中药白芨促进角质形成细胞的游走
作者：陈德利 施伟民 徐 倩 高青云 朴英兰 沈亮亮
单位：200065上海铁道大学附属甘泉医院皮肤性病科
关键词：单方(中药)白芨角蛋白细胞器官培养
中华皮肤科杂志990306
【摘要】目的 探讨中药白芨对角质形成细胞游走的影响及其对创伤愈合的作用机制。方法 采用皮肤器官培养法(浮游法)培养SD小鼠皮片，比较观察了含不同浓度白芨的培养基对角质形成细胞游走的影响及培养时间与游走长度的关系。结果 发现白芨浓度为2×10-2mg/mL及2×10-3mg/mL时，角质形成细胞游走比对照组显著地快和长。含白芨组更早地显示游走迹象，较对照组早4h。培养48h内，白芨组及对照组中培养时间与游走长度皆呈直线正相关，白芨组的促游走作用显著地优于对照组。结论提示白芨有明显的促进角质形成细胞游走作用，这种促游走作用可能对治疗皮肤创伤早期愈合有重要影响。
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Rhizoma Blelillae Promotes the Migration of Keratinocyte
CHEN Deli, SHI Weiming,XU Qian, et al.Department of Dermatology, Ganquan Hospital, Shanghai Tiedao University, Shanghai 200065
【 Abstract】 Objective To investigate the effect of Rhizoma Bletillae(RB) on keratinocyte migration and its mechanism in the treatment of skin wound. Methods An organ culture technique of skin was applied to cultivate the skin explants of SD mice and a comparative analysis was processed to study the effect of RB on keratinocyte migration and the relationship between duration of culture and distance of migration. Results Keratinocyte migration could be significantly promoted by RB, especially at a concentration of 2 × 10-2 mg/mL or 2× 10-3 mg/mL. Compared with controls, keratinocytes migrate in RB medium with a much longer distance and earlier time (4 hours earlier) (P<0.05), the culture time and migration distance of both RB medium and controls had a linear correlation. Conclusion RB can markedly promote keratinocyte migration, which may play an important role in the early healing of skin wound.
, 百拇医药
【 Key words】 Single drug prescriptions Rhizoma Bletillae Keratinocytes Organ culture
祖国医学中用于治疗皮肤疮疡溃破的药物甚多[1]，但其作用机制不甚明了。近年来许多研究证明表皮的创伤愈合一般经过角质形成细胞的激活、游走、增生及基底膜的修复等过程[2]，其中角质形成细胞游走在创面覆盖与创伤愈合中起着关键的作用[3]。白芨为止血类中草药，可用于治疗溃疡久不愈合和手足皲裂等症。我们探讨了中药白芨对角质形成细胞游走的影响及其作用机制，现报道如下。
材料与方法
(一)动物来源：实验小鼠系由上海市放射医学研究所提供，上海医学实验动物管理委员会审核合格的红皮鼠品种，SD品系，普通级动物。
(二)动物皮肤样品处理：出生后24～72h的SD小鼠，先以颈折断法致死，再以75%酒精消毒皮肤，经背部切开，游离，取皮。用含青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、pH7.4、0.1mol/L，PBS清洗皮肤，尽量剪除皮下组织及真皮部，切成2mm×2mm大小皮片待用。
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(三)培养基：改良Eagle培养基(DMEM)为美国Gibicol,BRL,Life Technologies, Inc.产品，另加青霉素(100U/mL),链霉素(100μg/mL)和Hepes10mmol/L。含白芨培养基为基础，在培养基中加不同含量的白芨煎剂，白芨浓度分别为2×10-1mg/mL，2×10-2mg/mL，2×10-3mg/mL，2×10-4mg/mL。
(四)仪器：NAPCO，Model 5410 CO2培养箱；ModelTDGC2J-0.5超净工作台；37-XB倒置光学显微镜。
(五)培养条件与实验过程：采用皮肤器官培养法(浮游法)[4]，皮片表皮面朝上，浮游于培养皿的培养液上，进行表皮器官培养。培养皿置于含5%CO2，37℃CO2培养箱内，于要求培养时间内取皮、固定、包埋、组织切片、HE染色、显微镜下测量表皮游走长度(μm)。
, 百拇医药
(六)观察与统计方法：①比较观察含白芨及不含白芨培养基培养SD小鼠皮片对角质形成细胞游走的影响；②以不同浓度含白芨培养基培养SD小鼠皮片，24及48h培养后，观察其游走长度并与对照组比较，各种含白芨培养基培养的SD小鼠皮片游走长度均数与对照组间差别采用t检验；③观察含白芨培养基培养2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、48h的角质形成细胞游走长度并与对照组比较，角质形成细胞游走长度与培养时间的关系研究采用直线相关分析，连续48h培养，不同时间点含白芨组游走长度与对照组比较研究采用直线回归分析。
结果
(一)含白芨培养基培养后，角质形成细胞游走的形态学观察：含白芨培养基培养的SD小鼠皮片中角质形成细胞培养24、48、72h游走长度均长于对照组，培养时间越长差异越明显，培养72h差异最明显。
(二)含不同浓度白芨的培养基对角质形成细胞游走的影响：在含不同浓度白芨的DMEM液中培养SD小鼠皮片，观察其对角质形成细胞游走的影响，结果见表1。表1所示，①当白芨浓度为2×10-1mg/mL时，24、48h培养，游走长度皆长于正常对照组，但差异不显著；②浓度为2×10-2mg/mL及2×10-3mg/mL时，促游走作用明显优于对照组，差异具有显著性；③浓度为2×10-4mg/mL时，游走长度又接近于正常；④两组皮片培养48h皆长于培养24h。提示白芨有明显的促游走作用。
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表1加不同浓度白芨培养基对SD小鼠角质形成细胞游走长度的影响(
±s)
培养基
次数
24h
48h
长度(μm)
t值
P值
长度(μm)
t值
P值
, 百拇医药
正常对照
28
120±68
-
-
171±78
-
-
白芨(mg/mL)
2×10-1
14
149±15
1.57
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>0.05
206±24
1.62
>0.05
2×10-2
14
204±30
4.39
<0.05
295±20
5.82
<0.05
2×10-3
, http://www.100md.com
14
227±22
5.71
<0.05
286±34
5.25
<0.05
2×10-4
14
150±7
1.64
>0.05
207±27
, 百拇医药
1.67
>0.05
(三)加白芨培养基培养SD小鼠皮片的连续48h观察：通过对SD小鼠皮片在白芨组及对照组的48h器官培养，经连续观察，发现白芨组4h开始出现游走现象，较对照组早4h，白芨组与对照组皆随培养时间的延长游走长度增长，游走皮片增多。白芨组游走长度在各培养时间点皆长于对照组，经直线相关分析，r分别为0.96(P<0.01)、0.94(P<0.01)，提示两者的游走长度与培养时间皆呈非常显著的直线相关关系。经回归分析，b分别为5.85、3.616，回归系数t检验，t(b2-b1)=7.12，P<0.05，提示两回归直线差异显著。说明含白芨培养基有明显的促进角质形成细胞游走作用，与单纯DMEM培养组比较差异有显著性。
讨论
创伤愈合的研究是目前的一项重要课题，许多研究对创伤愈合的机制进行了较深入的探讨。皮肤创伤后，首先发生表皮收缩和角质形成细胞激活，数小时后激活的角质形成细胞开始游走，新表皮的形成过程本质上是创伤表面连续的角质形成细胞游走过程。尤其在创伤后48～96h，创面覆盖和皮包的形成与细胞有丝分裂无关，而是依靠角质形成细胞的游走[5]。中医中药在创伤治疗中积累了许多经验[6]，探索促进创伤愈合中药的作用机理显然是很有实用价值的。本实验通过研究中药白芨对角质形成细胞游走的影响，发现白芨治疗创伤作用可能是通过促进角质形成细胞游走的机制实现的。研究发现当浓度为2×10-2mg/mL及2×10-3mg/mL时，白芨显示非常明显的促游走作用。当浓度为2×10-4mg/mL时，游走长度长于对照组，但差异不显著，这可能是白芨浓度过低之故。当浓度为2×10-1mg/mL时，游走长度虽然长于对照组，但差异不显著。白芨的浓度梯度试验能很好地证明其促游走作用。进一步实验显示白芨能更早地激活角质形成细胞游走，比对照组早4h，在培养4h左右即出现角质形成细胞游走迹象，48h连续观察证实白芨组角质形成细胞游走长度皆明显长于对照组。显示白芨可能是以促使角质形成细胞更早更快地游走来实现其治疗创伤功能的。
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国家自然科学基金课题
参考文献
1 张介宾.景岳全书.第1版.北京:中国中医出版社,1994.927-954.
2 Zaccaria A. Laboratory classroom exercise:cell migration in cutaneous wound healing and pigmentary pattern formation in the red spoted newt. Int J Dev Biol, 1996,40:897- 901.
3 Omi T, Kawanami O, Matsuda K, et al. Histological characteristics of the healing process of frozen skin allograft used in the treatment of burns. Burns, 1996,22:106- 109.
, 百拇医药
4 陈德利,森冈真治,中岛澄乃,等.蛋白酶对表皮细胞游走的影响.中华皮肤科杂志,1989,22:384-386.
5 Douglas T, Porras RB, Mustoe TA, et al. Current concepts in wound healing: growth factor and macrophage interaction. J Trauma, 1990, 30:1297S- 1301S.
6 李时珍.本草纲目.第1版.北京:人民卫生出版社,1990.341-345.
(收稿：1998-06-19修回：1998-09-24), 百拇医药
单位：200065上海铁道大学附属甘泉医院皮肤性病科
关键词：单方(中药)白芨角蛋白细胞器官培养
中华皮肤科杂志990306
【摘要】目的 探讨中药白芨对角质形成细胞游走的影响及其对创伤愈合的作用机制。方法 采用皮肤器官培养法(浮游法)培养SD小鼠皮片，比较观察了含不同浓度白芨的培养基对角质形成细胞游走的影响及培养时间与游走长度的关系。结果 发现白芨浓度为2×10-2mg/mL及2×10-3mg/mL时，角质形成细胞游走比对照组显著地快和长。含白芨组更早地显示游走迹象，较对照组早4h。培养48h内，白芨组及对照组中培养时间与游走长度皆呈直线正相关，白芨组的促游走作用显著地优于对照组。结论提示白芨有明显的促进角质形成细胞游走作用，这种促游走作用可能对治疗皮肤创伤早期愈合有重要影响。
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Rhizoma Blelillae Promotes the Migration of Keratinocyte
CHEN Deli, SHI Weiming,XU Qian, et al.Department of Dermatology, Ganquan Hospital, Shanghai Tiedao University, Shanghai 200065
【 Abstract】 Objective To investigate the effect of Rhizoma Bletillae(RB) on keratinocyte migration and its mechanism in the treatment of skin wound. Methods An organ culture technique of skin was applied to cultivate the skin explants of SD mice and a comparative analysis was processed to study the effect of RB on keratinocyte migration and the relationship between duration of culture and distance of migration. Results Keratinocyte migration could be significantly promoted by RB, especially at a concentration of 2 × 10-2 mg/mL or 2× 10-3 mg/mL. Compared with controls, keratinocytes migrate in RB medium with a much longer distance and earlier time (4 hours earlier) (P<0.05), the culture time and migration distance of both RB medium and controls had a linear correlation. Conclusion RB can markedly promote keratinocyte migration, which may play an important role in the early healing of skin wound.
, 百拇医药
【 Key words】 Single drug prescriptions Rhizoma Bletillae Keratinocytes Organ culture
祖国医学中用于治疗皮肤疮疡溃破的药物甚多[1]，但其作用机制不甚明了。近年来许多研究证明表皮的创伤愈合一般经过角质形成细胞的激活、游走、增生及基底膜的修复等过程[2]，其中角质形成细胞游走在创面覆盖与创伤愈合中起着关键的作用[3]。白芨为止血类中草药，可用于治疗溃疡久不愈合和手足皲裂等症。我们探讨了中药白芨对角质形成细胞游走的影响及其作用机制，现报道如下。
材料与方法
(一)动物来源：实验小鼠系由上海市放射医学研究所提供，上海医学实验动物管理委员会审核合格的红皮鼠品种，SD品系，普通级动物。
(二)动物皮肤样品处理：出生后24～72h的SD小鼠，先以颈折断法致死，再以75%酒精消毒皮肤，经背部切开，游离，取皮。用含青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、pH7.4、0.1mol/L，PBS清洗皮肤，尽量剪除皮下组织及真皮部，切成2mm×2mm大小皮片待用。
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(三)培养基：改良Eagle培养基(DMEM)为美国Gibicol,BRL,Life Technologies, Inc.产品，另加青霉素(100U/mL),链霉素(100μg/mL)和Hepes10mmol/L。含白芨培养基为基础，在培养基中加不同含量的白芨煎剂，白芨浓度分别为2×10-1mg/mL，2×10-2mg/mL，2×10-3mg/mL，2×10-4mg/mL。
(四)仪器：NAPCO，Model 5410 CO2培养箱；ModelTDGC2J-0.5超净工作台；37-XB倒置光学显微镜。
(五)培养条件与实验过程：采用皮肤器官培养法(浮游法)[4]，皮片表皮面朝上，浮游于培养皿的培养液上，进行表皮器官培养。培养皿置于含5%CO2，37℃CO2培养箱内，于要求培养时间内取皮、固定、包埋、组织切片、HE染色、显微镜下测量表皮游走长度(μm)。
, 百拇医药
(六)观察与统计方法：①比较观察含白芨及不含白芨培养基培养SD小鼠皮片对角质形成细胞游走的影响；②以不同浓度含白芨培养基培养SD小鼠皮片，24及48h培养后，观察其游走长度并与对照组比较，各种含白芨培养基培养的SD小鼠皮片游走长度均数与对照组间差别采用t检验；③观察含白芨培养基培养2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、48h的角质形成细胞游走长度并与对照组比较，角质形成细胞游走长度与培养时间的关系研究采用直线相关分析，连续48h培养，不同时间点含白芨组游走长度与对照组比较研究采用直线回归分析。
结果
(一)含白芨培养基培养后，角质形成细胞游走的形态学观察：含白芨培养基培养的SD小鼠皮片中角质形成细胞培养24、48、72h游走长度均长于对照组，培养时间越长差异越明显，培养72h差异最明显。
(二)含不同浓度白芨的培养基对角质形成细胞游走的影响：在含不同浓度白芨的DMEM液中培养SD小鼠皮片，观察其对角质形成细胞游走的影响，结果见表1。表1所示，①当白芨浓度为2×10-1mg/mL时，24、48h培养，游走长度皆长于正常对照组，但差异不显著；②浓度为2×10-2mg/mL及2×10-3mg/mL时，促游走作用明显优于对照组，差异具有显著性；③浓度为2×10-4mg/mL时，游走长度又接近于正常；④两组皮片培养48h皆长于培养24h。提示白芨有明显的促游走作用。
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表1加不同浓度白芨培养基对SD小鼠角质形成细胞游走长度的影响(
±s)培养基
次数
24h
48h
长度(μm)
t值
P值
长度(μm)
t值
P值
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正常对照
28
120±68
-
-
171±78
-
-
白芨(mg/mL)
2×10-1
14
149±15
1.57
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>0.05
206±24
1.62
>0.05
2×10-2
14
204±30
4.39
<0.05
295±20
5.82
<0.05
2×10-3
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14
227±22
5.71
<0.05
286±34
5.25
<0.05
2×10-4
14
150±7
1.64
>0.05
207±27
, 百拇医药
1.67
>0.05
(三)加白芨培养基培养SD小鼠皮片的连续48h观察：通过对SD小鼠皮片在白芨组及对照组的48h器官培养，经连续观察，发现白芨组4h开始出现游走现象，较对照组早4h，白芨组与对照组皆随培养时间的延长游走长度增长，游走皮片增多。白芨组游走长度在各培养时间点皆长于对照组，经直线相关分析，r分别为0.96(P<0.01)、0.94(P<0.01)，提示两者的游走长度与培养时间皆呈非常显著的直线相关关系。经回归分析，b分别为5.85、3.616，回归系数t检验，t(b2-b1)=7.12，P<0.05，提示两回归直线差异显著。说明含白芨培养基有明显的促进角质形成细胞游走作用，与单纯DMEM培养组比较差异有显著性。
讨论
创伤愈合的研究是目前的一项重要课题，许多研究对创伤愈合的机制进行了较深入的探讨。皮肤创伤后，首先发生表皮收缩和角质形成细胞激活，数小时后激活的角质形成细胞开始游走，新表皮的形成过程本质上是创伤表面连续的角质形成细胞游走过程。尤其在创伤后48～96h，创面覆盖和皮包的形成与细胞有丝分裂无关，而是依靠角质形成细胞的游走[5]。中医中药在创伤治疗中积累了许多经验[6]，探索促进创伤愈合中药的作用机理显然是很有实用价值的。本实验通过研究中药白芨对角质形成细胞游走的影响，发现白芨治疗创伤作用可能是通过促进角质形成细胞游走的机制实现的。研究发现当浓度为2×10-2mg/mL及2×10-3mg/mL时，白芨显示非常明显的促游走作用。当浓度为2×10-4mg/mL时，游走长度长于对照组，但差异不显著，这可能是白芨浓度过低之故。当浓度为2×10-1mg/mL时，游走长度虽然长于对照组，但差异不显著。白芨的浓度梯度试验能很好地证明其促游走作用。进一步实验显示白芨能更早地激活角质形成细胞游走，比对照组早4h，在培养4h左右即出现角质形成细胞游走迹象，48h连续观察证实白芨组角质形成细胞游走长度皆明显长于对照组。显示白芨可能是以促使角质形成细胞更早更快地游走来实现其治疗创伤功能的。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金课题
参考文献
1 张介宾.景岳全书.第1版.北京:中国中医出版社,1994.927-954.
2 Zaccaria A. Laboratory classroom exercise:cell migration in cutaneous wound healing and pigmentary pattern formation in the red spoted newt. Int J Dev Biol, 1996,40:897- 901.
3 Omi T, Kawanami O, Matsuda K, et al. Histological characteristics of the healing process of frozen skin allograft used in the treatment of burns. Burns, 1996,22:106- 109.
, 百拇医药
4 陈德利,森冈真治,中岛澄乃,等.蛋白酶对表皮细胞游走的影响.中华皮肤科杂志,1989,22:384-386.
5 Douglas T, Porras RB, Mustoe TA, et al. Current concepts in wound healing: growth factor and macrophage interaction. J Trauma, 1990, 30:1297S- 1301S.
6 李时珍.本草纲目.第1版.北京:人民卫生出版社,1990.341-345.
(收稿：1998-06-19修回：1998-09-24), 百拇医药