解脲支原体第一群MB抗原基因5′端基因片段的克隆表达及抗原性研究
作者：王玮蓁 孔繁荣 朱学骏 陈 洪 任桂珍
单位：作者单位：王玮(现在武汉市第一医院皮肤科430022) 孔繁荣 朱学骏 100034北京医科大学第一临床医院皮肤科；陈洪 中国科学院动物研究所；任桂珍 首都儿科研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990315
解脲支原体(Uu)在人类疾病感染中的特征仍有争议，已知感染人类的Uu具有种的特异性，用血清学的方法将其分为2个生物群及14个血清型，其中1、3、6、14为第1群，其余的10型为第2群[13]。Teng等[4]的研究认为Uu的群特异性和多样性被编码在MB(multiplebanded)抗原基因中，本研究用第1群的Uu3、14标准株对MB抗原5′端含群特异性抗原决定簇部分进行了PCR扩增，并对其表达的蛋白片段进行了抗原性检测。
, http://www.100md.com
一、材料与方法
1.Uu3、14型标准株、Uu3、6、8、14型标准抗血清由首都儿科研究所提供；pGEX-2T、感受态大肠杆菌DH5α由中国科学院动物所提供。
2.PCR扩增：①DNA模板制备：Uu3、14型标准株的DNA制备按我科实验室常规操作提取。②引物设计：参照Teng的设计合成一对特异性引物：UMS51：5′TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′；UMA427：5′CTCGAATTCACCTGGTTGTGTAGTTTCAAAGTTCAC3′(Cybersyn公司合成)。在上游引物和下游引物分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。③25μL反应体系：其中引物UMS51、UMA427、DNA模板各1μL。④反应条件：94℃、62℃、72℃各1min，35个循环。扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳及DNA片段回收试剂盒回收和纯化。
3.重组表达质粒的构建：将目的DNA片段及表达质粒pGEX-2T分别经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切处理，得到粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下连接，将重组质粒转化到大肠杆菌DH-5α中，用酶切和PCR的方法挑选阳性菌落。
, 百拇医药
4.IPTG诱导蛋白的表达：设含有生殖支原体304bp的重组质粒及空白载体pGEX-2T为对照。诱导剂IPTG的终浓度为0.1mmol/L，诱导时间4h。超声粉碎细菌后，加入等体积的2×SDS加样缓冲液，100℃加热3min，10000r/min，离心5min，取上清液20μL进行SDS-PAGE凝胶电泳。
5.Western印迹法检测表达蛋白的抗原性：①将表达的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，按常规方法将其转至硝酸纤维膜(NC)上，将NC膜用含3%BSA的封闭液室温封闭1、2h。②兔Uu3、6、8、14型抗血清1∶10稀释后用大肠杆菌DH5α裂解液预吸收4h，然后用血清稀释液稀释至1∶500，分别与NC膜4℃孵育过夜，次日用HRP标记的抗兔IgG室温反应1h。③酶底物联苯二胺(DAB)用底物缓冲液配制：将NC膜置入DAB溶液中显色。
二、结果
1.用UMS51UMA427扩增Uu3、14型标准株，得到429bp的目的DNA片段。克隆并经酶切和PCR方法筛选阳性克隆菌株。
, http://www.100md.com
2.IPTG诱导蛋白表达结果：含Uu3、14型目的DNA片段表达质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约43000的融合蛋白，仅含pGEX2T的大肠杆菌表达相对分子质量约26000的蛋白片段，含生殖支原体重组质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约35000的融合蛋白。
3.Western印迹法检测结果：含Uu3、14型MB抗原基因5′端重组质粒的阳性克隆诱导表达的蛋白片段与Uu3、6、14型标准抗血清均出现明显的阳性反应，与Uu8型抗血清未见条带出现。
三、讨论
MB抗原是Uu的外膜抗原，在人类感染中为占优势的识别抗原，根据对Uu3型的MB抗原基因序列分析，MB抗原为一个1230bp开放性的阅读框架，可编码409个氨基酸。在Teng等的研究中证实，MB抗原基因存在于所有的血清型中，基因的5′端区域是群特异性的标志[4]。在不同的血清型，MB抗原的大小可能是不同的，但其5′端的N区是保守的。
, 百拇医药
本研究参照Teng对Uu3型的MB抗原基因5′端设计的引物UMS51-UMA427扩增出Uu3、14型MB抗原基因的5′端，得到约429bp的目的DNA片段，克隆后，用IPTG在大肠杆菌中成功诱导了相对分子质量43000融合蛋白的表达，除去pGEX-2T质粒本身表达的相对分子质量约26000蛋白片段，得到预期大小相对分子质量17000的表达蛋白。并证实Uu3、14型MB抗原基因5′端基因片段所编码的蛋白片段含有第1群特异的抗原决定簇。Uu6型在第1群中由于不含HinfⅠ酶切位点，表现出第2群的特征，在亲缘关系上与其他3型可能相对较远，我们选择Uu6型的抗血清与表达的蛋白仍然出现明显的阳性反应，证实该蛋白片段确为第1群所共有。由于Uu3、14型所表达的蛋白与抗血清的反应完全相同，提示其具有相同的抗原决定簇。这一结果支持了Teng提出的MB抗原的N端存在群特异性的抗原决定簇的结论。
在目前的支原体检测中，多在培养后再进一步分群或分型，需较长的时间；PCR方法虽省时，但假阳性或假阴性均高，与操作者的水平密切相关。本研究采用基因重组技术得到含第1群MB抗原基因5′端基因片段的克隆菌株，为大量制备含MB抗原保守区的融合蛋白提供了条件，其蛋白作为抗原可制备抗体用于临床检测，为大批量标本的分群提供了方便。也可作为抗原检测血清中的抗体，为探讨临床疾病与解脲支原体感染的生物群之间的关系提供基础。
, 百拇医药
参考文献
1 Robertson JA, Vekris A, Bebear C, et al. Polymerase chain reaction using 16S rRNA gene sequences distinguishes the two biovars of Ureaplasma urealyticum. J Clin Microbiol, 1993,31:824- 830.
2 Teng LJ, Ho SW, Ho HN, et al. Rapid detection and biovar differentiation of Ureaplasma urealyticum in clinical specimens by PCR. J Formos Med Assoc, 1995,94:396- 400.
3 Grattard F, Pozzett B, Barbexrac B, et al. Arbitrarily primed PCR confirms the differentiation of strains of Ureaplasma urealyticum into two biovars. Mol Cell Prob, 1995,9:383- 389.
4 Teng LJ, Zheng X, Glass JI, et al. Ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple banded antigen gene. J Clin Microbiol, 1994,32:1464- 1469.
(收稿：1998-04-16修回：1998-10-21), 百拇医药
单位：作者单位：王玮(现在武汉市第一医院皮肤科430022) 孔繁荣 朱学骏 100034北京医科大学第一临床医院皮肤科；陈洪 中国科学院动物研究所；任桂珍 首都儿科研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990315
解脲支原体(Uu)在人类疾病感染中的特征仍有争议，已知感染人类的Uu具有种的特异性，用血清学的方法将其分为2个生物群及14个血清型，其中1、3、6、14为第1群，其余的10型为第2群[13]。Teng等[4]的研究认为Uu的群特异性和多样性被编码在MB(multiplebanded)抗原基因中，本研究用第1群的Uu3、14标准株对MB抗原5′端含群特异性抗原决定簇部分进行了PCR扩增，并对其表达的蛋白片段进行了抗原性检测。
, http://www.100md.com
一、材料与方法
1.Uu3、14型标准株、Uu3、6、8、14型标准抗血清由首都儿科研究所提供；pGEX-2T、感受态大肠杆菌DH5α由中国科学院动物所提供。
2.PCR扩增：①DNA模板制备：Uu3、14型标准株的DNA制备按我科实验室常规操作提取。②引物设计：参照Teng的设计合成一对特异性引物：UMS51：5′TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC3′；UMA427：5′CTCGAATTCACCTGGTTGTGTAGTTTCAAAGTTCAC3′(Cybersyn公司合成)。在上游引物和下游引物分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。③25μL反应体系：其中引物UMS51、UMA427、DNA模板各1μL。④反应条件：94℃、62℃、72℃各1min，35个循环。扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳及DNA片段回收试剂盒回收和纯化。
3.重组表达质粒的构建：将目的DNA片段及表达质粒pGEX-2T分别经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切处理，得到粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下连接，将重组质粒转化到大肠杆菌DH-5α中，用酶切和PCR的方法挑选阳性菌落。
, 百拇医药
4.IPTG诱导蛋白的表达：设含有生殖支原体304bp的重组质粒及空白载体pGEX-2T为对照。诱导剂IPTG的终浓度为0.1mmol/L，诱导时间4h。超声粉碎细菌后，加入等体积的2×SDS加样缓冲液，100℃加热3min，10000r/min，离心5min，取上清液20μL进行SDS-PAGE凝胶电泳。
5.Western印迹法检测表达蛋白的抗原性：①将表达的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，按常规方法将其转至硝酸纤维膜(NC)上，将NC膜用含3%BSA的封闭液室温封闭1、2h。②兔Uu3、6、8、14型抗血清1∶10稀释后用大肠杆菌DH5α裂解液预吸收4h，然后用血清稀释液稀释至1∶500，分别与NC膜4℃孵育过夜，次日用HRP标记的抗兔IgG室温反应1h。③酶底物联苯二胺(DAB)用底物缓冲液配制：将NC膜置入DAB溶液中显色。
二、结果
1.用UMS51UMA427扩增Uu3、14型标准株，得到429bp的目的DNA片段。克隆并经酶切和PCR方法筛选阳性克隆菌株。
, http://www.100md.com
2.IPTG诱导蛋白表达结果：含Uu3、14型目的DNA片段表达质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约43000的融合蛋白，仅含pGEX2T的大肠杆菌表达相对分子质量约26000的蛋白片段，含生殖支原体重组质粒的大肠杆菌表达相对分子质量约35000的融合蛋白。
3.Western印迹法检测结果：含Uu3、14型MB抗原基因5′端重组质粒的阳性克隆诱导表达的蛋白片段与Uu3、6、14型标准抗血清均出现明显的阳性反应，与Uu8型抗血清未见条带出现。
三、讨论
MB抗原是Uu的外膜抗原，在人类感染中为占优势的识别抗原，根据对Uu3型的MB抗原基因序列分析，MB抗原为一个1230bp开放性的阅读框架，可编码409个氨基酸。在Teng等的研究中证实，MB抗原基因存在于所有的血清型中，基因的5′端区域是群特异性的标志[4]。在不同的血清型，MB抗原的大小可能是不同的，但其5′端的N区是保守的。
, 百拇医药
本研究参照Teng对Uu3型的MB抗原基因5′端设计的引物UMS51-UMA427扩增出Uu3、14型MB抗原基因的5′端，得到约429bp的目的DNA片段，克隆后，用IPTG在大肠杆菌中成功诱导了相对分子质量43000融合蛋白的表达，除去pGEX-2T质粒本身表达的相对分子质量约26000蛋白片段，得到预期大小相对分子质量17000的表达蛋白。并证实Uu3、14型MB抗原基因5′端基因片段所编码的蛋白片段含有第1群特异的抗原决定簇。Uu6型在第1群中由于不含HinfⅠ酶切位点，表现出第2群的特征，在亲缘关系上与其他3型可能相对较远，我们选择Uu6型的抗血清与表达的蛋白仍然出现明显的阳性反应，证实该蛋白片段确为第1群所共有。由于Uu3、14型所表达的蛋白与抗血清的反应完全相同，提示其具有相同的抗原决定簇。这一结果支持了Teng提出的MB抗原的N端存在群特异性的抗原决定簇的结论。
在目前的支原体检测中，多在培养后再进一步分群或分型，需较长的时间；PCR方法虽省时，但假阳性或假阴性均高，与操作者的水平密切相关。本研究采用基因重组技术得到含第1群MB抗原基因5′端基因片段的克隆菌株，为大量制备含MB抗原保守区的融合蛋白提供了条件，其蛋白作为抗原可制备抗体用于临床检测，为大批量标本的分群提供了方便。也可作为抗原检测血清中的抗体，为探讨临床疾病与解脲支原体感染的生物群之间的关系提供基础。
, 百拇医药
参考文献
1 Robertson JA, Vekris A, Bebear C, et al. Polymerase chain reaction using 16S rRNA gene sequences distinguishes the two biovars of Ureaplasma urealyticum. J Clin Microbiol, 1993,31:824- 830.
2 Teng LJ, Ho SW, Ho HN, et al. Rapid detection and biovar differentiation of Ureaplasma urealyticum in clinical specimens by PCR. J Formos Med Assoc, 1995,94:396- 400.
3 Grattard F, Pozzett B, Barbexrac B, et al. Arbitrarily primed PCR confirms the differentiation of strains of Ureaplasma urealyticum into two biovars. Mol Cell Prob, 1995,9:383- 389.
4 Teng LJ, Zheng X, Glass JI, et al. Ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple banded antigen gene. J Clin Microbiol, 1994,32:1464- 1469.
(收稿：1998-04-16修回：1998-10-21), 百拇医药