31P核磁共振在表皮磷脂检测中的应用
作者：杨勤萍 方 丽 王侠生 李祖义
单位：杨勤萍 方丽 王侠生 200040上海医科大学皮肤病研究所；李祖义 中国科学院上海有机化学研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990327
磷脂是生物膜的重要组成部分，对维持细胞的完整、保持生物膜的正常物理特性(细胞的粘附和流动)及细胞的正常代谢起重要作用[1，2]。对磷脂各组分的测定，可了解磷脂在表皮正常代谢及异常代谢中所发生的改变，探索精确的测定方法是关键所在。为此我们采用了31P核磁共振法和高效薄层扫描法对正常表皮的磷脂组分进行了定性和定量分析，从而比较这2种检测方法的优缺点，为今后的脂质分析提供了一种快速精确的方法。
一、材料和方法
, http://www.100md.com (一)试剂和仪器：
1.脂质标准样品：磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、神经鞘磷脂(SPH)、心磷脂(CL)和溶血卵磷脂(LPC)为Sigma公司产品。磷脂酸(PA)、卵磷脂(PC)为Supelco公司产品。
2.氯仿、氘代氯仿、甲醇、Dittmerlester钼蓝显色剂等。
3.薄板：采用E.Merck,HPTLC Silica Gel60 F254，德国产。
4.薄层扫描仪：日本岛津CS-910型双波长薄层色谱扫描仪，配模拟积分器。
5.300兆核磁共振仪：瑞士Bruker公司产品，AM-300。
(二)对象及取材：正常人5例，均为男性，年龄28±12(22～41)岁。皮肤取自腹部，在室温下，应用解剖刀仔细刮除皮下脂肪，再刮薄真皮，然后将真皮层向下置于浸过0.3%胰蛋白酶去离子水的纱布上，放入清洁培养皿中，置于4℃冰箱保存22～23h，取出后用手术刀片轻轻一刮，表真皮分离，然后用氯仿∶甲醇(2∶1、v/v)抽提并纯化、蒸干表皮脂质。
, 百拇医药
(三)实验方法：
1.高效薄层扫描法：分别取上述脂质约1mg左右溶于0.5mL氯仿∶甲醇(2∶1v/v)中，展开剂为氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4v/v)，显色剂采用DittmerLester钼蓝显色剂，底色为白色，磷脂斑点为蓝色，用岛津双波长薄层扫描仪，以波长720nm作反射吸收光谱扫描，由模拟积分器打印出薄板上磷脂的峰面积及相对百分含量。
2.300兆核磁共振分析法：用柱层析法分别将上述多余表皮脂质分离并纯化磷脂，蒸干后溶于1mL氘代氯仿中，放入直径为5mm标准核磁管中，化学位移以85%H3PO4及氘代氯仿为内标，低场为正，高场为负，测试温度为20℃，湿度45%，根据31PNMR图谱，由积分曲线的高度算出各种磷脂化合物的摩尔百分比(mol%P)。
二、结果
应用高效薄层扫描法测定各组表皮磷脂百分含量，结果显示PC含量最高，为41.76±6.53%，其余依次为SPH(22.83±3.8%)、PE(21.52±3.89%)、PI+PS(12.17±2.29%，由于在单向薄层扫描中PI和PS的斑点重叠所致)。
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应用31PNMR方法测定正常人表皮磷脂各组成含量，以PC含量最高，为38.70±0.96%，其余依次为SPH(20.84±1.38)、PE(20.02±1.04)、PI(8.54±1.74)、CL(3.38±0.62)、PS(2.90±0.52)、PA(2.26±0.23)、LPC(1.46±0.24)，并出现一个未知磷脂(1.89±0.15)。
三、讨论
本实验采用高效薄层扫描法测定磷脂的组成及含量，结果与以往文献报道一致[3]。而31PNMR方法应用于皮肤磷脂的检测，主要结果与高效薄层扫描法相近，但31PNMR尚可检测到钼蓝溶液不能显色的CL和PA，并能将PI和PS完全分开，还发现一个含量较少的未知磷脂，有待于今后进一步研究证实。
高效薄层扫描法是以往最常用于脂质分析的一种方法，它具有快速、灵敏和分析范围广等优点，且所需样本量很少，一般仅需数10μg即可，但受较多条件的影响，如制备薄板硅胶的型号和均匀度，显色后与扫描的时间差等，只有在相同的实验条件下，才能得到较好的重复性，并且在定量测定中标准品不易得到。施邑屏等[4]曾对TLC法和31PNMR方法进行重复试验，结果提示前者准确性和重复性不如后者，TCL的相对误差为3左右，而31PNMR法一般为1.5以下。
, 百拇医药
31PNMR分析法是近年来发展起来的化学检测手段，可用来测定不同结构中P原子的化学位移以确定磷脂质的结构，对被测样品进行定性及定量分析。它更具有快速、灵敏、干扰因素小，准确性较高，深入物质内部而不破坏被测物质等优点，从而极大地弥补了其它测定方法的缺点。但本法样品纯度要求高，样品需要量较多，一般应用90兆NMR仪测定需样品30～60mg，用300兆NMR仪需10mg以上。
参考文献
1 Wertz PW. Epidermal lipids. Semin Dermatol, 1992,11:106- 113.
2 Schurer NY, Plewig G, Elias PM. Stratum corneum lipid function. Dermatologica, 1991,183:77- 94.
3 Grag GM, Yardley HJ. Lipid compositions of cells isolated from pig, human and rat epidermis. J Lipid Res, 1975,16:434- 439.
4施邑屏，黎燕斌，孙玲玲，等.31P核磁共振光谱及薄层色谱分析针剂大豆卵磷脂.分析化学,1991,19:733-736.
(收稿：1998-06-22修回：1998-12-26), http://www.100md.com
单位：杨勤萍 方丽 王侠生 200040上海医科大学皮肤病研究所；李祖义 中国科学院上海有机化学研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990327
磷脂是生物膜的重要组成部分，对维持细胞的完整、保持生物膜的正常物理特性(细胞的粘附和流动)及细胞的正常代谢起重要作用[1，2]。对磷脂各组分的测定，可了解磷脂在表皮正常代谢及异常代谢中所发生的改变，探索精确的测定方法是关键所在。为此我们采用了31P核磁共振法和高效薄层扫描法对正常表皮的磷脂组分进行了定性和定量分析，从而比较这2种检测方法的优缺点，为今后的脂质分析提供了一种快速精确的方法。
一、材料和方法
, http://www.100md.com (一)试剂和仪器：
1.脂质标准样品：磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、神经鞘磷脂(SPH)、心磷脂(CL)和溶血卵磷脂(LPC)为Sigma公司产品。磷脂酸(PA)、卵磷脂(PC)为Supelco公司产品。
2.氯仿、氘代氯仿、甲醇、Dittmerlester钼蓝显色剂等。
3.薄板：采用E.Merck,HPTLC Silica Gel60 F254，德国产。
4.薄层扫描仪：日本岛津CS-910型双波长薄层色谱扫描仪，配模拟积分器。
5.300兆核磁共振仪：瑞士Bruker公司产品，AM-300。
(二)对象及取材：正常人5例，均为男性，年龄28±12(22～41)岁。皮肤取自腹部，在室温下，应用解剖刀仔细刮除皮下脂肪，再刮薄真皮，然后将真皮层向下置于浸过0.3%胰蛋白酶去离子水的纱布上，放入清洁培养皿中，置于4℃冰箱保存22～23h，取出后用手术刀片轻轻一刮，表真皮分离，然后用氯仿∶甲醇(2∶1、v/v)抽提并纯化、蒸干表皮脂质。
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(三)实验方法：
1.高效薄层扫描法：分别取上述脂质约1mg左右溶于0.5mL氯仿∶甲醇(2∶1v/v)中，展开剂为氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4v/v)，显色剂采用DittmerLester钼蓝显色剂，底色为白色，磷脂斑点为蓝色，用岛津双波长薄层扫描仪，以波长720nm作反射吸收光谱扫描，由模拟积分器打印出薄板上磷脂的峰面积及相对百分含量。
2.300兆核磁共振分析法：用柱层析法分别将上述多余表皮脂质分离并纯化磷脂，蒸干后溶于1mL氘代氯仿中，放入直径为5mm标准核磁管中，化学位移以85%H3PO4及氘代氯仿为内标，低场为正，高场为负，测试温度为20℃，湿度45%，根据31PNMR图谱，由积分曲线的高度算出各种磷脂化合物的摩尔百分比(mol%P)。
二、结果
应用高效薄层扫描法测定各组表皮磷脂百分含量，结果显示PC含量最高，为41.76±6.53%，其余依次为SPH(22.83±3.8%)、PE(21.52±3.89%)、PI+PS(12.17±2.29%，由于在单向薄层扫描中PI和PS的斑点重叠所致)。
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应用31PNMR方法测定正常人表皮磷脂各组成含量，以PC含量最高，为38.70±0.96%，其余依次为SPH(20.84±1.38)、PE(20.02±1.04)、PI(8.54±1.74)、CL(3.38±0.62)、PS(2.90±0.52)、PA(2.26±0.23)、LPC(1.46±0.24)，并出现一个未知磷脂(1.89±0.15)。
三、讨论
本实验采用高效薄层扫描法测定磷脂的组成及含量，结果与以往文献报道一致[3]。而31PNMR方法应用于皮肤磷脂的检测，主要结果与高效薄层扫描法相近，但31PNMR尚可检测到钼蓝溶液不能显色的CL和PA，并能将PI和PS完全分开，还发现一个含量较少的未知磷脂，有待于今后进一步研究证实。
高效薄层扫描法是以往最常用于脂质分析的一种方法，它具有快速、灵敏和分析范围广等优点，且所需样本量很少，一般仅需数10μg即可，但受较多条件的影响，如制备薄板硅胶的型号和均匀度，显色后与扫描的时间差等，只有在相同的实验条件下，才能得到较好的重复性，并且在定量测定中标准品不易得到。施邑屏等[4]曾对TLC法和31PNMR方法进行重复试验，结果提示前者准确性和重复性不如后者，TCL的相对误差为3左右，而31PNMR法一般为1.5以下。
, 百拇医药
31PNMR分析法是近年来发展起来的化学检测手段，可用来测定不同结构中P原子的化学位移以确定磷脂质的结构，对被测样品进行定性及定量分析。它更具有快速、灵敏、干扰因素小，准确性较高，深入物质内部而不破坏被测物质等优点，从而极大地弥补了其它测定方法的缺点。但本法样品纯度要求高，样品需要量较多，一般应用90兆NMR仪测定需样品30～60mg，用300兆NMR仪需10mg以上。
参考文献
1 Wertz PW. Epidermal lipids. Semin Dermatol, 1992,11:106- 113.
2 Schurer NY, Plewig G, Elias PM. Stratum corneum lipid function. Dermatologica, 1991,183:77- 94.
3 Grag GM, Yardley HJ. Lipid compositions of cells isolated from pig, human and rat epidermis. J Lipid Res, 1975,16:434- 439.
4施邑屏，黎燕斌，孙玲玲，等.31P核磁共振光谱及薄层色谱分析针剂大豆卵磷脂.分析化学,1991,19:733-736.
(收稿：1998-06-22修回：1998-12-26), http://www.100md.com