/8，+～++)、立毛肌(5/5，++～+++)及汗腺(9/10，++～+++)亦有表达。
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NFκB表达：15例正常人皮肤均未见表达；银屑病皮损多有表达(23/26)，其中Munro微脓疡表达较强(12/12，++～+++)，多数病例(23/26)棘细胞层及其以上的角质形成细胞表达NFκB(+～+++)，而基底层细胞均微弱表达。真皮内MNCs亦有表达(22/26，+～++)。血管内皮及皮肤附属器未见表达。
iNOS表达：15例正常人皮肤多有表达(13/15)，其中表皮全层多较弱均匀表达(13/15，+～+++)，真皮内MNCs亦较弱表达(4/15，++)，毛囊(3/3，+)、皮脂腺(4/4，+)及汗腺(10/15，++～+++)亦有表达；26例银屑病皮损均表达iNOS，从基底细胞层至角质层下方表达逐渐增强(26/26，+～+++)，Munro微脓疡表达最强(10/10，++～+++)。真皮内MNCs表达较弱(24/26，+～++)。血管内皮(3/3，+++)、毛囊(4/4，++)、皮脂腺(3/3，+)及汗腺(7/7，+～++)亦有表达。
, 百拇医药 对比观察发现，正常人皮肤TNFα、NFκB及iNOS表达相互间无明显对应关系；银屑病皮损iNOS表达部位与TNFα相似，表达强度强于TNFα。除Munro微脓疡之外，NFκB表达部位及强度与TNFα和iNOS比较，无明显规律。在Munro微脓疡处，TNFα、NFκB及iNOS表达均较强。
2.统计分析：15例正常人皮肤TNFα、NFκB及iNOS表达无明显对应关系，故未做统计分析。银屑病皮损表皮角质形成细胞、真皮内MNCs的TNFα与NFκB表达强度不相关(rs′分别为0.311和0.362，P均>0.05)，NFκB与iNOS亦不相关(rs′分别为0.206和0.212，P均>0.05)，TNFα与iNOS表达强度均呈显著正相关(rs′分别为0.526和0.665，P均<0.01)。
讨 论
有报道正常人皮肤表皮角质形成细胞和毛囊外毛根鞘弱表达iNOS(±～+)[3]。我们的研究结果与此相似，提示由此产生的NO在机体正常防御反应中起重要作用[4]。
, 百拇医药
TNF可通过与其相应受体p55和p75结合而促进NFκB活化，从而诱导一系列细胞因子基因表达，NFκB依赖性机制是诱导iNOS表达的最常见的机制[5]。已知银屑病皮损表达TNFα[1]，我们发现，寻常型银屑病皮损表皮角质形成细胞和真皮内MNCs均不同程度表达TNFα；由于TNFα可诱导培养的角质形成细胞大量表达iNOS[6]，结合本研究结果，寻常型银屑病皮损TNFα与iNOS表达部位相似，二者表达强度呈显著正相关，提示在银屑病皮损中，TNFα参与了诱导iNOS表达。我们发现，在寻常型银屑病皮损中，除Munro微脓疡以外，NFκB的表达部位及强度与TNFα及iNOS无明显关系，提示TNFα诱导的iNOS表达呈NFκB非依赖性机制。但这类机制目前尚不清楚。
在寻常型银屑病皮损的Munro微脓疡部位，TNFα、NFκB及iNOS均较强表达，提示TNFα通过NFκB依赖性机制介导了Munro微脓疡中嗜中性粒细胞表达iNOS，与Munro微脓疡的形成有关。
, 百拇医药 参考文献
1 Liew FY. Regulation of lymphocyte function by nitric oxide. Curr Opin Immunol, 1995,7:396-399.
2 Weller R, Ormerod A. Increased expression of inducible nitric oxide (NO) synthetase. Br J Dermatol, 1997,136:136-137.
3 Shimizu Y, Sakai M, Umemura Y, et al. Immunohistochemical localization of nitric oxide synthetase in normal human skin: expression of endothelial-type and inducible-type nitric oxide synthetase in keratinocytes. J Dermatol, 1997,24:80-87.
, http://www.100md.com
4 Nathan C, Hibbs JJ. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity. Curr Opin Immunol, 1991,3:65-70.
5 Diaz-Guerra MJM, Velaso M, Martin-Sanz P, et al. Evidence for common mechanisms in the transcriptional control of type Ⅱ nitric oxide synthetase in isolated hepatocytes. Requirement of NF-kappa B activation after stimulation with bacterial cell wall production and phorbolesters. J Biol Chem, 1996,271:30114-30120.
6 Sirsjo A, Karlsson M, Gidlof A, et al. Increased expression of inducible nitric oxide synthetase in psoriatic skin and cytokine-stimulated cultured keratinocytes. Br J Dermatol, 1996,134:643-648.
(收稿：1998-06-08 修回：1998-10-12), 百拇医药
单位：林俊萍 毕桂娇 张欣 顾绍裘 110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院皮肤科；张士发 沈阳军区总医院皮肤科
关键词：银屑病；诱生型一氧化氮合成酶；NF-κB；肿瘤坏死因子
中华皮肤科杂志990214 【摘 要】 目的 探讨诱生型NO合成酶(iNOS)在银屑病皮损中表达的调节机制。方法 应用免疫组化技术对寻常型银屑病皮损中肿瘤坏死因子(TNFα)、核因子(NF)κB及iNOS表达进行了检测。结果 15例正常人皮肤均不表达NFκB，5例于毛囊、汗腺、皮脂腺或立毛肌处表达TNFα，9例表皮全层较弱且均匀表达iNOS，5例真皮内单一核细胞(MNCs)弱表达iNOS。26例寻常型银屑病皮损表皮角质形成细胞及真皮内MNCs均表达TNFα、NFκB及iNOS，在Munro微脓疡处表达较强。角质形成细胞及真皮内MNCs上TNFα与iNOS表达强度呈显著正相关(rs′分别为0.526和0.665，P分别小于0.01和0.001)，而NFκB与TNFα和iNOS之间无明显相关(P均 >0.05)。结论 TNFα以NFκB非依赖性机制诱导寻常型银屑病皮损表皮角质形成细胞及真皮内MNSs表达iNOS，而在Munro微脓疡处则可能以NFκB依赖性机制诱导中性粒细胞表达iNOS。
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Expression of Tumor Necrosis Factor α, Nuclear Factor κBand
Inducible Nitric Oxide Synthetase in Lesional Skin
of Psoriasis Vulgaris
LIN Junping, ZHANG Shifa, BI Guijiao, et al.
Department of Dermatology, No. 1 Hospital of China Medical University, Shenyang 110001
【Abstract】 Objective To explore the regulatory mechanism of inducible nitric oxide synthetase (iNOS) expression in lesional skin of psoriasis. Methods The expression of tumor necrosis factor α (TNFα), nuclear factor κB (NF κB) and iNOS was detected by immunohistochemical technique. Results Fifteen skin samples of healthy controls did not express NF κB, 5 of them expressed TNFα in hair follicles, sweat glands, sebaceous glands or arrectores pilorum, 9 of them slightly and evenly expressed iNOS in all layers of epidermis, 5 of them also slightly expressed iNOS on mononuclear cells (MNCs) in dermis. The TNFα, NF κB and iNOS were expressed on epidermal keratinocytes and dermal MNCs, and strongly expressed in Munro′s microabscess in lesional skin of 26 cases of psoriasis vulgaris. The intensity of expression of TNFα and iNOS was significantly correlated between keratinocytes and dermal MNCs (rs′were 0.526 and 0.665, respectively, P<0.01 and 0.001, respectively), and the intensity of expression of NF κB was not correlated to TNFα or iNOS between two kinds of cells in psoriasis vulgaris. Conclusion TNFα induces iNOS expression on keratinocytes and MNCs in lesional skin of psoriasis vulgaris through NF κB-independent mechanism, and on neutrophils in Munro′s microabscess through NF κB-dependent mechanism.
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【Key words】 Psoriasis Inducible nitric oxide synthetase NF-kappa B Tumor necrosis factor
一氧化氮(NO)在银屑病皮损中高表达，与银屑病表皮角质形成细胞的增殖、分化和T淋巴细胞功能异常有关[1]。银屑病皮损中诱生型NO合成酶(iNOS)表达与局部NO水平呈显著正相关[2]。为此，我们对寻常型银屑病皮损肿瘤坏死因子(TNF)α、核因子κB(NFκB)及iNOS的表达进行了免疫组化检测。
资料与方法
1.病例： 26例进行期寻常型银屑病患者，男18例，女8例；年龄18～56岁；病程1～8年；皮损范围10%～65%。另取15例正常人皮肤作对照。
2.取材及标本处理：切取典型皮损，OCT包埋，液氮速冻，-80℃冰箱中保存。所有病例均经临床及常规病理确诊。正常人皮肤处理同前。
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3.试剂：SPTM试剂盒由Zymed公司(美国)生产；兔抗人TNFα多抗由Field博士(英国)惠赠，工作浓度为1∶100；兔抗人NFκB及iNOS多抗由Santa Crutz公司(美国)生产，工作浓度均为1∶50。
4.实验步骤：恒冷切片机连续切取6μm厚组织片，丙酮固定。免疫组化染色步骤按SPTM试剂盒说明书。阴性对照以PBS代替1抗，其余步骤同前。
5.观察指标：DAB显色，细胞染成深黄色为(+)，浅棕黄色为(++)，深棕黄色为(+++)。
6.统计方法：相关性检验采用等级相关分析。
结 果
TNFα表达：15例正常人皮肤表皮角质形成细胞未见表达，5例皮肤附属器可见表达，分别见于毛囊(4/8，+～++)、汗腺(5/10，+～+++)、皮脂腺(4/7，+～++)和立毛肌(3/4，+～++)；26例银屑病皮损多有表达(24/26)，其中Munro微脓疡均强表达(12/12，+++)，从基底细胞层向上表达逐渐增强(24/26，+～+++)。真皮内浸润单一核细胞(MNCs)亦多表达(23/26，+～+++)。血管内皮细胞(6/6，+～+++)、毛囊(7/9，+～+++)、皮脂腺(5/8，+～++)、立毛肌(5/5，++～+++)及汗腺(9/10，++～+++)亦有表达。
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NFκB表达：15例正常人皮肤均未见表达；银屑病皮损多有表达(23/26)，其中Munro微脓疡表达较强(12/12，++～+++)，多数病例(23/26)棘细胞层及其以上的角质形成细胞表达NFκB(+～+++)，而基底层细胞均微弱表达。真皮内MNCs亦有表达(22/26，+～++)。血管内皮及皮肤附属器未见表达。
iNOS表达：15例正常人皮肤多有表达(13/15)，其中表皮全层多较弱均匀表达(13/15，+～+++)，真皮内MNCs亦较弱表达(4/15，++)，毛囊(3/3，+)、皮脂腺(4/4，+)及汗腺(10/15，++～+++)亦有表达；26例银屑病皮损均表达iNOS，从基底细胞层至角质层下方表达逐渐增强(26/26，+～+++)，Munro微脓疡表达最强(10/10，++～+++)。真皮内MNCs表达较弱(24/26，+～++)。血管内皮(3/3，+++)、毛囊(4/4，++)、皮脂腺(3/3，+)及汗腺(7/7，+～++)亦有表达。
, 百拇医药 对比观察发现，正常人皮肤TNFα、NFκB及iNOS表达相互间无明显对应关系；银屑病皮损iNOS表达部位与TNFα相似，表达强度强于TNFα。除Munro微脓疡之外，NFκB表达部位及强度与TNFα和iNOS比较，无明显规律。在Munro微脓疡处，TNFα、NFκB及iNOS表达均较强。
2.统计分析：15例正常人皮肤TNFα、NFκB及iNOS表达无明显对应关系，故未做统计分析。银屑病皮损表皮角质形成细胞、真皮内MNCs的TNFα与NFκB表达强度不相关(rs′分别为0.311和0.362，P均>0.05)，NFκB与iNOS亦不相关(rs′分别为0.206和0.212，P均>0.05)，TNFα与iNOS表达强度均呈显著正相关(rs′分别为0.526和0.665，P均<0.01)。
讨 论
有报道正常人皮肤表皮角质形成细胞和毛囊外毛根鞘弱表达iNOS(±～+)[3]。我们的研究结果与此相似，提示由此产生的NO在机体正常防御反应中起重要作用[4]。
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TNF可通过与其相应受体p55和p75结合而促进NFκB活化，从而诱导一系列细胞因子基因表达，NFκB依赖性机制是诱导iNOS表达的最常见的机制[5]。已知银屑病皮损表达TNFα[1]，我们发现，寻常型银屑病皮损表皮角质形成细胞和真皮内MNCs均不同程度表达TNFα；由于TNFα可诱导培养的角质形成细胞大量表达iNOS[6]，结合本研究结果，寻常型银屑病皮损TNFα与iNOS表达部位相似，二者表达强度呈显著正相关，提示在银屑病皮损中，TNFα参与了诱导iNOS表达。我们发现，在寻常型银屑病皮损中，除Munro微脓疡以外，NFκB的表达部位及强度与TNFα及iNOS无明显关系，提示TNFα诱导的iNOS表达呈NFκB非依赖性机制。但这类机制目前尚不清楚。
在寻常型银屑病皮损的Munro微脓疡部位，TNFα、NFκB及iNOS均较强表达，提示TNFα通过NFκB依赖性机制介导了Munro微脓疡中嗜中性粒细胞表达iNOS，与Munro微脓疡的形成有关。
, 百拇医药 参考文献
1 Liew FY. Regulation of lymphocyte function by nitric oxide. Curr Opin Immunol, 1995,7:396-399.
2 Weller R, Ormerod A. Increased expression of inducible nitric oxide (NO) synthetase. Br J Dermatol, 1997,136:136-137.
3 Shimizu Y, Sakai M, Umemura Y, et al. Immunohistochemical localization of nitric oxide synthetase in normal human skin: expression of endothelial-type and inducible-type nitric oxide synthetase in keratinocytes. J Dermatol, 1997,24:80-87.
, http://www.100md.com
4 Nathan C, Hibbs JJ. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity. Curr Opin Immunol, 1991,3:65-70.
5 Diaz-Guerra MJM, Velaso M, Martin-Sanz P, et al. Evidence for common mechanisms in the transcriptional control of type Ⅱ nitric oxide synthetase in isolated hepatocytes. Requirement of NF-kappa B activation after stimulation with bacterial cell wall production and phorbolesters. J Biol Chem, 1996,271:30114-30120.
6 Sirsjo A, Karlsson M, Gidlof A, et al. Increased expression of inducible nitric oxide synthetase in psoriatic skin and cytokine-stimulated cultured keratinocytes. Br J Dermatol, 1996,134:643-648.
(收稿：1998-06-08 修回：1998-10-12), 百拇医药