凋亡调控蛋白在银屑病患者外周血淋巴细胞中的表达
作者：王继文 刘华昌 尹格平 孙晓明
单位：王继文 刘华昌 250031 济南，济南军区总医院皮肤科；尹格平 孙晓明 流式细胞室
关键词：
中华皮肤科杂志990225 有资料表明，淋巴细胞凋亡发生异常是导致免疫紊乱和一些疾病发生的重要原因[1]。我们应用流式细胞计数分析了凋亡调控蛋白Apo-1、Apo-2.7和Bcl-2在银屑病患者外周血淋巴细胞(PBLC)中的表达，旨在从凋亡的角度探讨银屑病的免疫发病机制。
一、病例和方法
(一)病例：寻常型银屑病患者30例，男26例，女4例；年龄21～56岁，平均33.3岁；病程1个月至15年，平均3年。所有患者均于治疗前后即进行期和缓解期各抽血1次，抽血前均以PASI给患者的病情程度计分[2]。健康对照20例，男17例，女3例；年龄20～52岁，平均35岁。
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(二)实验方法：
1.试剂及来源：异硫氰酸荧光素标记的Apo-1和Bcl-2单克隆抗体(Apo-1-FITC、Bcl-2-FITC)及藻红蛋白标记的Apo-2.7单克隆抗体(Apo-2.7-PE)均由法国国际免疫公司生产；淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液学研究所生产。
2.样品处理：晨取肘静脉血2mL，2% EDTA抗凝并悬浮于淋巴细胞分离液上，1500r/min离心15min，提取其中的淋巴细胞，加PBS 2mL漂洗，同速离心弃上清液，备用。
3.免疫反应：反应前调整细胞数至109/mL，分别取100μL样品放入3支试验管和3支对照管，试验管分别加20μL Apo-1-FITC、Bcl-2-FITC和Apo-2.7-PE。对照管分别加20μL IgG1-FITC、IgG1-FITC和IgG1-PE，室温避光反应30min，上机。
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4.流式细胞检测：仪器为FACScan型，美国Becton-Dickinson公司产品。上机前先用标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内，上机后收集10000个细胞，荧光强度以对数放大，测定光散射数据，结果采用Macintosh650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析。
(三)统计学处理：两样本均数U检验，Spearman等级相关分析。
二、结果
1.银屑病患者治疗前后即进行期和缓解期Apo-1、Apo-2.7、Bcl-2在淋巴细胞上的表达水平：见表1。
表1 不同阶段银屑病患者外周血淋巴细胞Apo-1、Apo-2.7和Bcl-2的表达水平(
±s,%) 组 别
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例 数
Apo-1
Apo-2.7
Bcl-2
健康对照组
20
0.53±0.24
0.90±0.62
35.87±5.35
银屑病组
进行期
30
5.59±2.86**△
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9.37±4.54**△
2.98±2.19**△△
缓解期
30
2.74±1.91*
4.70±3.01*
13.33±4.72**
注：与健康对照比较*P<0.05，**P<0.01；进行期与缓解期比较△P<0.05，△△P<0.01
2.相关分析显示：银屑病患者PBLC对Bcl-2的表达水平与PASI呈明显负相关(rs=-0.614,P<0.01)，与病程无关；Bcl-2与Apo-1、Apo-2.7亦呈负相关(rs值分别为-0.414、-0.443，P<0.05)；Apo-1与Apo-2.7呈正相关(rs=0.434,P<0.05)，二者在PBLC上的表达均与PASI呈正相关(rs=0.435、0.412,P<0.05)，而与病程不相关。
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三、讨论
Fas系统和Bcl-2家族是调节淋巴细胞凋亡最重要的两类基因[3]，其表达产物Apo-1、Apo-2.7和Bcl-2蛋白分布于淋巴细胞线粒体膜、内质网及细胞膜上，对淋巴细胞发育、分化、活化和清除有重要调节作用，是维护机体免疫自稳机制的基础[4，5]。其中Apo-1和Apo-2.7是促使淋巴细胞凋亡的蛋白，Bcl-2则是凋亡抑制蛋白[5，6]。实验结果显示银屑病患者PBLC表达Bcl-2的水平明显低于对照组，经中药及UVN光等治疗后病情缓解，Bcl-2水平也随之提高，但仍较对照组明显偏低，说明银屑病患者PBLC的抗凋亡水平下降。同时，银屑病患者PBLC的Apo-1、Apo-2.7水平均高于对照组，说明银屑病患者PBLC凋亡基因的表达水平上调。PBLC的凋亡基因过表达与抗凋亡基因失表达，两方面都使PBLC对凋亡的易感性增加。
相关分析显示PBLC表达Bcl-2的水平与PASI计分呈显著负相关，Apo-1和Apo-2.7则与PASI呈正相关，提示银屑病患者病情越重，淋巴细胞的凋亡调控失衡越明显，PBLC凋亡发生率越高。国内倪晓等[7]曾报道银屑病皮损中呈现大量角质形成细胞的凋亡形态，基底细胞表达Bcl-2的水平亦明显低于正常，可见银屑病角质形成细胞的凋亡亦存在调控失衡现象。细胞的凋亡及其调节是一个十分复杂的过程，银屑病患者PBLC和角质形成细胞凋亡之间的联系有待进一步研究。
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参考文献
1 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
2 Fredriksson T, Petterson U. Severe psoriasis-oral theraphy with a new retinoid. Dermatologica, 1978,157:238-244.
3 Mountz JD, Talal N. Retroviruses, apoptosis and autogenes. Immunol Today, 1993,14:532-536.
4 Schwartz LM, Osborne BA. Programed cell death apoptosis and killer genes. Immunol Today, 1993,14:582-590.
, http://www.100md.com
5 Zhang C, Ao Z, Seth A, et al. A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apopototic cells. J Immunol, 1996,157:3980-3987.
6 Kabelitz D, Pohl T, Pechhold K. Activation-induced cell death (apoptosis) of mature perepheral T lymphocytes. Immunol Today, 1993,14:338-339.
7 倪晓，孙建方，杨海平，等. 银屑病皮损中细胞凋亡的原位标记检测与bcl-2的表达. 中华皮肤科杂志, 1998,31:95-96.
(收稿：1998-04-06 修回：1998-08-13), http://www.100md.com
单位：王继文 刘华昌 250031 济南，济南军区总医院皮肤科；尹格平 孙晓明 流式细胞室
关键词：
中华皮肤科杂志990225 有资料表明，淋巴细胞凋亡发生异常是导致免疫紊乱和一些疾病发生的重要原因[1]。我们应用流式细胞计数分析了凋亡调控蛋白Apo-1、Apo-2.7和Bcl-2在银屑病患者外周血淋巴细胞(PBLC)中的表达，旨在从凋亡的角度探讨银屑病的免疫发病机制。
一、病例和方法
(一)病例：寻常型银屑病患者30例，男26例，女4例；年龄21～56岁，平均33.3岁；病程1个月至15年，平均3年。所有患者均于治疗前后即进行期和缓解期各抽血1次，抽血前均以PASI给患者的病情程度计分[2]。健康对照20例，男17例，女3例；年龄20～52岁，平均35岁。
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(二)实验方法：
1.试剂及来源：异硫氰酸荧光素标记的Apo-1和Bcl-2单克隆抗体(Apo-1-FITC、Bcl-2-FITC)及藻红蛋白标记的Apo-2.7单克隆抗体(Apo-2.7-PE)均由法国国际免疫公司生产；淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液学研究所生产。
2.样品处理：晨取肘静脉血2mL，2% EDTA抗凝并悬浮于淋巴细胞分离液上，1500r/min离心15min，提取其中的淋巴细胞，加PBS 2mL漂洗，同速离心弃上清液，备用。
3.免疫反应：反应前调整细胞数至109/mL，分别取100μL样品放入3支试验管和3支对照管，试验管分别加20μL Apo-1-FITC、Bcl-2-FITC和Apo-2.7-PE。对照管分别加20μL IgG1-FITC、IgG1-FITC和IgG1-PE，室温避光反应30min，上机。
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4.流式细胞检测：仪器为FACScan型，美国Becton-Dickinson公司产品。上机前先用标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内，上机后收集10000个细胞，荧光强度以对数放大，测定光散射数据，结果采用Macintosh650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析。
(三)统计学处理：两样本均数U检验，Spearman等级相关分析。
二、结果
1.银屑病患者治疗前后即进行期和缓解期Apo-1、Apo-2.7、Bcl-2在淋巴细胞上的表达水平：见表1。
表1 不同阶段银屑病患者外周血淋巴细胞Apo-1、Apo-2.7和Bcl-2的表达水平(
±s,%) 组 别, http://www.100md.com
例 数
Apo-1
Apo-2.7
Bcl-2
健康对照组
20
0.53±0.24
0.90±0.62
35.87±5.35
银屑病组
进行期
30
5.59±2.86**△
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9.37±4.54**△
2.98±2.19**△△
缓解期
30
2.74±1.91*
4.70±3.01*
13.33±4.72**
注：与健康对照比较*P<0.05，**P<0.01；进行期与缓解期比较△P<0.05，△△P<0.01
2.相关分析显示：银屑病患者PBLC对Bcl-2的表达水平与PASI呈明显负相关(rs=-0.614,P<0.01)，与病程无关；Bcl-2与Apo-1、Apo-2.7亦呈负相关(rs值分别为-0.414、-0.443，P<0.05)；Apo-1与Apo-2.7呈正相关(rs=0.434,P<0.05)，二者在PBLC上的表达均与PASI呈正相关(rs=0.435、0.412,P<0.05)，而与病程不相关。
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三、讨论
Fas系统和Bcl-2家族是调节淋巴细胞凋亡最重要的两类基因[3]，其表达产物Apo-1、Apo-2.7和Bcl-2蛋白分布于淋巴细胞线粒体膜、内质网及细胞膜上，对淋巴细胞发育、分化、活化和清除有重要调节作用，是维护机体免疫自稳机制的基础[4，5]。其中Apo-1和Apo-2.7是促使淋巴细胞凋亡的蛋白，Bcl-2则是凋亡抑制蛋白[5，6]。实验结果显示银屑病患者PBLC表达Bcl-2的水平明显低于对照组，经中药及UVN光等治疗后病情缓解，Bcl-2水平也随之提高，但仍较对照组明显偏低，说明银屑病患者PBLC的抗凋亡水平下降。同时，银屑病患者PBLC的Apo-1、Apo-2.7水平均高于对照组，说明银屑病患者PBLC凋亡基因的表达水平上调。PBLC的凋亡基因过表达与抗凋亡基因失表达，两方面都使PBLC对凋亡的易感性增加。
相关分析显示PBLC表达Bcl-2的水平与PASI计分呈显著负相关，Apo-1和Apo-2.7则与PASI呈正相关，提示银屑病患者病情越重，淋巴细胞的凋亡调控失衡越明显，PBLC凋亡发生率越高。国内倪晓等[7]曾报道银屑病皮损中呈现大量角质形成细胞的凋亡形态，基底细胞表达Bcl-2的水平亦明显低于正常，可见银屑病角质形成细胞的凋亡亦存在调控失衡现象。细胞的凋亡及其调节是一个十分复杂的过程，银屑病患者PBLC和角质形成细胞凋亡之间的联系有待进一步研究。
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参考文献
1 Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1462.
2 Fredriksson T, Petterson U. Severe psoriasis-oral theraphy with a new retinoid. Dermatologica, 1978,157:238-244.
3 Mountz JD, Talal N. Retroviruses, apoptosis and autogenes. Immunol Today, 1993,14:532-536.
4 Schwartz LM, Osborne BA. Programed cell death apoptosis and killer genes. Immunol Today, 1993,14:582-590.
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5 Zhang C, Ao Z, Seth A, et al. A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apopototic cells. J Immunol, 1996,157:3980-3987.
6 Kabelitz D, Pohl T, Pechhold K. Activation-induced cell death (apoptosis) of mature perepheral T lymphocytes. Immunol Today, 1993,14:338-339.
7 倪晓，孙建方，杨海平，等. 银屑病皮损中细胞凋亡的原位标记检测与bcl-2的表达. 中华皮肤科杂志, 1998,31:95-96.
(收稿：1998-04-06 修回：1998-08-13), http://www.100md.com