连接酶链反应用于淋病的诊断
作者：徐克沂 CarolynMBlack
单位：徐克沂 100011北京地坛医院性传播疾病防治中心；CarolynMBlack 美国疾病控制中心性传播疾病部
关键词：淋病培养聚合酶链反应连接酶链反应
中华皮肤科杂志990302
【摘要】目的 评价连接酶链反应(LCR)技术对淋病诊断的意义。方法对在计划生育门诊就诊的330例女性患者进行细菌培养及LCR检测，对两项结果不符的标本进行聚合酶链反应检测，实验结果应用EpiInfo软件进行分析。结果 330例患者中30例LCR检测阳性(9.1%)，27例培养阳性(8.2%)，13例两项结果不符者进行聚合酶链反应检测。结果表明LCR的敏感性及特异性分别为89%及99.7%。结论 LCR用于淋病的诊断具有较高的敏感性及特异性。
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Diagnosis of Neisseria Gonorrhoeae with Ligase Chain Reaction
XU Keyi* , Carolyn M Black. *
Beijing Ditan Hospital , Beijing 100011
【 Abstract】 Objective To evaluate the value of ligase chain reaction (LCR) in the diagnosis of gonorrhoea. Methods A comparative evaluation of LCR and cell culture was performed in 330 women in a family planning clinic. For resolving discordant specimens between the two tests, polymerase chain reaction was used. The result of tests was analysed with EPIINFO software. Results 30 of 330(9.0% ) women had positive LCR results and 27 of 330(8.2% ) were positive for cell culture. 13 specimens were discordant for LCR and cell culture. The sensitivity and specificity of LCR in the diagnosis of gonorrhoea were 89% and 99.7% respectively. Conclusion This study shows that LCR has a higher sensitivity and specificity for the diagnosis of gonorrhoea.
, 百拇医药
【 Key words】 Neisseria gonorrhoeae Culture Ligase chain reaction Polymerase chain reaction
近年来分子生物学研究取得了迅速进展，基因扩增技术在医学研究和临床诊断中得到广泛应用。连接酶链反应(ligasechainreaction，LCR)是继聚合酶链反应(PCR)之后新发展起来的一项具有良好应用前景的基因扩增技术[1]。其反应原理是用于扩增目的基因的两对特异性引物的连接处设计有数个碱基的缺口，在进行基因扩增反应时，由TaqDNA聚合酶作用填补空缺，由连接酶作用封口。两对特异性引物均标有两种不同的半抗原。在反应过程中一端半抗原与微粒上包被的抗体结合，一端与酶标抗体结合，经底物显色后可直接利用自动分析仪进行分析[2]。我们通过对330例到计划生育门诊就诊的患者进行LCR、PCR及细菌培养，评价LCR技术诊断淋病的意义。
材料与方法
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1.标本来源：对1994年5月至1996年1月期间，330例计划生育门诊就诊的女性患者进行淋球菌培养和LCR筛查。取较长时间不排尿的初次尿液做LCR及PCR分析，取宫颈拭子标本进行细菌培养。
2.细菌培养：宫颈拭子接种于GC培养基(美国Difco公司)36℃，3%CO2培养12h。阴性标本再延续培养24h。含有典型革兰染色阴性球菌的菌落以氧化酶试验进行鉴定。
3.LCR分析：使用美国Abbott公司的淋球菌LCR诊断试剂盒(LCx)进行检测。尿液标本混合后吸取1mL，加入LCx标本试管中，9000g离心15min，去掉上清液，保留沉淀，加入1mLLCx标本处理液，混匀，使沉淀溶解。将标本97℃加热15min后取100μL溶液，加入PCR试管中，同时加入含有两对特异性引物LCR反应液。使用PE4800PCR仪(美国PerkinElmer公司)进行基因扩增。93℃变性1min，59℃复性1min，72℃延伸1min10s，共40个循环。将扩增产物转入LCx自动分析仪进行分析。
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4.PCR分析：LCR与细菌培养结果不符的标本加做PCR试验。其特异性引物序列为：JD1a5′TGTTTTCCTGCTCTAGCTCTGC3′和JD1d5′GAGCTTGCTAGGTATATCGGCG3′靶基因为377bp的质粒片段。将经过处理用于LCR分析的尿液标本，经过CentriSep过柱处理后作为模板，应用PE4800PCR仪进行基因扩增。第1个循环95℃5min变性，然后95℃1min，65℃1min，72℃1min，共30个循环，最后1个循环加做72℃7min延伸。试验结果以3%Nusieve凝胶EB染色分析。
5.统计学处理：试验结果输入EpiInfo软件进行处理。有两项以上试验结果阳性的标本判断为阳性[3]。
1：DNA分子量标准Ⅺ(BoehringerMannheim),2:阳性对照，3～15:PCR扩增结果，16：阴性对照
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图1PCR检测结果
结果
330例患者中27例淋球菌培养阳性，阳性率为8.2%。30例LCR检测阳性，阳性率为9.1%。其中22例淋球菌培养及LCR检测均为阳性。8例LCR阳性淋球菌培养阴性，5例培养阳性LCR阴性。这13例两项结果不符的标本再进行PCR检测(图1)。8例LCR阳性者中7例PCR阳性。5例培养阳性者中4例PCR阳性。将以上结果输入EpiInfo软件进行分析，确定淋病LCR检测的敏感性为89%，特异性为99.7%。淋球菌培养的敏感性为80%，特异性为99.7%。
讨论
淋病的发病率目前在我国性传播疾病中占首位，是国家重点防治的性传播疾病之一[3]。敏感、特异的诊断方法是进行淋病防治工作的前提。细菌培养一直是淋病诊断的金标准。但淋球菌对外界抵抗力很低，生长条件苛刻，其敏感性易受多种条件制约[4]。尤其是近年来不少患者在就诊前已接受过非正规的抗生素治疗，细菌培养更加困难。LCR技术不须依赖标本中的活菌数，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以扩增出大量目的DNA。LCx淋球菌LCR反应扩增的目的基因为48bp的淋球菌染色体Opa1基因片段，经过40个反应周期可使目的基因扩增105倍以上。直接利用尿液标本，无创取材，减轻了患者的痛苦，操作简便快捷，结果准确，较之细菌培养有许多优点。本组患者中LCR的敏感性为89%，淋球菌培养为80%，两者的特异性接近100%(99.7%)。为了对这两项结果不符的标本进行分析，我们设计PCR方法，扩增377bp的淋球菌质粒基因片断。在图1中出现了377bp及227bp两种不同的结果是因为在这一区域内存在基因变异[5]。在这330例患者中，30例LCR检测阳性，阳性率为9.1%；28例细菌培养阳性，阳性率为8.2%。8例LCR阳性而细菌培养阴性的标本经PCR检测证实7例阳性，1例为假阳性，其原因考虑为标本污染所致。5例培养阳性LCR阴性的标本4例PCR阳性，1例阴性。文献报道由于在某些标本中可能存在抑制因子，造成LCR反应阳性率下降，这4例细菌培养及PCR反应均阳性而LCR反应阴性的原因考虑可能为上述原因所致，如能预先对标本进行一定处理则可使其敏感性进一步提高。
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参考文献
1 Wu DY, Wallace B. The ligation amplification reaction amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template dependent ligation. Genomics, 1989,4:560- 569.
2 Smith KR, Ching S, Lee H, et al. Evaluation of ligase chain reaction for use with urine for identification of Neisseria gonorrhoeae in females attending a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol, 1995,33:455- 457.
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3 卫生部防疫司.性病防治手册.南京：江苏科学技术出版社,1995.29-30.
4 Goodhart ME, Ogden J, Zaidi AA, et al. Factors affecting the performance of smear and culture test for the detection of Neisseria gonorrhoeae. Sex Transm Dis, 1982,9:74- 78.
5 Hagblom P, Korch C, Jonsson A, et al. Intragenic variation by site specific recombination in the cryptic plasmid of Neisseria gonorrhoeae. J Bacterial, 1986,167:231- 237.
(收稿：1998-07-21修回：1998-09-14), http://www.100md.com
单位：徐克沂 100011北京地坛医院性传播疾病防治中心；CarolynMBlack 美国疾病控制中心性传播疾病部
关键词：淋病培养聚合酶链反应连接酶链反应
中华皮肤科杂志990302
【摘要】目的 评价连接酶链反应(LCR)技术对淋病诊断的意义。方法对在计划生育门诊就诊的330例女性患者进行细菌培养及LCR检测，对两项结果不符的标本进行聚合酶链反应检测，实验结果应用EpiInfo软件进行分析。结果 330例患者中30例LCR检测阳性(9.1%)，27例培养阳性(8.2%)，13例两项结果不符者进行聚合酶链反应检测。结果表明LCR的敏感性及特异性分别为89%及99.7%。结论 LCR用于淋病的诊断具有较高的敏感性及特异性。
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Diagnosis of Neisseria Gonorrhoeae with Ligase Chain Reaction
XU Keyi* , Carolyn M Black. *
Beijing Ditan Hospital , Beijing 100011
【 Abstract】 Objective To evaluate the value of ligase chain reaction (LCR) in the diagnosis of gonorrhoea. Methods A comparative evaluation of LCR and cell culture was performed in 330 women in a family planning clinic. For resolving discordant specimens between the two tests, polymerase chain reaction was used. The result of tests was analysed with EPIINFO software. Results 30 of 330(9.0% ) women had positive LCR results and 27 of 330(8.2% ) were positive for cell culture. 13 specimens were discordant for LCR and cell culture. The sensitivity and specificity of LCR in the diagnosis of gonorrhoea were 89% and 99.7% respectively. Conclusion This study shows that LCR has a higher sensitivity and specificity for the diagnosis of gonorrhoea.
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【 Key words】 Neisseria gonorrhoeae Culture Ligase chain reaction Polymerase chain reaction
近年来分子生物学研究取得了迅速进展，基因扩增技术在医学研究和临床诊断中得到广泛应用。连接酶链反应(ligasechainreaction，LCR)是继聚合酶链反应(PCR)之后新发展起来的一项具有良好应用前景的基因扩增技术[1]。其反应原理是用于扩增目的基因的两对特异性引物的连接处设计有数个碱基的缺口，在进行基因扩增反应时，由TaqDNA聚合酶作用填补空缺，由连接酶作用封口。两对特异性引物均标有两种不同的半抗原。在反应过程中一端半抗原与微粒上包被的抗体结合，一端与酶标抗体结合，经底物显色后可直接利用自动分析仪进行分析[2]。我们通过对330例到计划生育门诊就诊的患者进行LCR、PCR及细菌培养，评价LCR技术诊断淋病的意义。
材料与方法
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1.标本来源：对1994年5月至1996年1月期间，330例计划生育门诊就诊的女性患者进行淋球菌培养和LCR筛查。取较长时间不排尿的初次尿液做LCR及PCR分析，取宫颈拭子标本进行细菌培养。
2.细菌培养：宫颈拭子接种于GC培养基(美国Difco公司)36℃，3%CO2培养12h。阴性标本再延续培养24h。含有典型革兰染色阴性球菌的菌落以氧化酶试验进行鉴定。
3.LCR分析：使用美国Abbott公司的淋球菌LCR诊断试剂盒(LCx)进行检测。尿液标本混合后吸取1mL，加入LCx标本试管中，9000g离心15min，去掉上清液，保留沉淀，加入1mLLCx标本处理液，混匀，使沉淀溶解。将标本97℃加热15min后取100μL溶液，加入PCR试管中，同时加入含有两对特异性引物LCR反应液。使用PE4800PCR仪(美国PerkinElmer公司)进行基因扩增。93℃变性1min，59℃复性1min，72℃延伸1min10s，共40个循环。将扩增产物转入LCx自动分析仪进行分析。
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4.PCR分析：LCR与细菌培养结果不符的标本加做PCR试验。其特异性引物序列为：JD1a5′TGTTTTCCTGCTCTAGCTCTGC3′和JD1d5′GAGCTTGCTAGGTATATCGGCG3′靶基因为377bp的质粒片段。将经过处理用于LCR分析的尿液标本，经过CentriSep过柱处理后作为模板，应用PE4800PCR仪进行基因扩增。第1个循环95℃5min变性，然后95℃1min，65℃1min，72℃1min，共30个循环，最后1个循环加做72℃7min延伸。试验结果以3%Nusieve凝胶EB染色分析。
5.统计学处理：试验结果输入EpiInfo软件进行处理。有两项以上试验结果阳性的标本判断为阳性[3]。
1：DNA分子量标准Ⅺ(BoehringerMannheim),2:阳性对照，3～15:PCR扩增结果，16：阴性对照
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图1PCR检测结果
结果
330例患者中27例淋球菌培养阳性，阳性率为8.2%。30例LCR检测阳性，阳性率为9.1%。其中22例淋球菌培养及LCR检测均为阳性。8例LCR阳性淋球菌培养阴性，5例培养阳性LCR阴性。这13例两项结果不符的标本再进行PCR检测(图1)。8例LCR阳性者中7例PCR阳性。5例培养阳性者中4例PCR阳性。将以上结果输入EpiInfo软件进行分析，确定淋病LCR检测的敏感性为89%，特异性为99.7%。淋球菌培养的敏感性为80%，特异性为99.7%。
讨论
淋病的发病率目前在我国性传播疾病中占首位，是国家重点防治的性传播疾病之一[3]。敏感、特异的诊断方法是进行淋病防治工作的前提。细菌培养一直是淋病诊断的金标准。但淋球菌对外界抵抗力很低，生长条件苛刻，其敏感性易受多种条件制约[4]。尤其是近年来不少患者在就诊前已接受过非正规的抗生素治疗，细菌培养更加困难。LCR技术不须依赖标本中的活菌数，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以扩增出大量目的DNA。LCx淋球菌LCR反应扩增的目的基因为48bp的淋球菌染色体Opa1基因片段，经过40个反应周期可使目的基因扩增105倍以上。直接利用尿液标本，无创取材，减轻了患者的痛苦，操作简便快捷，结果准确，较之细菌培养有许多优点。本组患者中LCR的敏感性为89%，淋球菌培养为80%，两者的特异性接近100%(99.7%)。为了对这两项结果不符的标本进行分析，我们设计PCR方法，扩增377bp的淋球菌质粒基因片断。在图1中出现了377bp及227bp两种不同的结果是因为在这一区域内存在基因变异[5]。在这330例患者中，30例LCR检测阳性，阳性率为9.1%；28例细菌培养阳性，阳性率为8.2%。8例LCR阳性而细菌培养阴性的标本经PCR检测证实7例阳性，1例为假阳性，其原因考虑为标本污染所致。5例培养阳性LCR阴性的标本4例PCR阳性，1例阴性。文献报道由于在某些标本中可能存在抑制因子，造成LCR反应阳性率下降，这4例细菌培养及PCR反应均阳性而LCR反应阴性的原因考虑可能为上述原因所致，如能预先对标本进行一定处理则可使其敏感性进一步提高。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Wu DY, Wallace B. The ligation amplification reaction amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template dependent ligation. Genomics, 1989,4:560- 569.
2 Smith KR, Ching S, Lee H, et al. Evaluation of ligase chain reaction for use with urine for identification of Neisseria gonorrhoeae in females attending a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol, 1995,33:455- 457.
, 百拇医药
3 卫生部防疫司.性病防治手册.南京：江苏科学技术出版社,1995.29-30.
4 Goodhart ME, Ogden J, Zaidi AA, et al. Factors affecting the performance of smear and culture test for the detection of Neisseria gonorrhoeae. Sex Transm Dis, 1982,9:74- 78.
5 Hagblom P, Korch C, Jonsson A, et al. Intragenic variation by site specific recombination in the cryptic plasmid of Neisseria gonorrhoeae. J Bacterial, 1986,167:231- 237.
(收稿：1998-07-21修回：1998-09-14), http://www.100md.com