正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞Fas和Fas配体的表达
作者：贺为东 赵玉铭 宋芳吉 齐藤 墩 岛田 真路
单位：110001沈阳，中国医科大学第一临床学院皮肤科(贺为东 赵玉铭 宋芳吉)；日本山梨医科大学皮肤科(齐藤墩 岛田路)
关键词：
中华皮肤科杂志990422
Fas和Fas配体(FasL)结合可导致表达Fas的细胞凋亡，是细胞凋亡的一个主要途径[1]。已经证明Fas表达于正常角质形成细胞和成纤维细胞中，但是到目前为止还没有FasLmRNA表达在正常角质形成细胞中的直接证据。我们采用高敏感的RNA酶保护法，半定量地检测了正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的Fas和FasLmRNA，并用流式细胞仪检测了细胞表面表达Fas和FasL蛋白的阳性细胞数，以阐明Fas及FasL在角质形成细胞和成纤维细胞凋亡中的作用，为研究正常皮肤生长、凋亡及某些皮肤病的发病机理提供理论依据。
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一、材料与方法
1.新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的培养[2]：分别将表皮细胞和成纤维细胞于低钙无血清培养基(KGM，Clonetics公司)和含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司)中培养。
2.RNA的提取：采用RNAZoleB(美国TEL-TEST公司)溶液提取总RNA，并保持其A值(曾称OD值)均在1.86以上。
3.RNA酶保护法[3]：①沉淀RNA：用5mol/LNaCl和冷乙醇沉淀10μg角质形成细胞或成纤维细胞的RNA；②反向转录片段的合成：DNA探针为从Ambion公司购买的小鼠的Fas、FasL和亲环蛋白(cyclophilin)DNA(亲环蛋白为半定量的内参照)，由T3RNA聚合酶(Ambion公司)、32P-UTP(10μCi/mol)(ArmershamLifeScience公司)、脱氧核糖核苷酸(dNTPs)在反应液中于37℃条件下反应1h合成；③与样本RNA杂交：反向转录片段，在42℃条件下，与样本RNA杂交过夜。(FasL的放射强度为80000c/min，Fas和亲环蛋白的放射强度均为30000c/min)；④保护性片段的获得：杂交物用核酸酶A和核酸酶T1在30℃条件下消化1h，用酚和氯仿提纯保护性片段；⑤电泳：保护性片段在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，干燥凝胶后用放射自显影分析仪进行半定量分析。
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4.RT-PCR法：扩增引物序列为FasL:5′-CGTGAGTTCACCAACCAAAGC-3′，5′-GAGTTCCTCATATAGACCTTG-3′(反向)[1]；Fas:5′-ATCCGAGCTCTGAGGAGGCGGGTTCATGAAAC-3′，5′-GGAGGTTCTAGATTCAGGGTCATCCTG-3′(反向)[4]。
5.流式细胞仪检测角质形成细胞和成纤维细胞表面Fas和FasL蛋白的表达[2]：所用抗体分别为生物素标记的抗FasL和抗豚鼠IgG抗体(阴性对照抗体)；PE标记的抗Fas和抗豚鼠IgG抗体(阴性对照抗体)；同一实验用上述方法重复3次。
二、结果
1.正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞Fas和FasLmRNA的表达：应用敏感的RNA酶保护法，分别检测了正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的mRNA，结果发现：正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表达大量的FasmRNA(图1)和少量的FasLmRNA(图2)。
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1：Marker2：角质形成细胞3：反转录片段(阴性对照)
4：阳性对照5：成纤维细胞6：探针(Fas+FasL)
图1 正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞FasmRNA的表达
1：Marker2：角质形成细胞3：反转录片段(阴性对照)
4：阳性对照5：成纤维细胞6：探针(Fas+FasL)
图2 正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞FasLmRNA的表达
2.RT-PCR结果：RT-PCR结果显示新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞分别表达大量的FasmRNA，但未检测到明显的FasLmRNA。
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3.正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞Fas和FasL蛋白的表达：流式细胞仪检测显示正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表面Fas蛋白表达的阳性细胞数分别为27.75%和25.04%；但在正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表面未检测到FasL蛋白表达的阳性细胞。
三、讨论
我们用较新的敏感性较高的RNA酶保护法及RT-PCR法，分别检测了正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的mRNA。结果发现正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞均表达大量的FasmRNA，并直接证明了角质形成细胞和成纤维细胞表达少量的FasLmRNA。但是RT-PCR结果未检测到FasLmRNA，可能是由于引物片段选择的不同或FasL mRNA表达量较少的缘故。用流式细胞仪检测，发现正常角质形成细胞Fas蛋白表达的阳性细胞数为27.75%，正常成纤维细胞Fas蛋白表达的阳性细胞数为25.04%。以上结果提示Fas和FasL在正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的凋亡中起一定的作用。Leverkus等[2]用Northern法直接检测到了人的角质形成细胞持续表达FasmRNA，而未检测到FasL的mRNA，但用RT-PCR加Southern法检测到了人角质形成细胞持续表达少量FasLmRNA，并证明它们可以引起正常角质形成细胞的凋亡。Hueber等[5]用流式细胞仪证明了原代胎鼠的成纤维细胞和Swiss3T3细胞表达大量的FasmRNA，并可引起细胞凋亡，用RTPCR证明了Swiss3T3细胞和原代胎鼠成纤维细胞表达少量的FasLmRNA。Leverkus等用免疫印迹法还直接检测到了人的角质形成细胞持续表达FasL蛋白，但我们用流式细胞仪并未检测到正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表达FasL蛋白，这可能是由于：①使用的方法不同；②FasL蛋白在细胞表面的表达量极低；③FasL蛋白如细胞因子一样，可以分泌到细胞外，故在没有抑制金属蛋白酶(metalloprotease)活性的条件下(此酶可促进FasL蛋白从细胞表面释放到细胞外)[6]，少量表达的FasL蛋白不易被检测。我们推测FasL蛋白不仅在正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的凋亡中发挥作用，而且在维持其正常生理功能、排除炎症损伤细胞、紫外线损伤细胞及灭活过量浸润的T细胞中，亦具有重要作用。
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参考文献
1 Brossart P, Bevan MJ. Selective activation of Fas/Fas ligand-mediated cytotoxicity by a self peptide. J Exp Med, 1996,183:2449- 2458.
2 Leverkus M, Yaar M, Gilchrest BA. Fas/Fas ligand interaction contributes to UV -induced apopotosis in human keratinocytes. Exp Cell Res, 1997,232:255- 262.
3 Werners M, Peters KG, Longaker MT, et al. Large induction of keratinocyte growth factor expression in the dermis during wound healing. Pro Natl Acad Sci USA, 1992,89:6896- 6900.
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4 Zhang L, Miller RG, Zhang J. Characterization of apoptosis-resistant antigen specific T cells in vivo. J Exp Med, 1996,183:2065- 2073.
5 Hueber A-O, Zornig M, Lyon D, et al. Requirement for the CD95 receptor-ligand pathway in c-Myc-induced apoptosis. Science, 1997,278(5341):1305- 1308.
6 Mariani SM, Matiba B, B umler C, et al. Regulation of cell surface APO/1 Fas(CD95) ligand expression by metalloprotease. Eur J Immunol, 1997,25:2303- 2307.
收稿：1998-07-28修回：1998-10-30, http://www.100md.com
单位：110001沈阳，中国医科大学第一临床学院皮肤科(贺为东 赵玉铭 宋芳吉)；日本山梨医科大学皮肤科(齐藤墩 岛田路)
关键词：
中华皮肤科杂志990422
Fas和Fas配体(FasL)结合可导致表达Fas的细胞凋亡，是细胞凋亡的一个主要途径[1]。已经证明Fas表达于正常角质形成细胞和成纤维细胞中，但是到目前为止还没有FasLmRNA表达在正常角质形成细胞中的直接证据。我们采用高敏感的RNA酶保护法，半定量地检测了正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的Fas和FasLmRNA，并用流式细胞仪检测了细胞表面表达Fas和FasL蛋白的阳性细胞数，以阐明Fas及FasL在角质形成细胞和成纤维细胞凋亡中的作用，为研究正常皮肤生长、凋亡及某些皮肤病的发病机理提供理论依据。
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一、材料与方法
1.新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的培养[2]：分别将表皮细胞和成纤维细胞于低钙无血清培养基(KGM，Clonetics公司)和含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司)中培养。
2.RNA的提取：采用RNAZoleB(美国TEL-TEST公司)溶液提取总RNA，并保持其A值(曾称OD值)均在1.86以上。
3.RNA酶保护法[3]：①沉淀RNA：用5mol/LNaCl和冷乙醇沉淀10μg角质形成细胞或成纤维细胞的RNA；②反向转录片段的合成：DNA探针为从Ambion公司购买的小鼠的Fas、FasL和亲环蛋白(cyclophilin)DNA(亲环蛋白为半定量的内参照)，由T3RNA聚合酶(Ambion公司)、32P-UTP(10μCi/mol)(ArmershamLifeScience公司)、脱氧核糖核苷酸(dNTPs)在反应液中于37℃条件下反应1h合成；③与样本RNA杂交：反向转录片段，在42℃条件下，与样本RNA杂交过夜。(FasL的放射强度为80000c/min，Fas和亲环蛋白的放射强度均为30000c/min)；④保护性片段的获得：杂交物用核酸酶A和核酸酶T1在30℃条件下消化1h，用酚和氯仿提纯保护性片段；⑤电泳：保护性片段在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，干燥凝胶后用放射自显影分析仪进行半定量分析。
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4.RT-PCR法：扩增引物序列为FasL:5′-CGTGAGTTCACCAACCAAAGC-3′，5′-GAGTTCCTCATATAGACCTTG-3′(反向)[1]；Fas:5′-ATCCGAGCTCTGAGGAGGCGGGTTCATGAAAC-3′，5′-GGAGGTTCTAGATTCAGGGTCATCCTG-3′(反向)[4]。
5.流式细胞仪检测角质形成细胞和成纤维细胞表面Fas和FasL蛋白的表达[2]：所用抗体分别为生物素标记的抗FasL和抗豚鼠IgG抗体(阴性对照抗体)；PE标记的抗Fas和抗豚鼠IgG抗体(阴性对照抗体)；同一实验用上述方法重复3次。
二、结果
1.正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞Fas和FasLmRNA的表达：应用敏感的RNA酶保护法，分别检测了正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的mRNA，结果发现：正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表达大量的FasmRNA(图1)和少量的FasLmRNA(图2)。
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1：Marker2：角质形成细胞3：反转录片段(阴性对照)
4：阳性对照5：成纤维细胞6：探针(Fas+FasL)
图1 正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞FasmRNA的表达
1：Marker2：角质形成细胞3：反转录片段(阴性对照)
4：阳性对照5：成纤维细胞6：探针(Fas+FasL)
图2 正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞FasLmRNA的表达
2.RT-PCR结果：RT-PCR结果显示新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞分别表达大量的FasmRNA，但未检测到明显的FasLmRNA。
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3.正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞Fas和FasL蛋白的表达：流式细胞仪检测显示正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表面Fas蛋白表达的阳性细胞数分别为27.75%和25.04%；但在正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表面未检测到FasL蛋白表达的阳性细胞。
三、讨论
我们用较新的敏感性较高的RNA酶保护法及RT-PCR法，分别检测了正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的mRNA。结果发现正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞均表达大量的FasmRNA，并直接证明了角质形成细胞和成纤维细胞表达少量的FasLmRNA。但是RT-PCR结果未检测到FasLmRNA，可能是由于引物片段选择的不同或FasL mRNA表达量较少的缘故。用流式细胞仪检测，发现正常角质形成细胞Fas蛋白表达的阳性细胞数为27.75%，正常成纤维细胞Fas蛋白表达的阳性细胞数为25.04%。以上结果提示Fas和FasL在正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的凋亡中起一定的作用。Leverkus等[2]用Northern法直接检测到了人的角质形成细胞持续表达FasmRNA，而未检测到FasL的mRNA，但用RT-PCR加Southern法检测到了人角质形成细胞持续表达少量FasLmRNA，并证明它们可以引起正常角质形成细胞的凋亡。Hueber等[5]用流式细胞仪证明了原代胎鼠的成纤维细胞和Swiss3T3细胞表达大量的FasmRNA，并可引起细胞凋亡，用RTPCR证明了Swiss3T3细胞和原代胎鼠成纤维细胞表达少量的FasLmRNA。Leverkus等用免疫印迹法还直接检测到了人的角质形成细胞持续表达FasL蛋白，但我们用流式细胞仪并未检测到正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞表达FasL蛋白，这可能是由于：①使用的方法不同；②FasL蛋白在细胞表面的表达量极低；③FasL蛋白如细胞因子一样，可以分泌到细胞外，故在没有抑制金属蛋白酶(metalloprotease)活性的条件下(此酶可促进FasL蛋白从细胞表面释放到细胞外)[6]，少量表达的FasL蛋白不易被检测。我们推测FasL蛋白不仅在正常新生小鼠角质形成细胞和成纤维细胞的凋亡中发挥作用，而且在维持其正常生理功能、排除炎症损伤细胞、紫外线损伤细胞及灭活过量浸润的T细胞中，亦具有重要作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Brossart P, Bevan MJ. Selective activation of Fas/Fas ligand-mediated cytotoxicity by a self peptide. J Exp Med, 1996,183:2449- 2458.
2 Leverkus M, Yaar M, Gilchrest BA. Fas/Fas ligand interaction contributes to UV -induced apopotosis in human keratinocytes. Exp Cell Res, 1997,232:255- 262.
3 Werners M, Peters KG, Longaker MT, et al. Large induction of keratinocyte growth factor expression in the dermis during wound healing. Pro Natl Acad Sci USA, 1992,89:6896- 6900.
, 百拇医药
4 Zhang L, Miller RG, Zhang J. Characterization of apoptosis-resistant antigen specific T cells in vivo. J Exp Med, 1996,183:2065- 2073.
5 Hueber A-O, Zornig M, Lyon D, et al. Requirement for the CD95 receptor-ligand pathway in c-Myc-induced apoptosis. Science, 1997,278(5341):1305- 1308.
6 Mariani SM, Matiba B, B umler C, et al. Regulation of cell surface APO/1 Fas(CD95) ligand expression by metalloprotease. Eur J Immunol, 1997,25:2303- 2307.
收稿：1998-07-28修回：1998-10-30, http://www.100md.com