银屑病患者生长抑素的定量定位检测
作者：陈洁 郑茂荣 方跃明
单位：200433 上海，第二军医大学长海医院皮肤科
关键词：银屑病；生长抑素；RNA；信使
中华皮肤科杂志990201 【摘 要】 目的 探讨生长抑素(somatostatin, SS)与银屑病的相关性。方法 用放射免疫分析法测定银屑病患者血浆及皮损中SS含量，用免疫组化法观察13例寻常型银屑病患者皮损和8例正常人皮肤中SS的分布，用原位杂交组织化学法检测皮损处SSmRNA表达情况。结果 定量检测表明患者血浆SS水平低于对照组，而患者皮损SS水平显著高于对照组，定位检测光镜下见3例新发银屑病患者皮损中的SS在真皮乳头层大片沉积，而10例慢性急性发作的病例与正常对照基本相同， 光镜下见真皮层极散在分布的SS染色。对3例皮损中SS强阳性的银屑病患者，用原位杂交组织化学法检测皮损处SSmRNA表达情况， 结果未见皮肤各层细胞内有SSmRNA表达信号。结论 银屑病患者SS血浆中的低水平及其皮损中的高表达提示SS在银屑病的发病中起重要作用。
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Quantitation and Localization of Somatostatin
in Patients with Psoriasis
CHEN Jie,ZHENG Maorong,FANG Yueming.
Department of Dermatology,Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between somatostatin and psoriasis. Methods The levels of somatostatin in the plasma and skin lesions of patients with psoriasis were determined by radioimmunoassay. The distribution of somatostatin in the skin lesions of 13 patients and eight normal skin samples was determined by ABC-alkaline phosphatase immunohistochemical assay. The somatostatin mRNA expression was examined by in situ hybridization histochemistry. Results The plasma level of somatostatin of the patients was significantly lower than that in controls (P<0.05), whereas the concentration of somatostatin in the skin lesions was significantly higher than that in controls (P<0.05). The distribution of somatostatin was accumulated in patches in the papillary layer in three incipient cases. In 10 chronic cases with acute onset the distribution was the same as the normal controls, and scattered staining of somatostatin could be seen in the dermis. The three cases with strong positive staining of somatostatin were tested for the expression of somatostatin mRNA by in situ hybridization histochemistry. No signal of somatostatin mRNA expression was observed in any cells of the skin lesions. Conclusion The lower level of somatostatin in the plasma and high expression of somatostatin in the skin lesions suggest that somatostatin might play an important role in the pathogenesis of psoriasis.
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【Key words】 Psoriasis Somatostatin RNA, messenger
生长抑素(somatostatin, SS)是含有14个氨基酸的环状多肽，1973年Brazeau等由羊的下丘脑分离提纯，具有抑制垂体前叶释放生长激素的作用[1]。体外实验证明银屑病患者生长激素水平较高。银屑病患者是否本身SS水平低下, 不能抑制人类生长激素(HGH), 而致表皮过度增殖; 增加外源性SS是否通过抑制HGH而对银屑病起治疗作用都值得进一步探讨。我们测定新发或1个月内未行任何治疗的银屑病患者血浆及皮损中SS水平,检测SS在银屑病皮损中的定位分布以讨论其临床意义。
资料和方法
一、定量研究
(一)病例选择：
1. 血浆检测：31例寻常型银屑病患者均为皮损典型、临床诊断明确的门诊患者，其中男19例，女12例，年龄10～68岁，平均34.21岁。急性点滴状银屑病10例，斑块状银屑病21例，所有患者均为新发或检测前1个月内未行任何内服外用治疗者。
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2. 皮损检测：13例寻常型银屑病患者均为门诊患者，其中男7例，女6例，年龄16～40岁，平均年龄26.83岁。急性点滴状银屑病6例，斑块状银屑病7例。其余情况同血浆检测组。对照组20例，为外科行重睑术、面部美容切除术的健康者，其年龄、性别与银屑病组相仿，20例取血浆、8例取皮肤作为对照。
(二)检测方法：取血及取活检前对患者行PASI评分。患者和对照组血浆、皮损或正常皮肤的SS测定同期完成。
血浆：每人取肘静脉血4mL，注入加EDTA-二钠和抑肽酶的塑料离心管中，立即离心4000r/min 20min,取上清液置于-20℃冰箱中保存待测。
皮损：活检取背部或四肢约2cm×1cm大小皮损，置于煮沸生理盐水中10min，期间保持生理盐水的浓度。用粉碎器将皮肤组织制成匀浆，同时加入0.1N的醋酸，4℃冰箱中放置3h行淬化后加0.1N的NaOH中和，混匀后离心，4000r/min 20min，取上清液置于-20℃冰箱中保存待测。 定量检测:采用放射免疫分析法测定，SS放免药盒由本校神经生物教研室提供。
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(三)统计学分析：患者组与对照组血浆及皮损中SS含量的比较采用t检验，血浆或皮损SS水平与PASI评分之间的比较采用Spearman等级相关分析。
二、 定位研究
(一) 临床资料:13例寻常型银屑病患者均为皮损典型，临床诊断明确的患者。其中男7例， 女6例;年龄16～40岁，平均26.83岁。13例患者中，3例为未经任何治疗的银屑病初发患者，其余10例系经外用大力士软膏、芥子气软膏及内服迪银片等多种治疗的慢性急性发作的银屑病患者。对照组8例，男女各4例，年龄18～62岁，平均33岁，皆取自皮肤外科切除瘢痕患者边缘正常皮肤， 其年龄、性别与银屑病组相仿，无统计学差异。
(二)试剂与仪器: 牛血清白蛋白( Fluka)，Triton X-100(E. Merck)，兔抗SS血清(本校神经生物教研室)，羊抗兔IgG(Vector进口分装)，ABC-AKD试剂盒(Vector进口分装)，地高辛标记反义cRNA探针(本校组胚教研室提供)，杂交缓冲液(本校生理教研室提供)，碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(宝灵曼公司)，其他试剂均为国产分析纯。
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(三)方法:皮损及对照组标本的定位检测用免疫组化方法(ABC-碱性磷酸酶法)[2]。阴性对照试验： 用正常兔血清代替兔抗人SS抗血清，其他步骤与免疫组化染色程序相同。免疫组化法SS阳性染色的银屑病患者的皮损再用原位杂交组化法[3]进一步试验。
原位杂交组化阳性对照试验，用大鼠下丘脑冠状切片1～15张代替银屑病皮肤，其余步骤相同。
结 果
一、 定量研究(放射免疫分析法)
31例寻常型银屑病患者血浆SS水平(219.27±37.05)pg/mL较对照组(375.63±50.43)pg/mL明显降低。经t检验，t= 2.62，P<0.05；13例寻常型银屑病患者皮损SS水平(563.35±77.73)pg/mL较对照组(231.63±47.64)pg/mL明显升高，经t检验，t=2.53，P<0.05。
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将血浆或皮损SS水平与PASI评分分别作Spearman等级相关分析，结果提示血浆SS水平与PASI评分呈显著负相关(rs=-0.937,P<0.01)，皮损SS水平与PASI评分无明显相关性(rs=0.236,P>0.05)。
二、定位研究
(一)ABC-碱性磷酸酶实验：3例新发银屑病患者皮损中的SS在真皮乳头层呈大片状沉积，越往下越少，真皮网状层有沉积，比乳头层明显减少。10例慢性急性发作的银屑病结果基本同正常对照，光镜下见真皮层极散在分布的SS阳性染色。未加SS抗体的标本(即阴性对照试验)，未见有SS沉积， 提示碱性磷酸酶对SS的染色具有特异性。
(二)原位杂交组织化学法实验：光镜下银屑病患者皮损处未见有SSmRNA阳性杂交信号。
讨 论
, http://www.100md.com 我们用放射免疫分析法测定了新发或1个月内未行任何治疗的银屑病患者血浆及皮损中SS的含量。结果提示银屑病患者血浆内SS水平低下，而皮损处SS水平明显高于正常人。我们推测银屑病患者血浆中SS水平低下及皮损处SS水平升高可能是因为这类患者真皮乳头层毛细血管扩张，致SS渗漏至皮肤局部引起。沉积于皮损中的SS因银屑病患者皮肤缺乏SS受体[4]，两者无法结合，故SS不在局部起作用。
本研究用ABC-碱性磷酸酶法检测银屑病患者皮损处SS的分布,结果提示13例患者中3例新发病例在光镜下可见真皮乳头层大片的SS阳性反应物，真皮网状层亦有沉积，但明显少于乳头层。正常人及10例慢性患者只在真皮层检测到极散在分布的SS阳性反应物。这从形态学上支持了我们上述的推断。
为进一步判别沉积于真皮的SS来源，我们用原位杂交组织化学法探测皮损局部SSmRNA的表达情况。如果皮损局部的SS是由皮肤内细胞分泌，用此方法可探测到皮肤局部的SSmRNA阳性表达信号。本实验研究中，光镜下银屑病患者皮损处未见有SSmRNA阳性杂交信号，提示皮损处的SS可能来源于血浆，而非皮肤自身合成，也支持我们上述的推断。
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参考文献
1 韩济生，关新民. 医用神经生物学.武汉：同济医科大学出版社，1996.197-202.
2 倪灿荣,宋亚贵.免疫组织化学新技术及应用.第1版.北京：北京科学技术出版社,1994.128-129.
3 苏慧慈.原位杂交.北京:中国科学技术出版社,1994.59-229.
4 Reubi-JC, Hanzker-T. Absence of somatostatin receptors in psoriatic skin lesions. Arch Dermatol Res, 1990, 282:139-141.
(收稿：1998-04-12 修回：1999-01-12), 百拇医药
单位：200433 上海，第二军医大学长海医院皮肤科
关键词：银屑病；生长抑素；RNA；信使
中华皮肤科杂志990201 【摘 要】 目的 探讨生长抑素(somatostatin, SS)与银屑病的相关性。方法 用放射免疫分析法测定银屑病患者血浆及皮损中SS含量，用免疫组化法观察13例寻常型银屑病患者皮损和8例正常人皮肤中SS的分布，用原位杂交组织化学法检测皮损处SSmRNA表达情况。结果 定量检测表明患者血浆SS水平低于对照组，而患者皮损SS水平显著高于对照组，定位检测光镜下见3例新发银屑病患者皮损中的SS在真皮乳头层大片沉积，而10例慢性急性发作的病例与正常对照基本相同， 光镜下见真皮层极散在分布的SS染色。对3例皮损中SS强阳性的银屑病患者，用原位杂交组织化学法检测皮损处SSmRNA表达情况， 结果未见皮肤各层细胞内有SSmRNA表达信号。结论 银屑病患者SS血浆中的低水平及其皮损中的高表达提示SS在银屑病的发病中起重要作用。
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Quantitation and Localization of Somatostatin
in Patients with Psoriasis
CHEN Jie,ZHENG Maorong,FANG Yueming.
Department of Dermatology,Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between somatostatin and psoriasis. Methods The levels of somatostatin in the plasma and skin lesions of patients with psoriasis were determined by radioimmunoassay. The distribution of somatostatin in the skin lesions of 13 patients and eight normal skin samples was determined by ABC-alkaline phosphatase immunohistochemical assay. The somatostatin mRNA expression was examined by in situ hybridization histochemistry. Results The plasma level of somatostatin of the patients was significantly lower than that in controls (P<0.05), whereas the concentration of somatostatin in the skin lesions was significantly higher than that in controls (P<0.05). The distribution of somatostatin was accumulated in patches in the papillary layer in three incipient cases. In 10 chronic cases with acute onset the distribution was the same as the normal controls, and scattered staining of somatostatin could be seen in the dermis. The three cases with strong positive staining of somatostatin were tested for the expression of somatostatin mRNA by in situ hybridization histochemistry. No signal of somatostatin mRNA expression was observed in any cells of the skin lesions. Conclusion The lower level of somatostatin in the plasma and high expression of somatostatin in the skin lesions suggest that somatostatin might play an important role in the pathogenesis of psoriasis.
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【Key words】 Psoriasis Somatostatin RNA, messenger
生长抑素(somatostatin, SS)是含有14个氨基酸的环状多肽，1973年Brazeau等由羊的下丘脑分离提纯，具有抑制垂体前叶释放生长激素的作用[1]。体外实验证明银屑病患者生长激素水平较高。银屑病患者是否本身SS水平低下, 不能抑制人类生长激素(HGH), 而致表皮过度增殖; 增加外源性SS是否通过抑制HGH而对银屑病起治疗作用都值得进一步探讨。我们测定新发或1个月内未行任何治疗的银屑病患者血浆及皮损中SS水平,检测SS在银屑病皮损中的定位分布以讨论其临床意义。
资料和方法
一、定量研究
(一)病例选择：
1. 血浆检测：31例寻常型银屑病患者均为皮损典型、临床诊断明确的门诊患者，其中男19例，女12例，年龄10～68岁，平均34.21岁。急性点滴状银屑病10例，斑块状银屑病21例，所有患者均为新发或检测前1个月内未行任何内服外用治疗者。
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2. 皮损检测：13例寻常型银屑病患者均为门诊患者，其中男7例，女6例，年龄16～40岁，平均年龄26.83岁。急性点滴状银屑病6例，斑块状银屑病7例。其余情况同血浆检测组。对照组20例，为外科行重睑术、面部美容切除术的健康者，其年龄、性别与银屑病组相仿，20例取血浆、8例取皮肤作为对照。
(二)检测方法：取血及取活检前对患者行PASI评分。患者和对照组血浆、皮损或正常皮肤的SS测定同期完成。
血浆：每人取肘静脉血4mL，注入加EDTA-二钠和抑肽酶的塑料离心管中，立即离心4000r/min 20min,取上清液置于-20℃冰箱中保存待测。
皮损：活检取背部或四肢约2cm×1cm大小皮损，置于煮沸生理盐水中10min，期间保持生理盐水的浓度。用粉碎器将皮肤组织制成匀浆，同时加入0.1N的醋酸，4℃冰箱中放置3h行淬化后加0.1N的NaOH中和，混匀后离心，4000r/min 20min，取上清液置于-20℃冰箱中保存待测。 定量检测:采用放射免疫分析法测定，SS放免药盒由本校神经生物教研室提供。
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(三)统计学分析：患者组与对照组血浆及皮损中SS含量的比较采用t检验，血浆或皮损SS水平与PASI评分之间的比较采用Spearman等级相关分析。
二、 定位研究
(一) 临床资料:13例寻常型银屑病患者均为皮损典型，临床诊断明确的患者。其中男7例， 女6例;年龄16～40岁，平均26.83岁。13例患者中，3例为未经任何治疗的银屑病初发患者，其余10例系经外用大力士软膏、芥子气软膏及内服迪银片等多种治疗的慢性急性发作的银屑病患者。对照组8例，男女各4例，年龄18～62岁，平均33岁，皆取自皮肤外科切除瘢痕患者边缘正常皮肤， 其年龄、性别与银屑病组相仿，无统计学差异。
(二)试剂与仪器: 牛血清白蛋白( Fluka)，Triton X-100(E. Merck)，兔抗SS血清(本校神经生物教研室)，羊抗兔IgG(Vector进口分装)，ABC-AKD试剂盒(Vector进口分装)，地高辛标记反义cRNA探针(本校组胚教研室提供)，杂交缓冲液(本校生理教研室提供)，碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段(宝灵曼公司)，其他试剂均为国产分析纯。
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(三)方法:皮损及对照组标本的定位检测用免疫组化方法(ABC-碱性磷酸酶法)[2]。阴性对照试验： 用正常兔血清代替兔抗人SS抗血清，其他步骤与免疫组化染色程序相同。免疫组化法SS阳性染色的银屑病患者的皮损再用原位杂交组化法[3]进一步试验。
原位杂交组化阳性对照试验，用大鼠下丘脑冠状切片1～15张代替银屑病皮肤，其余步骤相同。
结 果
一、 定量研究(放射免疫分析法)
31例寻常型银屑病患者血浆SS水平(219.27±37.05)pg/mL较对照组(375.63±50.43)pg/mL明显降低。经t检验，t= 2.62，P<0.05；13例寻常型银屑病患者皮损SS水平(563.35±77.73)pg/mL较对照组(231.63±47.64)pg/mL明显升高，经t检验，t=2.53，P<0.05。
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将血浆或皮损SS水平与PASI评分分别作Spearman等级相关分析，结果提示血浆SS水平与PASI评分呈显著负相关(rs=-0.937,P<0.01)，皮损SS水平与PASI评分无明显相关性(rs=0.236,P>0.05)。
二、定位研究
(一)ABC-碱性磷酸酶实验：3例新发银屑病患者皮损中的SS在真皮乳头层呈大片状沉积，越往下越少，真皮网状层有沉积，比乳头层明显减少。10例慢性急性发作的银屑病结果基本同正常对照，光镜下见真皮层极散在分布的SS阳性染色。未加SS抗体的标本(即阴性对照试验)，未见有SS沉积， 提示碱性磷酸酶对SS的染色具有特异性。
(二)原位杂交组织化学法实验：光镜下银屑病患者皮损处未见有SSmRNA阳性杂交信号。
讨 论
, http://www.100md.com 我们用放射免疫分析法测定了新发或1个月内未行任何治疗的银屑病患者血浆及皮损中SS的含量。结果提示银屑病患者血浆内SS水平低下，而皮损处SS水平明显高于正常人。我们推测银屑病患者血浆中SS水平低下及皮损处SS水平升高可能是因为这类患者真皮乳头层毛细血管扩张，致SS渗漏至皮肤局部引起。沉积于皮损中的SS因银屑病患者皮肤缺乏SS受体[4]，两者无法结合，故SS不在局部起作用。
本研究用ABC-碱性磷酸酶法检测银屑病患者皮损处SS的分布,结果提示13例患者中3例新发病例在光镜下可见真皮乳头层大片的SS阳性反应物，真皮网状层亦有沉积，但明显少于乳头层。正常人及10例慢性患者只在真皮层检测到极散在分布的SS阳性反应物。这从形态学上支持了我们上述的推断。
为进一步判别沉积于真皮的SS来源，我们用原位杂交组织化学法探测皮损局部SSmRNA的表达情况。如果皮损局部的SS是由皮肤内细胞分泌，用此方法可探测到皮肤局部的SSmRNA阳性表达信号。本实验研究中，光镜下银屑病患者皮损处未见有SSmRNA阳性杂交信号，提示皮损处的SS可能来源于血浆，而非皮肤自身合成，也支持我们上述的推断。
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参考文献
1 韩济生，关新民. 医用神经生物学.武汉：同济医科大学出版社，1996.197-202.
2 倪灿荣,宋亚贵.免疫组织化学新技术及应用.第1版.北京：北京科学技术出版社,1994.128-129.
3 苏慧慈.原位杂交.北京:中国科学技术出版社,1994.59-229.
4 Reubi-JC, Hanzker-T. Absence of somatostatin receptors in psoriatic skin lesions. Arch Dermatol Res, 1990, 282:139-141.
(收稿：1998-04-12 修回：1999-01-12), 百拇医药