进行期银屑病患者皮损中胰岛素样生长因子Ⅰ受体蛋白与mRNA的表达
作者：肖征 高进 王椿森 胡长发
单位：肖征 高进 胡长发 430022武汉，武汉市第一医院皮肤病研究室；王椿森 同济医科大学附属协和医院皮肤科
关键词：银屑病受体，胰岛素样生长因子ⅠRNA，信使
中华皮肤科杂志/990608
【摘要】目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGFⅠR)和进行期银屑病的关系。方法 应用免疫组织化学技术，逆转录酶聚合酶链反应和原位杂交分别检测15例银屑病患者和10例正常人皮肤组织块中IGFⅠR蛋白与mRNA的表达。结果 IGFⅠR蛋白与mRNA表达在银屑病患者基底层和棘细胞层,IGFⅠR蛋白与mRNA相对积分光密度值在正常对照组与银屑病组间存在极显著性差异(P<0.01)。结论 进行期银屑病患者皮损中表达增加的IGFⅠR蛋白和mRNA可能介导了角质形成细胞的增殖与分化不全。
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胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-likegrowthfactorⅠ,IGFⅠ)是胰岛素家族中的一员,由生长激素(growth hormone,GH)诱导分泌,IGFⅠ负反馈作用于GH,构成GHIGF轴[1]，此轴通过IGFⅠR作用于角质形成细胞。我们应用蛋白与基因检测技术检测了IGFⅠR蛋白与mRNA在进行期银屑病患者中的表达。
Expression of Insulin like Growth Factor
Ⅰ Receptor Protein and mRNA in Active Psoriasis
XIAO Zheng* ， GAO Jin， WANG Chunsen， et al.*
The Investigative Laboratory of Dermatology,First Hospital of Wuhan,430022
, 百拇医药
【 Abstract】 Objective To study the relationship between insulin-like growth factor Ⅰ receptor(IGFⅠ R)and active psoriasis.Methods The skin biopsies from active psoriatic lesions in fifteen cases with psoriasis and ten normal persons were investigated by immunohistochemical technique,RT-PCR and in situ hybridization.Results The expressions of IGFⅠ R protein and mRNA were located on the basal cell layers and prickle cell layers.There was significant difference of mRNA expression between the normal and psoriatic groups(P<0.01).Conclusion The increased expression of IGFⅠ R protein and mRNA may mediate the hyperplasia and parakeratosis of keratinocytes in active psoriasis.
, 百拇医药
【 Key words】 Psoriasis Receptors,insulin-like-growth factorⅠ RNA,messenger
材料与方法
1.病例:寻常型进行期银屑病患者15例,经临床与组织病理检查确诊,其中男7例,女8例,年龄13～67岁。取患者典型皮损活检。正常人皮肤组织块标本10份,均源于外科整形手术,男女各半,年龄与银屑病组匹配。所有标本一分为二,一块经10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片4μm;另一半经0.25%胰蛋白酶4℃消化过夜,置37℃0.5h,用镊子小心分离表皮真皮,置于经DEPC处理过的Eppendorf管,液氮罐中保存备用。
2.免疫组织化学:兔抗人IGFⅠR多克隆抗体(美国SantaCruz公司),SP试剂盒(美国Zymed公司)。具体步骤为切片常规脱蜡至水,3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,滴加10%羊血清,滴加IGFⅠR多克隆抗体(1∶40)4℃过夜,滴加生物素标记二抗37℃孵育20min,滴加HRP标记的链霉亲和素,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,中性树脂封片。
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3.逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR):表皮、真皮组织中总RNA的提取按Chomczynski等介绍的异硫氰酸胍-酚-氯仿法[2]，应用AMV逆转录酶合成cDNA,cDNA片段的扩增是在含有下面IGFⅠR特异引物的反应体系中进行。人IGFⅠR引物P15′-CCACCACCACGTCGAAGAATC-3′,引物P25′-ACGTAAACGGCGTACTGAGTC-3′。人β-珠蛋白作为内对照,其引物P35′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA
-3′,引物P45′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′。按以下步骤扩增:95℃10min热启动后加入Taq酶,94℃45s,55℃45s,72℃30s,一共35个循环后,72℃10min。反应产物在6%聚丙酰胺非变性胶上进行垂直电泳1h,凝胶银染,照相。
4.原位杂交:地高辛标记及检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)，IGFⅠRcDNA探针,是根据IGFⅠRcDNA序列设计特异性引物P1、P2,利用RT-PCR合成,片段长度208bp,应用随机引物法以地高辛标记。具体步骤:组织切片置37℃预杂交1h,每片加杂交液10μL(预杂交液中加探针2.5g/mL),95℃组织变性10min,冰上骤冷,42℃杂交36h,不同浓度SSC和SDS漂洗,按免疫酶标法滴加抗地高辛抗体,NBT显色,脱水,透明,封片。
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5.图像分析与统计:应用MPIAS-500多媒体病理分析系统，分别测量IGFⅠR蛋白及mRNA的积分光密度值,IGFⅠR蛋白的面密度值(总面积与测量窗面积之比),并对IGFⅠR及β-珠蛋白扩增条带进行密度扫描,计算出IGFⅠR/β-珠蛋白密度相对比值,以此代表IGFⅠRmRNA相对表达水平[3],分别作t检验。
结果
1.在排除非特异性染色情况下,细胞膜上出现棕黄色为IGFⅠR蛋白阳性细胞。15例进行期银屑病患者表皮基底细胞层及棘细胞层可见棕色IGFⅠR蛋白表达，角质层无表达(图1);正常人表皮中仅基底细胞层细胞膜表面可见IGFⅠR蛋白表达。
图1 银屑病患者表皮胰岛素样生因子Ⅰ受体蛋白表达
2.逆转录酶聚合酶链反应后,6%聚丙酰胺非变性胶垂直电泳结果显示,从表皮中可以扩增出208bp的IGFⅠR和115bp的人β-珠蛋白cDNA片段,表明表皮中有IGFⅠRmRNA表达,从真皮只能扩增115bp的人β-珠蛋白cDNA片段,表明真皮中没有IGFⅠR表达。
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3.以胞浆中出现均匀蓝紫色颗粒状沉积物为cDNARNA杂交信号,此为阳性染色。以肝癌组织为阳性对照。以PBS替代探针及抗地高辛抗体为阴性对照。15例进行期银屑病患者表皮基底细胞层与棘细胞层均可见IGFⅠRmRNA表达,角质层及颗粒层未见表达(图2)，正常表皮中仅基底细胞层可见表达。
图2 银屑病患者表皮胰岛素样生因子Ⅰ受体蛋白mRNA表达
4.图象分析：见表1。正常人组IGFⅠR蛋白面密度值、积分光密度值与进行期银屑病患者组比较，差异有显著性(P<0.01)，而IGFⅠRmRNA/β-珠蛋白光密度相对比值，正常人组与银屑病患者组间差异有显著性(P<0.01)，积分光密度两组间差异也有显著性(P<0.01)。
表1 正常人与进行期银屑病患者胰岛素样生长
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因子Ⅰ受体(IGFⅠR)蛋白与mRNA的表达比较(
±s) 组别
例数
IGF1R蛋白
IGF1RmRNA
面密度值
积分光密度值
IGF1R/β-珠蛋白
积分光密度值
正常人
10
2.893±0.673
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4.115±0.971
0.510±0.065
3.198±0.623
银屑病
15
17.511±2.472
17.117±4.121
0.825±0.121
8.595±2.410
t值
18.14
9.74
, 百拇医药
7.50
6.88
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
讨论
Neely[4]等对正常角质形成细胞及鳞状细胞癌株单层培养中发现这些细胞上存在IGFⅠR,IGFⅠ的丝裂原作用比胰岛素强,而且这种作用可被IGFⅠR的单克隆抗体αIR-3所阻断,IGFⅠ及其受体可能与角质形成细胞的增殖与分化有关。IGF-Ⅰ与IGF-ⅠR具有高度的亲和性,结合后可以激活酪氨酸蛋白激酶活性,表现为细胞的增殖与分化。Hodak[5]等应用IGF-ⅠR的单克隆抗体进行免疫组化研究发现银屑病表皮中IGF-ⅠR过度表达,定位在基底层与棘细胞层下部,与银屑病表皮中角质形成细胞增殖的空间大小一致,并发现该受体的调节与不同的表皮分化状态有关,在高分化的上皮细胞膜该受体的表达呈下调状态。我们应用IGFⅠR的多克隆抗体研究进行期银屑病表皮中的表达,证实了Hodak等的观点。说明IGFⅠR与角质形成细胞的增殖与分化密切有关。我们还通过图像分析技术,发现进行期银屑病与正常人角质形成细胞表面IGFⅠR蛋白的面密度与积分光密度值存在极显著性差异,表明两者表皮IGFⅠR蛋白在数量与程度上不同,并显著高于正常人。IGFⅠR可作为反映银屑病角质形成细胞增殖与分化的一个指标。
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RT-PCR[6]可以用来快速扩增细胞因子，我们从Genbank中查出人IGFⅠR的cDNA序列,该序列长4989bp,编码1367个氨基酸，完全糖基化后产生α(135000Mr)亚单位和β(90000Mr)亚单位，我们扩增IGFⅠR5端108bp(1558-1766)片段长cDNA,它负责编码IGFⅠR胞外α亚单位的第3、4多肽上，特异性高，同源性低(47%)。IGFⅠ与细胞表面的受体结合刺激了胞浆内信号连锁过程，包括β亚单位部分残基磷酸化。我们应用RTPCR技术检测进行期银屑病皮损，发现其表皮中IGFⅠRmRNA呈高表达，与正常人相比差异有显著性(P<0.01),真皮中没有表达，说明IGFⅠR主要存在于占表皮95%的角质形成细胞上，由成纤维细胞和黑素细胞分泌的IGFⅠ可能通过旁分泌机制作用于角质形成细胞IGFⅠR。
参考文献
1 Grinspoon S,Corcoran C,Stanley T,et al.Effects of androgen administration on growth hormone-insulin-like growth factor 1 axis in men with acquired immunodeficiency syndrome wasting.J Clin Endocrinol Metab,1998,83:4251-4256.
, 百拇医药
2 卢圣栋主编.现代分子生物学.第1版.北京:高等教育出版社，1996.416.
3 Gold KG,Weyand CM,Goronzy JJ.Mudulation of higher T cell function by prostaglandins.Arthritis Reum,1984,37:925.
4 Neely EK,Morhenn VB,Hinz RL,et al.Insulin-like growth factors are mitogenic for human keratinocytes and a squamous cell carcinoma.J Invest Dermatol， 1991,96:104- 110.
5 Hodak E,Gottlieb AB,Anzilotti M,et al.The insulin-like growth factor 1 receptor is expressed by epithelial cells with proliferative potential in human epidermis and skin appendages:correlation of increased expression with epidermal hyperplasia.J Invest Dermatol,1996,106:564- 570.
6 鞠细文，曹雪涛综述.应用逆转录PCR技术检测细胞因子基因表达.国外医学免疫学分册，1995,18:182-186.
(收稿：1998-11-12修回：1999-07-26), 百拇医药
单位：肖征 高进 胡长发 430022武汉，武汉市第一医院皮肤病研究室；王椿森 同济医科大学附属协和医院皮肤科
关键词：银屑病受体，胰岛素样生长因子ⅠRNA，信使
中华皮肤科杂志/990608
【摘要】目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGFⅠR)和进行期银屑病的关系。方法 应用免疫组织化学技术，逆转录酶聚合酶链反应和原位杂交分别检测15例银屑病患者和10例正常人皮肤组织块中IGFⅠR蛋白与mRNA的表达。结果 IGFⅠR蛋白与mRNA表达在银屑病患者基底层和棘细胞层,IGFⅠR蛋白与mRNA相对积分光密度值在正常对照组与银屑病组间存在极显著性差异(P<0.01)。结论 进行期银屑病患者皮损中表达增加的IGFⅠR蛋白和mRNA可能介导了角质形成细胞的增殖与分化不全。
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胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-likegrowthfactorⅠ,IGFⅠ)是胰岛素家族中的一员,由生长激素(growth hormone,GH)诱导分泌,IGFⅠ负反馈作用于GH,构成GHIGF轴[1]，此轴通过IGFⅠR作用于角质形成细胞。我们应用蛋白与基因检测技术检测了IGFⅠR蛋白与mRNA在进行期银屑病患者中的表达。
Expression of Insulin like Growth Factor
Ⅰ Receptor Protein and mRNA in Active Psoriasis
XIAO Zheng* ， GAO Jin， WANG Chunsen， et al.*
The Investigative Laboratory of Dermatology,First Hospital of Wuhan,430022
, 百拇医药
【 Abstract】 Objective To study the relationship between insulin-like growth factor Ⅰ receptor(IGFⅠ R)and active psoriasis.Methods The skin biopsies from active psoriatic lesions in fifteen cases with psoriasis and ten normal persons were investigated by immunohistochemical technique,RT-PCR and in situ hybridization.Results The expressions of IGFⅠ R protein and mRNA were located on the basal cell layers and prickle cell layers.There was significant difference of mRNA expression between the normal and psoriatic groups(P<0.01).Conclusion The increased expression of IGFⅠ R protein and mRNA may mediate the hyperplasia and parakeratosis of keratinocytes in active psoriasis.
, 百拇医药
【 Key words】 Psoriasis Receptors,insulin-like-growth factorⅠ RNA,messenger
材料与方法
1.病例:寻常型进行期银屑病患者15例,经临床与组织病理检查确诊,其中男7例,女8例,年龄13～67岁。取患者典型皮损活检。正常人皮肤组织块标本10份,均源于外科整形手术,男女各半,年龄与银屑病组匹配。所有标本一分为二,一块经10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片4μm;另一半经0.25%胰蛋白酶4℃消化过夜,置37℃0.5h,用镊子小心分离表皮真皮,置于经DEPC处理过的Eppendorf管,液氮罐中保存备用。
2.免疫组织化学:兔抗人IGFⅠR多克隆抗体(美国SantaCruz公司),SP试剂盒(美国Zymed公司)。具体步骤为切片常规脱蜡至水,3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,滴加10%羊血清,滴加IGFⅠR多克隆抗体(1∶40)4℃过夜,滴加生物素标记二抗37℃孵育20min,滴加HRP标记的链霉亲和素,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水,透明,中性树脂封片。
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3.逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR):表皮、真皮组织中总RNA的提取按Chomczynski等介绍的异硫氰酸胍-酚-氯仿法[2]，应用AMV逆转录酶合成cDNA,cDNA片段的扩增是在含有下面IGFⅠR特异引物的反应体系中进行。人IGFⅠR引物P15′-CCACCACCACGTCGAAGAATC-3′,引物P25′-ACGTAAACGGCGTACTGAGTC-3′。人β-珠蛋白作为内对照,其引物P35′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA
-3′,引物P45′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′。按以下步骤扩增:95℃10min热启动后加入Taq酶,94℃45s,55℃45s,72℃30s,一共35个循环后,72℃10min。反应产物在6%聚丙酰胺非变性胶上进行垂直电泳1h,凝胶银染,照相。
4.原位杂交:地高辛标记及检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)，IGFⅠRcDNA探针,是根据IGFⅠRcDNA序列设计特异性引物P1、P2,利用RT-PCR合成,片段长度208bp,应用随机引物法以地高辛标记。具体步骤:组织切片置37℃预杂交1h,每片加杂交液10μL(预杂交液中加探针2.5g/mL),95℃组织变性10min,冰上骤冷,42℃杂交36h,不同浓度SSC和SDS漂洗,按免疫酶标法滴加抗地高辛抗体,NBT显色,脱水,透明,封片。
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5.图像分析与统计:应用MPIAS-500多媒体病理分析系统，分别测量IGFⅠR蛋白及mRNA的积分光密度值,IGFⅠR蛋白的面密度值(总面积与测量窗面积之比),并对IGFⅠR及β-珠蛋白扩增条带进行密度扫描,计算出IGFⅠR/β-珠蛋白密度相对比值,以此代表IGFⅠRmRNA相对表达水平[3],分别作t检验。
结果
1.在排除非特异性染色情况下,细胞膜上出现棕黄色为IGFⅠR蛋白阳性细胞。15例进行期银屑病患者表皮基底细胞层及棘细胞层可见棕色IGFⅠR蛋白表达，角质层无表达(图1);正常人表皮中仅基底细胞层细胞膜表面可见IGFⅠR蛋白表达。
图1 银屑病患者表皮胰岛素样生因子Ⅰ受体蛋白表达
2.逆转录酶聚合酶链反应后,6%聚丙酰胺非变性胶垂直电泳结果显示,从表皮中可以扩增出208bp的IGFⅠR和115bp的人β-珠蛋白cDNA片段,表明表皮中有IGFⅠRmRNA表达,从真皮只能扩增115bp的人β-珠蛋白cDNA片段,表明真皮中没有IGFⅠR表达。
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3.以胞浆中出现均匀蓝紫色颗粒状沉积物为cDNARNA杂交信号,此为阳性染色。以肝癌组织为阳性对照。以PBS替代探针及抗地高辛抗体为阴性对照。15例进行期银屑病患者表皮基底细胞层与棘细胞层均可见IGFⅠRmRNA表达,角质层及颗粒层未见表达(图2)，正常表皮中仅基底细胞层可见表达。
图2 银屑病患者表皮胰岛素样生因子Ⅰ受体蛋白mRNA表达
4.图象分析：见表1。正常人组IGFⅠR蛋白面密度值、积分光密度值与进行期银屑病患者组比较，差异有显著性(P<0.01)，而IGFⅠRmRNA/β-珠蛋白光密度相对比值，正常人组与银屑病患者组间差异有显著性(P<0.01)，积分光密度两组间差异也有显著性(P<0.01)。
表1 正常人与进行期银屑病患者胰岛素样生长
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因子Ⅰ受体(IGFⅠR)蛋白与mRNA的表达比较(
±s) 组别例数
IGF1R蛋白
IGF1RmRNA
面密度值
积分光密度值
IGF1R/β-珠蛋白
积分光密度值
正常人
10
2.893±0.673
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4.115±0.971
0.510±0.065
3.198±0.623
银屑病
15
17.511±2.472
17.117±4.121
0.825±0.121
8.595±2.410
t值
18.14
9.74
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7.50
6.88
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
讨论
Neely[4]等对正常角质形成细胞及鳞状细胞癌株单层培养中发现这些细胞上存在IGFⅠR,IGFⅠ的丝裂原作用比胰岛素强,而且这种作用可被IGFⅠR的单克隆抗体αIR-3所阻断,IGFⅠ及其受体可能与角质形成细胞的增殖与分化有关。IGF-Ⅰ与IGF-ⅠR具有高度的亲和性,结合后可以激活酪氨酸蛋白激酶活性,表现为细胞的增殖与分化。Hodak[5]等应用IGF-ⅠR的单克隆抗体进行免疫组化研究发现银屑病表皮中IGF-ⅠR过度表达,定位在基底层与棘细胞层下部,与银屑病表皮中角质形成细胞增殖的空间大小一致,并发现该受体的调节与不同的表皮分化状态有关,在高分化的上皮细胞膜该受体的表达呈下调状态。我们应用IGFⅠR的多克隆抗体研究进行期银屑病表皮中的表达,证实了Hodak等的观点。说明IGFⅠR与角质形成细胞的增殖与分化密切有关。我们还通过图像分析技术,发现进行期银屑病与正常人角质形成细胞表面IGFⅠR蛋白的面密度与积分光密度值存在极显著性差异,表明两者表皮IGFⅠR蛋白在数量与程度上不同,并显著高于正常人。IGFⅠR可作为反映银屑病角质形成细胞增殖与分化的一个指标。
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RT-PCR[6]可以用来快速扩增细胞因子，我们从Genbank中查出人IGFⅠR的cDNA序列,该序列长4989bp,编码1367个氨基酸，完全糖基化后产生α(135000Mr)亚单位和β(90000Mr)亚单位，我们扩增IGFⅠR5端108bp(1558-1766)片段长cDNA,它负责编码IGFⅠR胞外α亚单位的第3、4多肽上，特异性高，同源性低(47%)。IGFⅠ与细胞表面的受体结合刺激了胞浆内信号连锁过程，包括β亚单位部分残基磷酸化。我们应用RTPCR技术检测进行期银屑病皮损，发现其表皮中IGFⅠRmRNA呈高表达，与正常人相比差异有显著性(P<0.01),真皮中没有表达，说明IGFⅠR主要存在于占表皮95%的角质形成细胞上，由成纤维细胞和黑素细胞分泌的IGFⅠ可能通过旁分泌机制作用于角质形成细胞IGFⅠR。
参考文献
1 Grinspoon S,Corcoran C,Stanley T,et al.Effects of androgen administration on growth hormone-insulin-like growth factor 1 axis in men with acquired immunodeficiency syndrome wasting.J Clin Endocrinol Metab,1998,83:4251-4256.
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2 卢圣栋主编.现代分子生物学.第1版.北京:高等教育出版社，1996.416.
3 Gold KG,Weyand CM,Goronzy JJ.Mudulation of higher T cell function by prostaglandins.Arthritis Reum,1984,37:925.
4 Neely EK,Morhenn VB,Hinz RL,et al.Insulin-like growth factors are mitogenic for human keratinocytes and a squamous cell carcinoma.J Invest Dermatol， 1991,96:104- 110.
5 Hodak E,Gottlieb AB,Anzilotti M,et al.The insulin-like growth factor 1 receptor is expressed by epithelial cells with proliferative potential in human epidermis and skin appendages:correlation of increased expression with epidermal hyperplasia.J Invest Dermatol,1996,106:564- 570.
6 鞠细文，曹雪涛综述.应用逆转录PCR技术检测细胞因子基因表达.国外医学免疫学分册，1995,18:182-186.
(收稿：1998-11-12修回：1999-07-26), 百拇医药