天疱疮患者血清白介素－6、肿瘤坏死因子－α的检测分析
作者：周淑华 林麟 培英 王海燕 胡涛 高美华 王峰来 桑红桂
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所(周淑华 林麟 靳培英 王峰来 桑红桂)；山东滨州医学院免疫学研究室(王海燕 胡涛 高美华)
关键词：天疱疮白细胞介素-6肿瘤坏死因子
中华皮肤科杂志990406 【摘要】目的 探讨白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在天疱疮发病机理中的作用以及患者血清中这2种细胞因子水平与天疱疮病情的关系。方法 用双抗体夹心ELISA法检测了26例寻常型天疱疮(PV)，14例红斑型天疱疮(PE)患者治疗前、8例经有效治疗皮损全部消退的PV患者及23例正常人血清中IL-6、TNF-α水平，并测定了4例PV患者治疗前疱液中IL-6、TNF-α水平。结果 天疱疮患者治疗前血清中IL-6、TNF-α水平显著高于健康对照组(P<0.01)；2种细胞因子水平均与皮损面积呈正相关(P<0.01)；随皮损消退其水平降低(P<0.05)。4例PV患者疱液中IL-6、TNF-α水平均高于相应血清中水平。结论 天疱疮患者血清中IL-6、TNF-α水平与天疱疮病情活动性相关.IL-6、TNF-α可能参与了开疱疮的发病。
, 百拇医药
Interleukin-6 and Tumor Necrosis Factor-α in Sera
of Patients with Pemphigus
ZHOU Shuhua, LIN Lin, JIN Peiying,et al.
Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To elucidate the role of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the pathogenesis of pemphigus, and to find out the relationship between the two cytokines and the activity of the disease. Methods The serum levels of IL-6, TNF-α were determined by double antibody sandwich enzyme-iked immuno sorbant assay (ELISA) in 26 patients with pemphigus vulgaris (PV) and 14 patients with pemphigus erythematosus (PE) prior to treatment, in 8 PV patients after complete clearing of the skin lesions and in 23 normal controls. The levels of IL-6 and TNF-α were also tested in the blister fluid obtained from 4 PV patients at the same time when the serum samples were taken. Results The results showed that the serum levels of IL-6 and TNF-α were significantly higher in patients with pemphigus than that in normal controls (P<0.01). A significant correlation was found between the serum levels of IL-6 and the total area of lesions for each patient (P<0.01). Theserum levels of the two cytokines declined as the skin lesion had completely disappeared (P<0.05). The levels of both IL-6 and TNF-α in the blister fluid of 4 PV patients were higher than that in the serum samples obtained at the same time. Conclusion The results indicate that there is a relationship between the serum levels of IL-6 and TNF-α and the activity of pemphigus. Theresults also suggest that IL-6 and TNF-α play an important role in the pathogenesis of pemphigus.
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【Key words】 Pemphigus Interleukin-6 Tumor necrosis factor
天疱疮为一少见的自身免疫性大疱性皮肤病。抗表皮细胞间物质的自身抗体与表皮角质形成细胞桥粒芯蛋白结合，导致表皮棘层松解。抗体的致病性已被证实[1]。在天疱疮发病机理方面，过去对抗原抗体反应研究较详细，而细胞免疫在发病机理中的作用不清楚。近年来研究发现细胞免疫可能参与了天疱疮的发病[2，3]。研究天疱疮患者血清中细胞因子，可更全面地认识天疱疮发病中免疫学机理。本研究用夹心ELISA法测定了26例寻常型天疱疮(PV)，14例红斑型天疱疮(PE)患者治疗前血清中白介素-6(IL-6)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，并对8例经有效治疗皮损消退PV患者的血清IL-6、TNF-α水平及4例PV患者疱液中IL--6、TNF-α水平进行了检测，以探讨它们在天疱疮发病机理中的作用，以及患者血清中IL-6、TNF-α水平与病情的关系。
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材料与方法
(一)研究对象：病例为1995年1月至1998年5月本所医院门诊或住院的部分天疱疮患者，临床资料完整，共40例，其中男25例，女15例，年龄17～83岁。PV组26例，符合PV典型的临床表现与组织病理学特点；PE组14例，符合PE典型的临床表现与组织病理学特点。所有患者均经直接免疫荧光证实诊断。33例患者经间接免疫荧光检测了循环天疱疮抗体滴度。治疗前仔细体检，依据天疱疮类型、皮损面积占体表面积百分率、有无粘膜损害等给予不同剂量的皮质类固醇治疗。于治疗前及皮损消退时采血，用于检测IL-6、TNF-α水平。治疗前4例PV患者，于采血同时抽取完整水疱疱液进行检测。正常对照组为健康体检者，共23例。其中男15例，女8例，年龄19～71岁。
(二)研究方法：
标本采集：晨空腹常规静脉采血，分离血清，-20℃保存待测。疱液采集：常规消毒皮损，无菌注射器抽取疱液，2000r/min离心10min，收集上清液，-20℃保存待测。
, 百拇医药
实验方法：IL-6、TNF-α酶标试剂盒购自第四军医大学免疫学研究室。采用酶标双抗体夹心ELISA法检测血清及疱液中IL-6、TNF-α水平。用美国产Multiskan全自动酶标仪，输入标准浓度后，测吸光度，绘制标准曲线，自动计算出待测样品含量。
统计学方法：因不能确定所测结果的分布类型，数据以中位数、范围表示。结果采用非参数秩和检验与Spearman等级相关分析。
结果
(一)天疱疮患者血清IL-6、TNF-α水平显著高于对照组。经秩和检验，U值分别为4.54与3.02，P<0.01, 见表1。PV组与PE组治疗前血清IL-6水平、TNF-α水平差异无显著性(P>0.05)，见表1。
表1 天疱疮患者与正常对照组血清IL-6及TNF-α水平
, 百拇医药 组别
例数
IL-6(ng/mL)
TNF-α(ng/mL)
中位数
范围
U值
中位数
范围
U值
对照组
23
0.124
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0.02~0.468
4.54*
0.197
0.002~0.704
3.02*
开疱疮组
40
0.508
0.091~2.540
0.387
0.056~1.390
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0.43
寻常型
26
0.541.
0.091~2.436
0.44
0.451
0.074~1.390
经斑型
14
0.420
0.098~2.540
, 百拇医药
0.345
0.056~0.938
注：采用秩和检验，*P<0.01
(二)Spearman等级相关分析：非参数等级相关分析结果，两型天疱疮中，皮损面积与血清IL-6、TNF-α水平均呈正相关(PV组rs分别为0.468、0.501，P<0.01;PE组rs分别为0.671、0.657,P<0.01).患者血清中IL-6与TNF-α水平呈正相关(rs=0.597,P<0.01)。患者血清IL-6、TNF-α水平与天疱疮抗体滴度间无相关性(rs分别为0.320、0.342,P>0.05).
(三)8例PV患者治疗前与皮损全部消退时血清IL-6水平分别为1.294ng/mL(0.508～2.463ng/mL)与0.443ng/mL(0.091～1.460ng/mL)，经配对资料非参数Wilcoxon法分析，U=2.52,P<0.05;TNF-α治疗前后分别为0.662ng/mL(0.402~1.390ng/mL)与0.292mg/mL(0.249~0.776ng/mL),U=2.52,P<0.05.
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(四)4例PV患者完整水疱疱液中IL-6、TNF-α水平均高于相应血清中含量。
讨论
本研究结果显示，天疱疮患者血清IL-6、TNF-α水平较健康对照组显著增高。在两型天疱疮中，血清IL-6、TNF-α水平与皮损面积均呈正相关，在有效的系统皮质类固醇治疗后，皮损全部消退时其水平显著降低。血清中IL-6与TNF-α水平呈正相关。表明患者血清中IL-6、TNF-α水平与天疱疮病情活动性相关。
天疱疮患者表皮细胞间IgG抗体的沉积，不仅限于发病处皮肤，外观正常皮肤处也有IgG沉积，故推测除抗体之外，其它机制可能参与了水疱的形成[2]。过去的研究中发现天疱疮皮损处有较多单一核细胞浸润，其作用不明[2]。Zillikens等[2]用免疫组化研究发现，天疱疮皮损处真皮及表皮T淋巴细胞、单核-巨噬细胞均显著多于皮损周围皮肤，同时活化T淋巴细胞增多。真皮处以T细胞浸润为主，表皮处以单核-巨噬细胞为主。在PV，表皮浸润细胞集中于基底层上方；在PE，浸润细胞散布于整个表皮。表明天疱疮皮损处有大量单核-巨噬细胞与T淋巴细胞浸润。而单核-巨噬细胞及T细胞是TNF-α的主要来源，也是IL-6的重要来源。结合本文研究结果，患者血清中IL-6、TNF-α水平与皮损面积呈正相关，随皮损消退而下降；PV患者疱液中IL6、TNF-α水平高于相应血清中水平。推测血清中IL-6、TNF-α可能来源于皮损局部的单核-巨噬细胞、T细胞等浸润细胞。因单核-巨噬细胞与T细胞及其分泌的细胞因子是细胞免疫主要的参与者，以上研究结果支持细胞免疫在天疱疮发病机理中发挥重要作用。最近Lin等研究表明，重组桥粒芯蛋白Dsg1与Dsg3(分别为PE、PV的抗原)可在体外刺激具有循环天疱疮抗体的PV患者的T淋巴细胞发生增殖反应[3，4]。证实T细胞免疫在天疱疮发病中的作用。
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本研究结果中，PV与PE患者血清中两种细胞因子水平差异无显著性，结合Zillikens的研究结果，推测可能因PV与PE皮损局部浸润细胞的种类、数量、功能相似，只是分布不同。当皮损局部产生的细胞因子释放入血流时，其水平差异无显著性。
因天疱疮患者水疱易破，疱液采集困难，故本文检测的疱液例数较少。由于方法所限，无法确定IL-6、TNF-α的来源。
参考文献
1 Amagai M, Koch PJ, Nishikawa T, et al. Pemphigus vulgaris antigen (Desmoglein-3) is localized in the lower epidermis, the site of blister formation in patients. J Invest Dermatol, 1996,106:351- 355.
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2 Zillikens D, Ambach A, Zentner A, et al. Evidence for cell mediated immune mechanisms in the pathology of pemphigus. Br J Dermatol, 1993,128:636- 643.
3 Lin MS, Swartz SJ, Lopez A, et al. T lymphocytes from a subset of patients with pemphigus vulgaris respond to both Desmoglein-3 and Desmoglein-1. J Invest Dermatol, 1997,109:734- 737.
4 Lin MS, Swartz SJ, Lopez A, et al. Development and characterization of desmoglein-3 specific T cells from patients with pemphigus vulgaris. J Clin Invest, 1997b,99:31- 40.
收稿：1998-10-26修回：1999-01-08, 百拇医药
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所(周淑华 林麟 靳培英 王峰来 桑红桂)；山东滨州医学院免疫学研究室(王海燕 胡涛 高美华)
关键词：天疱疮白细胞介素-6肿瘤坏死因子
中华皮肤科杂志990406 【摘要】目的 探讨白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在天疱疮发病机理中的作用以及患者血清中这2种细胞因子水平与天疱疮病情的关系。方法 用双抗体夹心ELISA法检测了26例寻常型天疱疮(PV)，14例红斑型天疱疮(PE)患者治疗前、8例经有效治疗皮损全部消退的PV患者及23例正常人血清中IL-6、TNF-α水平，并测定了4例PV患者治疗前疱液中IL-6、TNF-α水平。结果 天疱疮患者治疗前血清中IL-6、TNF-α水平显著高于健康对照组(P<0.01)；2种细胞因子水平均与皮损面积呈正相关(P<0.01)；随皮损消退其水平降低(P<0.05)。4例PV患者疱液中IL-6、TNF-α水平均高于相应血清中水平。结论 天疱疮患者血清中IL-6、TNF-α水平与天疱疮病情活动性相关.IL-6、TNF-α可能参与了开疱疮的发病。
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Interleukin-6 and Tumor Necrosis Factor-α in Sera
of Patients with Pemphigus
ZHOU Shuhua, LIN Lin, JIN Peiying,et al.
Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, Nanjing 210042
【Abstract】 Objective To elucidate the role of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in the pathogenesis of pemphigus, and to find out the relationship between the two cytokines and the activity of the disease. Methods The serum levels of IL-6, TNF-α were determined by double antibody sandwich enzyme-iked immuno sorbant assay (ELISA) in 26 patients with pemphigus vulgaris (PV) and 14 patients with pemphigus erythematosus (PE) prior to treatment, in 8 PV patients after complete clearing of the skin lesions and in 23 normal controls. The levels of IL-6 and TNF-α were also tested in the blister fluid obtained from 4 PV patients at the same time when the serum samples were taken. Results The results showed that the serum levels of IL-6 and TNF-α were significantly higher in patients with pemphigus than that in normal controls (P<0.01). A significant correlation was found between the serum levels of IL-6 and the total area of lesions for each patient (P<0.01). Theserum levels of the two cytokines declined as the skin lesion had completely disappeared (P<0.05). The levels of both IL-6 and TNF-α in the blister fluid of 4 PV patients were higher than that in the serum samples obtained at the same time. Conclusion The results indicate that there is a relationship between the serum levels of IL-6 and TNF-α and the activity of pemphigus. Theresults also suggest that IL-6 and TNF-α play an important role in the pathogenesis of pemphigus.
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【Key words】 Pemphigus Interleukin-6 Tumor necrosis factor
天疱疮为一少见的自身免疫性大疱性皮肤病。抗表皮细胞间物质的自身抗体与表皮角质形成细胞桥粒芯蛋白结合，导致表皮棘层松解。抗体的致病性已被证实[1]。在天疱疮发病机理方面，过去对抗原抗体反应研究较详细，而细胞免疫在发病机理中的作用不清楚。近年来研究发现细胞免疫可能参与了天疱疮的发病[2，3]。研究天疱疮患者血清中细胞因子，可更全面地认识天疱疮发病中免疫学机理。本研究用夹心ELISA法测定了26例寻常型天疱疮(PV)，14例红斑型天疱疮(PE)患者治疗前血清中白介素-6(IL-6)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，并对8例经有效治疗皮损消退PV患者的血清IL-6、TNF-α水平及4例PV患者疱液中IL--6、TNF-α水平进行了检测，以探讨它们在天疱疮发病机理中的作用，以及患者血清中IL-6、TNF-α水平与病情的关系。
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材料与方法
(一)研究对象：病例为1995年1月至1998年5月本所医院门诊或住院的部分天疱疮患者，临床资料完整，共40例，其中男25例，女15例，年龄17～83岁。PV组26例，符合PV典型的临床表现与组织病理学特点；PE组14例，符合PE典型的临床表现与组织病理学特点。所有患者均经直接免疫荧光证实诊断。33例患者经间接免疫荧光检测了循环天疱疮抗体滴度。治疗前仔细体检，依据天疱疮类型、皮损面积占体表面积百分率、有无粘膜损害等给予不同剂量的皮质类固醇治疗。于治疗前及皮损消退时采血，用于检测IL-6、TNF-α水平。治疗前4例PV患者，于采血同时抽取完整水疱疱液进行检测。正常对照组为健康体检者，共23例。其中男15例，女8例，年龄19～71岁。
(二)研究方法：
标本采集：晨空腹常规静脉采血，分离血清，-20℃保存待测。疱液采集：常规消毒皮损，无菌注射器抽取疱液，2000r/min离心10min，收集上清液，-20℃保存待测。
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实验方法：IL-6、TNF-α酶标试剂盒购自第四军医大学免疫学研究室。采用酶标双抗体夹心ELISA法检测血清及疱液中IL-6、TNF-α水平。用美国产Multiskan全自动酶标仪，输入标准浓度后，测吸光度，绘制标准曲线，自动计算出待测样品含量。
统计学方法：因不能确定所测结果的分布类型，数据以中位数、范围表示。结果采用非参数秩和检验与Spearman等级相关分析。
结果
(一)天疱疮患者血清IL-6、TNF-α水平显著高于对照组。经秩和检验，U值分别为4.54与3.02，P<0.01, 见表1。PV组与PE组治疗前血清IL-6水平、TNF-α水平差异无显著性(P>0.05)，见表1。
表1 天疱疮患者与正常对照组血清IL-6及TNF-α水平
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例数
IL-6(ng/mL)
TNF-α(ng/mL)
中位数
范围
U值
中位数
范围
U值
对照组
23
0.124
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0.02~0.468
4.54*
0.197
0.002~0.704
3.02*
开疱疮组
40
0.508
0.091~2.540
0.387
0.056~1.390
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0.43
寻常型
26
0.541.
0.091~2.436
0.44
0.451
0.074~1.390
经斑型
14
0.420
0.098~2.540
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0.345
0.056~0.938
注：采用秩和检验，*P<0.01
(二)Spearman等级相关分析：非参数等级相关分析结果，两型天疱疮中，皮损面积与血清IL-6、TNF-α水平均呈正相关(PV组rs分别为0.468、0.501，P<0.01;PE组rs分别为0.671、0.657,P<0.01).患者血清中IL-6与TNF-α水平呈正相关(rs=0.597,P<0.01)。患者血清IL-6、TNF-α水平与天疱疮抗体滴度间无相关性(rs分别为0.320、0.342,P>0.05).
(三)8例PV患者治疗前与皮损全部消退时血清IL-6水平分别为1.294ng/mL(0.508～2.463ng/mL)与0.443ng/mL(0.091～1.460ng/mL)，经配对资料非参数Wilcoxon法分析，U=2.52,P<0.05;TNF-α治疗前后分别为0.662ng/mL(0.402~1.390ng/mL)与0.292mg/mL(0.249~0.776ng/mL),U=2.52,P<0.05.
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(四)4例PV患者完整水疱疱液中IL-6、TNF-α水平均高于相应血清中含量。
讨论
本研究结果显示，天疱疮患者血清IL-6、TNF-α水平较健康对照组显著增高。在两型天疱疮中，血清IL-6、TNF-α水平与皮损面积均呈正相关，在有效的系统皮质类固醇治疗后，皮损全部消退时其水平显著降低。血清中IL-6与TNF-α水平呈正相关。表明患者血清中IL-6、TNF-α水平与天疱疮病情活动性相关。
天疱疮患者表皮细胞间IgG抗体的沉积，不仅限于发病处皮肤，外观正常皮肤处也有IgG沉积，故推测除抗体之外，其它机制可能参与了水疱的形成[2]。过去的研究中发现天疱疮皮损处有较多单一核细胞浸润，其作用不明[2]。Zillikens等[2]用免疫组化研究发现，天疱疮皮损处真皮及表皮T淋巴细胞、单核-巨噬细胞均显著多于皮损周围皮肤，同时活化T淋巴细胞增多。真皮处以T细胞浸润为主，表皮处以单核-巨噬细胞为主。在PV，表皮浸润细胞集中于基底层上方；在PE，浸润细胞散布于整个表皮。表明天疱疮皮损处有大量单核-巨噬细胞与T淋巴细胞浸润。而单核-巨噬细胞及T细胞是TNF-α的主要来源，也是IL-6的重要来源。结合本文研究结果，患者血清中IL-6、TNF-α水平与皮损面积呈正相关，随皮损消退而下降；PV患者疱液中IL6、TNF-α水平高于相应血清中水平。推测血清中IL-6、TNF-α可能来源于皮损局部的单核-巨噬细胞、T细胞等浸润细胞。因单核-巨噬细胞与T细胞及其分泌的细胞因子是细胞免疫主要的参与者，以上研究结果支持细胞免疫在天疱疮发病机理中发挥重要作用。最近Lin等研究表明，重组桥粒芯蛋白Dsg1与Dsg3(分别为PE、PV的抗原)可在体外刺激具有循环天疱疮抗体的PV患者的T淋巴细胞发生增殖反应[3，4]。证实T细胞免疫在天疱疮发病中的作用。
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本研究结果中，PV与PE患者血清中两种细胞因子水平差异无显著性，结合Zillikens的研究结果，推测可能因PV与PE皮损局部浸润细胞的种类、数量、功能相似，只是分布不同。当皮损局部产生的细胞因子释放入血流时，其水平差异无显著性。
因天疱疮患者水疱易破，疱液采集困难，故本文检测的疱液例数较少。由于方法所限，无法确定IL-6、TNF-α的来源。
参考文献
1 Amagai M, Koch PJ, Nishikawa T, et al. Pemphigus vulgaris antigen (Desmoglein-3) is localized in the lower epidermis, the site of blister formation in patients. J Invest Dermatol, 1996,106:351- 355.
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2 Zillikens D, Ambach A, Zentner A, et al. Evidence for cell mediated immune mechanisms in the pathology of pemphigus. Br J Dermatol, 1993,128:636- 643.
3 Lin MS, Swartz SJ, Lopez A, et al. T lymphocytes from a subset of patients with pemphigus vulgaris respond to both Desmoglein-3 and Desmoglein-1. J Invest Dermatol, 1997,109:734- 737.
4 Lin MS, Swartz SJ, Lopez A, et al. Development and characterization of desmoglein-3 specific T cells from patients with pemphigus vulgaris. J Clin Invest, 1997b,99:31- 40.
收稿：1998-10-26修回：1999-01-08, 百拇医药