β溶血型链球菌诱发点滴型银屑病发病机制的研究
作者：张理涛 陈学荣 殷金珠
单位：100083 北京医科大学第三医院皮肤科；张理涛 现在天津长征医院皮肤科；陈学荣 殷金珠 北京医科大学临床免疫室
关键词：银屑病；链球菌属
中华皮肤科杂志990212 【摘 要】 目的 探讨β溶血型链球菌所诱发的急性点滴型银屑病的发病机制。方法 应用MTT方法观察急性点滴型银屑病患者外周血淋巴细胞(PBMC)对链球菌抗原的反应，用3H-TdR掺入法和免疫组织化学方法检测链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液对人类角质形成细胞株COLO-16DNA合成以及HLA-DR、ICAM-1分子表达的影响。结果 急性点滴型银屑病患者PBMC对链球菌抗原的反应较对照组更为明显(P<0.01)，其24h链球菌抗原刺激 的PBMC培养上清液对角质形成细胞的促增殖作用较对照组显著增强(P<0.01)，并能诱导角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1。结论 具有银屑病素质的个体体内可能存在链球菌抗原特异性的T淋巴细胞，受链球菌抗原或超抗原作用后增殖，产生大量细胞因子，导致角质形成细胞过度增生和HLA-DR、ICAM-1异常表达。
, http://www.100md.com
Study on Pathogenesis of Guttate Type Psoriasis Induced
by Group A β-haemolytic Streptococcal Infection
ZHANG Litao,CHEN Xuerong,YIN Jinzhu.
Department of Dermatology, The Third School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To investigate the pathogenesis of acute guttate type psoriasis (AGP) induced by streptococcal infection. Methods The proliferative responses of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to streptococcal antigens were detected by using MTT methods. Effects of supernatants of PBMCs cultured with streptococcal antigens on DNA synthesis of keratinocytes were measured by 3H-TdR incorporation assay,and immunohistochemical staining was used to examine HLA-DR and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) expression on keratinocytes. Results The proliferative responses of PBMCs to streptococcal antigens were greatly enhanced in patients with AGP than those in controls (P<0.01).The supernatants of PBMCs in patients with AGP stimulated by streptococcal antigens could significantly increase 3H-TdR incorporation with keratinocytes (P<0.01).And these supernatants from patients with AGP could also induce the expression of HLA-DR and ICAM-1 in human keratinocytes. Conclusion There might be streptococcal antigen-specific T lymphocytes in AGP patients.
, 百拇医药
【Key words】 Psoriasis Streptococcus
β溶血型链球菌感染与急性点滴型银屑病(AGP)的相关性早已引起皮肤科医师的注意，但其发病机制不明。我们应用链球菌悬液作用于AGP患者的外周血淋巴细胞，了解其对链球菌抗原的反应；并且收获外周血淋巴细胞(PBMC)的24h培养上清液作用于人类角质形成细胞株COLO-16，观察培养上清液对角质形成细胞生物学性状的影响；以期从实验中探讨链球菌感染后的AGP发病机制。
材料和方法
一、临床资料
临床和病理确诊的AGP、斑块型患者各10例，健康对照10例。AGP病例多为初发，8例有上呼吸道感染史；年龄17～41岁；病程1周至2年。斑块型年龄17～69岁；病程6个月至20年。所有患者至少1个月内未接受皮质类固醇及其他免疫抑制药物治疗。
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二、方法
1.A组β溶血型链球菌抗原悬液的制备：β溶血型链球菌(北京医科大学微生物学教研室)接种于10%羊血培养平皿；37℃，24h；收获细菌于生理盐水中；比浊定量，超声裂碎菌体，-20℃贮存备用。
2.MTT法[1]检测PBMC对链球菌抗原的反应：密度梯度离心法分离PBMC，用C-1640配成2×106/mL，每孔200μL加入96孔板。分空白和链球菌悬液两组、每组至少3个复孔分别加入C-1640和链球菌悬液(菌数104/mL)；37℃、5% CO2条件下72h，常规MTT法测A值；并吸取24h培养上清液，贮存于-20℃。
统计学处理：PBMC的增殖反应以至少3个复孔的平均A值表示。每次实验AGP组、斑块型组分别与同一对照配对，取与对照比较后所得的A值差值(用x±s表示)进行配对t检验。
3.PBMC培养上清液对人角质形成细胞DNA合成的影响：选择生长良好的人表皮角质形成细胞株COLO-16(北京医科大学临床免疫室)，用C-1640配成1×105/mL，加入24孔平底细胞培养板(1mL/孔)；与各组PBMC 24h培养上清液共同培养48h；3H-TdR掺入法测各孔放射活性。
, 百拇医药
统计学处理：每个上清液样本以至少3个复孔的平均cpm表示3H-TdR掺入量，各组cpm均值差别用t检验。
4.免疫组化方法检测PBMC培养上清液作用后的角质形成细胞膜表面分子(HLA-DR、ICAM-1)表达：选择生长良好的COLO-16细胞爬片，与各组自发生长或链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液共同作用36h(上清液与培养液比例为1∶10)，常规组化染色方法检测HLA-DR和ICAM-1分子表达。
结 果
一、银屑病患者PBMC对链球菌抗原的反应 统计结果显示，点滴型组的PBMC对链球菌抗原的反应较对照组明显增强(A值差值为0.057±0.045)，具有显著性差异(t=4.001,P< 0.01)；斑块型组的PBMC虽然也发生增殖(A值差值为0.015±0.060)，但无显著性差异(t=0.770,P >0.05)。
, 百拇医药
二、PBMC培养上清液对人角质形成细胞DNA合成的影响
表1显示，AGP组、斑块型组和对照组链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液均较自发生长的PBMC明显促进角质形成细胞DNA合成；其中AGP组较斑块型组和对照组显著增强(t值分别为3.454、3.037,P均<0.01)；而自发生长的PBMC培养上清液对角质形成细胞的促增殖反应各组间无显著性差异。
表1 外周血单一核细胞培养上清液对人角质形成细胞DNA合成的影响(
±s) 组 别
例 数
上清液来源
t值
P值
, 百拇医药
自发生长
链球菌刺激
点滴型组
10
12457.5±8342.5
25479.0±8848.6
3.386
<0.05
斑块型组
10
10078.0±7347.0
16488.0±3054.0
, 百拇医药
2.547
<0.05
对照组
10
11976.0±4735.5
15538.0±2124.0
2.170
<0.05
三、免疫组化染色结果
实验中由于受收集上清液数量的限制，我们仅以定性的方法进行了观察。发现所有4例(4/4)链球菌抗原刺激的AGP患者的PBMC培养上清液均可诱导人角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1；而斑块型组有1例(1/3)。对照组和自发生长的PBMC培养上清液偶尔也有HLA-DR和ICAM-1的弱表达。
, 百拇医药
讨 论
对于β溶血型链球菌所诱发的AGP的发病机制，Valdimarsson等[2]特别重视链球菌超抗原的作用，认为M蛋白、致热外毒素等超抗原成分可通过与T细胞受体(TCR)Vβ区结合，直接大量活化T淋巴细胞，有着类似致分裂原的作用。Baker等[3]曾用重复胰酶消化的方法去除链球菌表面的M蛋白，发现斑块型患者的PBMC对胰酶消化后的链球菌反应较消化前明显下降；而对照组无明显变化。这论证了M蛋白特异性T淋巴细胞的存在。由于链球菌抗原成分复杂，每个链球菌是作为一个整体参与对人体的致病过程。所以我们应用超声裂碎的链球菌悬液作用于人PBMC。与Baker等稍有不同，我们发现AGP患者的PBMC对链球菌抗原的反应明显强于斑块型和对照组。由此推测AGP发病与PBMC对链球菌抗原反应增强有关。
活化增殖的PBMC、尤其是T淋巴细胞可以产生大量细胞因子，成为银屑病角质形成细胞活化、过度增生的桥梁。受链球菌作用的PBMC培养上清液中存在大量的细胞因子，对角质形成细胞的DNA合成有显著的促进作用，并能诱导角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1，参与炎症过程。这以AGP组更为明显，表明上清液中含有促角质形成细胞增殖与活化的因子；至少它们发生了量的变化，成为银屑病角质形成细胞免疫病理改变的原因。
, 百拇医药
参考文献
1 Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Reexamination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/kill. J Immunol Methods, 1989,119:203-210.
2 Valdimarsson H, Baker BS, Jónsdótti I, et al. Psoriasis: a T-cell mediated autoimmune disease induced by streptococcal superantigen? Immunology Today, 1995,16:145-149.
3 Baker BS, Bokth S, Garioch JJ, et al. Decreased T cell reactivity to trypsinized group A, type M22 streptococci in psoriasis. Acta Dermatol Venereol, 1994,74:276-278.
(收稿：1997-12-01 修回：1998-08-07), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学第三医院皮肤科；张理涛 现在天津长征医院皮肤科；陈学荣 殷金珠 北京医科大学临床免疫室
关键词：银屑病；链球菌属
中华皮肤科杂志990212 【摘 要】 目的 探讨β溶血型链球菌所诱发的急性点滴型银屑病的发病机制。方法 应用MTT方法观察急性点滴型银屑病患者外周血淋巴细胞(PBMC)对链球菌抗原的反应，用3H-TdR掺入法和免疫组织化学方法检测链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液对人类角质形成细胞株COLO-16DNA合成以及HLA-DR、ICAM-1分子表达的影响。结果 急性点滴型银屑病患者PBMC对链球菌抗原的反应较对照组更为明显(P<0.01)，其24h链球菌抗原刺激 的PBMC培养上清液对角质形成细胞的促增殖作用较对照组显著增强(P<0.01)，并能诱导角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1。结论 具有银屑病素质的个体体内可能存在链球菌抗原特异性的T淋巴细胞，受链球菌抗原或超抗原作用后增殖，产生大量细胞因子，导致角质形成细胞过度增生和HLA-DR、ICAM-1异常表达。
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Study on Pathogenesis of Guttate Type Psoriasis Induced
by Group A β-haemolytic Streptococcal Infection
ZHANG Litao,CHEN Xuerong,YIN Jinzhu.
Department of Dermatology, The Third School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To investigate the pathogenesis of acute guttate type psoriasis (AGP) induced by streptococcal infection. Methods The proliferative responses of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to streptococcal antigens were detected by using MTT methods. Effects of supernatants of PBMCs cultured with streptococcal antigens on DNA synthesis of keratinocytes were measured by 3H-TdR incorporation assay,and immunohistochemical staining was used to examine HLA-DR and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) expression on keratinocytes. Results The proliferative responses of PBMCs to streptococcal antigens were greatly enhanced in patients with AGP than those in controls (P<0.01).The supernatants of PBMCs in patients with AGP stimulated by streptococcal antigens could significantly increase 3H-TdR incorporation with keratinocytes (P<0.01).And these supernatants from patients with AGP could also induce the expression of HLA-DR and ICAM-1 in human keratinocytes. Conclusion There might be streptococcal antigen-specific T lymphocytes in AGP patients.
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【Key words】 Psoriasis Streptococcus
β溶血型链球菌感染与急性点滴型银屑病(AGP)的相关性早已引起皮肤科医师的注意，但其发病机制不明。我们应用链球菌悬液作用于AGP患者的外周血淋巴细胞，了解其对链球菌抗原的反应；并且收获外周血淋巴细胞(PBMC)的24h培养上清液作用于人类角质形成细胞株COLO-16，观察培养上清液对角质形成细胞生物学性状的影响；以期从实验中探讨链球菌感染后的AGP发病机制。
材料和方法
一、临床资料
临床和病理确诊的AGP、斑块型患者各10例，健康对照10例。AGP病例多为初发，8例有上呼吸道感染史；年龄17～41岁；病程1周至2年。斑块型年龄17～69岁；病程6个月至20年。所有患者至少1个月内未接受皮质类固醇及其他免疫抑制药物治疗。
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二、方法
1.A组β溶血型链球菌抗原悬液的制备：β溶血型链球菌(北京医科大学微生物学教研室)接种于10%羊血培养平皿；37℃，24h；收获细菌于生理盐水中；比浊定量，超声裂碎菌体，-20℃贮存备用。
2.MTT法[1]检测PBMC对链球菌抗原的反应：密度梯度离心法分离PBMC，用C-1640配成2×106/mL，每孔200μL加入96孔板。分空白和链球菌悬液两组、每组至少3个复孔分别加入C-1640和链球菌悬液(菌数104/mL)；37℃、5% CO2条件下72h，常规MTT法测A值；并吸取24h培养上清液，贮存于-20℃。
统计学处理：PBMC的增殖反应以至少3个复孔的平均A值表示。每次实验AGP组、斑块型组分别与同一对照配对，取与对照比较后所得的A值差值(用x±s表示)进行配对t检验。
3.PBMC培养上清液对人角质形成细胞DNA合成的影响：选择生长良好的人表皮角质形成细胞株COLO-16(北京医科大学临床免疫室)，用C-1640配成1×105/mL，加入24孔平底细胞培养板(1mL/孔)；与各组PBMC 24h培养上清液共同培养48h；3H-TdR掺入法测各孔放射活性。
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统计学处理：每个上清液样本以至少3个复孔的平均cpm表示3H-TdR掺入量，各组cpm均值差别用t检验。
4.免疫组化方法检测PBMC培养上清液作用后的角质形成细胞膜表面分子(HLA-DR、ICAM-1)表达：选择生长良好的COLO-16细胞爬片，与各组自发生长或链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液共同作用36h(上清液与培养液比例为1∶10)，常规组化染色方法检测HLA-DR和ICAM-1分子表达。
结 果
一、银屑病患者PBMC对链球菌抗原的反应 统计结果显示，点滴型组的PBMC对链球菌抗原的反应较对照组明显增强(A值差值为0.057±0.045)，具有显著性差异(t=4.001,P< 0.01)；斑块型组的PBMC虽然也发生增殖(A值差值为0.015±0.060)，但无显著性差异(t=0.770,P >0.05)。
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二、PBMC培养上清液对人角质形成细胞DNA合成的影响
表1显示，AGP组、斑块型组和对照组链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液均较自发生长的PBMC明显促进角质形成细胞DNA合成；其中AGP组较斑块型组和对照组显著增强(t值分别为3.454、3.037,P均<0.01)；而自发生长的PBMC培养上清液对角质形成细胞的促增殖反应各组间无显著性差异。
表1 外周血单一核细胞培养上清液对人角质形成细胞DNA合成的影响(
±s) 组 别例 数
上清液来源
t值
P值
, 百拇医药
自发生长
链球菌刺激
点滴型组
10
12457.5±8342.5
25479.0±8848.6
3.386
<0.05
斑块型组
10
10078.0±7347.0
16488.0±3054.0
, 百拇医药
2.547
<0.05
对照组
10
11976.0±4735.5
15538.0±2124.0
2.170
<0.05
三、免疫组化染色结果
实验中由于受收集上清液数量的限制，我们仅以定性的方法进行了观察。发现所有4例(4/4)链球菌抗原刺激的AGP患者的PBMC培养上清液均可诱导人角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1；而斑块型组有1例(1/3)。对照组和自发生长的PBMC培养上清液偶尔也有HLA-DR和ICAM-1的弱表达。
, 百拇医药
讨 论
对于β溶血型链球菌所诱发的AGP的发病机制，Valdimarsson等[2]特别重视链球菌超抗原的作用，认为M蛋白、致热外毒素等超抗原成分可通过与T细胞受体(TCR)Vβ区结合，直接大量活化T淋巴细胞，有着类似致分裂原的作用。Baker等[3]曾用重复胰酶消化的方法去除链球菌表面的M蛋白，发现斑块型患者的PBMC对胰酶消化后的链球菌反应较消化前明显下降；而对照组无明显变化。这论证了M蛋白特异性T淋巴细胞的存在。由于链球菌抗原成分复杂，每个链球菌是作为一个整体参与对人体的致病过程。所以我们应用超声裂碎的链球菌悬液作用于人PBMC。与Baker等稍有不同，我们发现AGP患者的PBMC对链球菌抗原的反应明显强于斑块型和对照组。由此推测AGP发病与PBMC对链球菌抗原反应增强有关。
活化增殖的PBMC、尤其是T淋巴细胞可以产生大量细胞因子，成为银屑病角质形成细胞活化、过度增生的桥梁。受链球菌作用的PBMC培养上清液中存在大量的细胞因子，对角质形成细胞的DNA合成有显著的促进作用，并能诱导角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1，参与炎症过程。这以AGP组更为明显，表明上清液中含有促角质形成细胞增殖与活化的因子；至少它们发生了量的变化，成为银屑病角质形成细胞免疫病理改变的原因。
, 百拇医药
参考文献
1 Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Reexamination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/kill. J Immunol Methods, 1989,119:203-210.
2 Valdimarsson H, Baker BS, Jónsdótti I, et al. Psoriasis: a T-cell mediated autoimmune disease induced by streptococcal superantigen? Immunology Today, 1995,16:145-149.
3 Baker BS, Bokth S, Garioch JJ, et al. Decreased T cell reactivity to trypsinized group A, type M22 streptococci in psoriasis. Acta Dermatol Venereol, 1994,74:276-278.
(收稿：1997-12-01 修回：1998-08-07), 百拇医药