银屑病患者外周血T淋巴细胞酪氨酸蛋白激酶活性的初步研究
作者：吕根法 李文维 伍津津
单位：吕根法 471003 河南省洛阳市，解放军五三四医院皮肤科；李文维 伍津津 第三军医大学大坪医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志990226 银屑病是一种常见的炎性增生性皮肤病，尽管其发病机理目前尚不清楚，但表达HLA-2、白介素2(IL-2)受体等活化标志的T淋巴细胞在发病中的作用愈来愈受到人们的关注，局部浸润激活的T淋巴细胞一方面产生大量的生长因子/细胞因子，通过旁分泌作用于角质形成细胞直接刺激表皮增生；另一方面通过影响代谢，发挥促增生作用[1]。T淋巴细胞激活伴有酪氨酸残基的磷酸化，酪氨酸蛋白激酶(TPK)在淋巴细胞激活、分化调控中具有重要的生理功能[2]。我们通过对银屑病外周血T淋巴细胞TPK活性的研究，以探讨TPK在T淋巴细胞异常激活中的作用，为银屑病发病机理和治疗的研究提供一定的依据。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.标本来源：进行期寻常型银屑病22例，男13例，女9例，年龄18～45岁，平均年龄28.4岁；17例正常人对照组，男10例，女7例，年龄22～41岁，平均年龄26.3岁。两组性别、年龄无统计学差异。常规采取10mL全血加入柠檬酸钠抗凝。
2.T淋巴细胞膜制备[3]：全血用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞，再通过尼龙毛纯化出T淋巴细胞。加入刀豆素A(ConA)(每1×106T淋巴细胞加入20μg/mL)，37℃、5% CO2孵箱内分别孵育0h、2h、4h、8h。将T淋巴细胞置于匀浆液内(50mmol/L Tris, pH7.4,1mmol/L EGTA, 1.5mmol/L MgCl2,100mmol/L NaF,0.5mmol/L PMSF,250mmol/L庶糖，5mmol/L DTT)，冰水浴内匀浆破膜，1000r/min离心10min，上清液再100 000r/min、4℃离心90min，放入-70℃冰箱内保存。1个月内测定TPK活性。
, 百拇医药
表1 银屑病患者T淋巴细胞膜酪氨酸蛋白激酶活性(
±s,fmol.mg-1蛋白) 组 别
例 数
基础状态
ConA刺激
2h
4h
8h
对照组
17
66.87±21.34
, http://www.100md.com
121.03±13.60
258.22±30.45
252.27±32.45
银屑病
22
25.05±8.62
67.14±6.05
250.63±39.23
339.84±42.07
t值
-
8.07
, 百拇医药
3.47
1.06
7.31
P值
-
<0.01
<0.01
>0.05
<0.01
3.T淋巴细胞膜TPK活性测定[3]：反应体系总体积50μL，含终浓度为20mmol/L Tris-HCl,pH7.0，50mmol/L MgCl2,25μmol/L正矾酸钠，0.1% Triton X-100,PolyGlu∶Tyr(4∶1)1mg/mL，膜蛋白10μg，反应以加入[γ-32P]-ATP(0.4μCi/管)启动，30℃反应5min。加入10μL 0.5mol/L EDTA,pH8.0，终止反应，对照管终止反应时加入PolyGlu∶Tyr(4∶1)。每个反应平行3管。取反应液40μL点样于0.22μm微孔滤膜，以10%三氯醋酸负压抽滤，LKLB-127型液体闪烁机计数。TPK的活性以每mg膜蛋白每分钟催化32P转入到多聚谷酪氨酸(4∶1)的fmol数减去自磷酸化的TPK活性值来表示。
, 百拇医药
4.统计学处理：采用第三军医大学数学教研室编制的《医用统计程序包SPMR》中的t检验。
二、结果
在基础状态下，正常人外周血T淋巴细胞TPK活性(66.87)显著高于银屑病组(25.05)(P<0.01)；当用ConA分别孵育2h、4h、8h，T淋巴细胞膜TPK活性呈现时间依赖性增高，但银屑病组反应明显强于正常人组，4h已基本达到至正常人水平，8h显著高于正常人对照组(P<0.01)。
三、讨论
TPK系统在淋巴细胞的免疫激活中具有重要的作用。本实验结果发现，在基础状态下，银屑病外周血T淋巴细胞TPK活性显著降低，T淋巴细胞TPK活性的降低将直接影响细胞免疫功能，这可能是引起银屑病中细胞免疫功能低下的重要原因。研究发现银屑病外周血中存在一种能在体外抑制正常人T淋巴细胞形成花环的因子，它与T细胞上CD2(即E花环受体)结合后，可使淋巴细胞功能低下[4]，但是否CD2分子的封闭是引起TPK活性降低的主要原因仍需进一步研究。ConA与T细胞具有高度亲合性，可使T细胞表面的E花环受体恢复或使阻断因子从细胞表面脱落。许桦等[5]发现随着孵育时间延长，T细胞E花环形成率逐渐增高，8h完全恢复正常。本研究结果示经过ConA孵育后，T淋巴细胞的TPK活性呈时间依赖性增高，4h已经达到正常，8h显著增高，推测可能是由于：1CD2功能的恢复，启动旁路激活途径；2银屑病T淋巴细胞存在多种TPK的活性增高，增高的TPK活性催化更多底物酪氨酸磷酸化；3TPK的负调节剂蛋白酪氨酸磷酸化酶的活性发生改变。对ConA刺激的不同反应提示银屑病中T细胞的TPK系统不同于正常人。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Norris DA, Travers JB, Leung DYM. Lymphocyte activation in the pathogenesis of psoriasis. J Invest Dermatol, 1997,109:1-4.
2 Klaausner RD. T cell receptor tyrosine phosphorylation. J Biol Chem, 1987,262:12654-12659.
3 Trevillyan JM, Nordstrom A, Linna TJ. High tyrosine-specific protein kinase activity in normal human peripheral blood lymphocytes. Biochem Biophys Acta, 1985;845:1-9.
4 Carno AM, Mason DW, Beyers AD, et al. Physical association of the cytoplamic domain of CD2 with the tyrosine kinase p56lck and p59fyn. Eur J Immunol, 1993,23:2196-2201.
5 桦, 姜凯， 蒋仲元， 等. 银屑病E花环功能和抑制因子的初步研究. 中华皮肤科杂志, 1985,18:73-75.
(收稿：1998-08-14 修回：1998-12-07), 百拇医药
单位：吕根法 471003 河南省洛阳市，解放军五三四医院皮肤科；李文维 伍津津 第三军医大学大坪医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志990226 银屑病是一种常见的炎性增生性皮肤病，尽管其发病机理目前尚不清楚，但表达HLA-2、白介素2(IL-2)受体等活化标志的T淋巴细胞在发病中的作用愈来愈受到人们的关注，局部浸润激活的T淋巴细胞一方面产生大量的生长因子/细胞因子，通过旁分泌作用于角质形成细胞直接刺激表皮增生；另一方面通过影响代谢，发挥促增生作用[1]。T淋巴细胞激活伴有酪氨酸残基的磷酸化，酪氨酸蛋白激酶(TPK)在淋巴细胞激活、分化调控中具有重要的生理功能[2]。我们通过对银屑病外周血T淋巴细胞TPK活性的研究，以探讨TPK在T淋巴细胞异常激活中的作用，为银屑病发病机理和治疗的研究提供一定的依据。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.标本来源：进行期寻常型银屑病22例，男13例，女9例，年龄18～45岁，平均年龄28.4岁；17例正常人对照组，男10例，女7例，年龄22～41岁，平均年龄26.3岁。两组性别、年龄无统计学差异。常规采取10mL全血加入柠檬酸钠抗凝。
2.T淋巴细胞膜制备[3]：全血用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞，再通过尼龙毛纯化出T淋巴细胞。加入刀豆素A(ConA)(每1×106T淋巴细胞加入20μg/mL)，37℃、5% CO2孵箱内分别孵育0h、2h、4h、8h。将T淋巴细胞置于匀浆液内(50mmol/L Tris, pH7.4,1mmol/L EGTA, 1.5mmol/L MgCl2,100mmol/L NaF,0.5mmol/L PMSF,250mmol/L庶糖，5mmol/L DTT)，冰水浴内匀浆破膜，1000r/min离心10min，上清液再100 000r/min、4℃离心90min，放入-70℃冰箱内保存。1个月内测定TPK活性。
, 百拇医药
表1 银屑病患者T淋巴细胞膜酪氨酸蛋白激酶活性(
±s,fmol.mg-1蛋白) 组 别例 数
基础状态
ConA刺激
2h
4h
8h
对照组
17
66.87±21.34
, http://www.100md.com
121.03±13.60
258.22±30.45
252.27±32.45
银屑病
22
25.05±8.62
67.14±6.05
250.63±39.23
339.84±42.07
t值
-
8.07
, 百拇医药
3.47
1.06
7.31
P值
-
<0.01
<0.01
>0.05
<0.01
3.T淋巴细胞膜TPK活性测定[3]：反应体系总体积50μL，含终浓度为20mmol/L Tris-HCl,pH7.0，50mmol/L MgCl2,25μmol/L正矾酸钠，0.1% Triton X-100,PolyGlu∶Tyr(4∶1)1mg/mL，膜蛋白10μg，反应以加入[γ-32P]-ATP(0.4μCi/管)启动，30℃反应5min。加入10μL 0.5mol/L EDTA,pH8.0，终止反应，对照管终止反应时加入PolyGlu∶Tyr(4∶1)。每个反应平行3管。取反应液40μL点样于0.22μm微孔滤膜，以10%三氯醋酸负压抽滤，LKLB-127型液体闪烁机计数。TPK的活性以每mg膜蛋白每分钟催化32P转入到多聚谷酪氨酸(4∶1)的fmol数减去自磷酸化的TPK活性值来表示。
, 百拇医药
4.统计学处理：采用第三军医大学数学教研室编制的《医用统计程序包SPMR》中的t检验。
二、结果
在基础状态下，正常人外周血T淋巴细胞TPK活性(66.87)显著高于银屑病组(25.05)(P<0.01)；当用ConA分别孵育2h、4h、8h，T淋巴细胞膜TPK活性呈现时间依赖性增高，但银屑病组反应明显强于正常人组，4h已基本达到至正常人水平，8h显著高于正常人对照组(P<0.01)。
三、讨论
TPK系统在淋巴细胞的免疫激活中具有重要的作用。本实验结果发现，在基础状态下，银屑病外周血T淋巴细胞TPK活性显著降低，T淋巴细胞TPK活性的降低将直接影响细胞免疫功能，这可能是引起银屑病中细胞免疫功能低下的重要原因。研究发现银屑病外周血中存在一种能在体外抑制正常人T淋巴细胞形成花环的因子，它与T细胞上CD2(即E花环受体)结合后，可使淋巴细胞功能低下[4]，但是否CD2分子的封闭是引起TPK活性降低的主要原因仍需进一步研究。ConA与T细胞具有高度亲合性，可使T细胞表面的E花环受体恢复或使阻断因子从细胞表面脱落。许桦等[5]发现随着孵育时间延长，T细胞E花环形成率逐渐增高，8h完全恢复正常。本研究结果示经过ConA孵育后，T淋巴细胞的TPK活性呈时间依赖性增高，4h已经达到正常，8h显著增高，推测可能是由于：1CD2功能的恢复，启动旁路激活途径；2银屑病T淋巴细胞存在多种TPK的活性增高，增高的TPK活性催化更多底物酪氨酸磷酸化；3TPK的负调节剂蛋白酪氨酸磷酸化酶的活性发生改变。对ConA刺激的不同反应提示银屑病中T细胞的TPK系统不同于正常人。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Norris DA, Travers JB, Leung DYM. Lymphocyte activation in the pathogenesis of psoriasis. J Invest Dermatol, 1997,109:1-4.
2 Klaausner RD. T cell receptor tyrosine phosphorylation. J Biol Chem, 1987,262:12654-12659.
3 Trevillyan JM, Nordstrom A, Linna TJ. High tyrosine-specific protein kinase activity in normal human peripheral blood lymphocytes. Biochem Biophys Acta, 1985;845:1-9.
4 Carno AM, Mason DW, Beyers AD, et al. Physical association of the cytoplamic domain of CD2 with the tyrosine kinase p56lck and p59fyn. Eur J Immunol, 1993,23:2196-2201.
5 桦, 姜凯， 蒋仲元， 等. 银屑病E花环功能和抑制因子的初步研究. 中华皮肤科杂志, 1985,18:73-75.
(收稿：1998-08-14 修回：1998-12-07), 百拇医药