豚鼠光变态反应性接触性皮炎及ICAM-1/LFA-1的表达
作者：王晓彦 刘玲玲 朱学骏
单位：刘玲玲 朱学骏 100034北京医科大学第一医院皮肤科；王晓彦 现在内蒙古医学院附院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志/990619
光变态反应性接触性皮炎(PACD)是紫外线激发、细胞介导的对光敏物质的一种迟发性超敏反应,从组织学及发生机制上类似变态反应性接触性皮炎,所不同的是引起PACD的致敏物需要紫外线的活化才能诱导及激发这个反应。ICAM-1/LFA-1相互作用是使淋巴细胞/或单核细胞粘附角质形成细胞(KC)的主要途径。T细胞在KC表达ICAM-1上起重要作用,T细胞表面的LFA-1和KC表面的ICAM-1相结合产生T细胞浸润,浸润越明显,ICAM-1表达程度越高,提示ICAM-1在介导真皮炎症细胞浸润中起重要作用[1]。本研究利用光敏剂6-甲基香豆素(6-MC)制作豚鼠6-MC+UVAPACD模型,并以6-MC+UVB做对照,以ABC免疫组化法观察ICAM1/LFA-1在皮损处的表达情况并对其与皮肤炎症反应程度的相关性进行了分析,以探讨ICAM-1/LFA-1在PACD发生中的作用。
, http://www.100md.com
一、材料和方法
(一)豚鼠PACD模型的建立：
1.动物及光源：29只白色雌性豚鼠由北京医科大学动物实验中心提供,体重250～300g,光源为德国Waldmann Lichttechnik紫外治疗灯,灯管为Philips TL20w/12RS荧光灯,UVA每管输出功率为40W,光谱为320～400nm,最强吸收波长355nm;UVB每管输出功率为20W,光谱范围280～320nm,最大波长310～315nm。照光距离20cm。
2.PACD诱导及激发步骤：光敏剂6-MC(德国),溶媒(丙酮∶酒精=1∶1),福氏完全佐剂(FCA,Gibco公司)。豚鼠颈肩部用石蜡∶松香为1∶1脱毛,脱毛区4cm×2cm,残留毳毛及角质用医用胶布粘脱,步骤按Ichikawa[2]所述进行。测UVA最小红斑量(MED)28J/cm2,诱导时采用14J/cm2,激发时28J/cm2,测UVBMED70mJ/cm2，诱导时140mJ/cm2,激发时60mJ/cm2。
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(二)活体取材：正常豚鼠背部及UV照射后红斑肿胀不同时相于背部皮损处活检取材,置于OCT包埋液并送冰冻-20℃储存备用。部分做常规染色,部分做ICAM-1/LFA-1免疫组化染色。
(三)免疫组化试剂及染色、观察方法：
1.免疫组化试剂及方法:多克隆兔抗人ICAM-1(CD54),效价1∶100,单克隆大鼠抗小鼠LFA-1,效价1∶200,生物素化的羊抗兔IgG(次级抗体),效价1∶300,链霉亲和素标记的过氧化物酶1∶300,以上抗体均购自北京生物技术公司。染色方法按免疫组化常规进行。
2.观察方法：每张切片由2位观察者独立计数,随机取染色区域的4个高倍视野(×400)染色细胞的平均数,ICAM-1用半定量评分。染色强度分0～3级,0:无染色，1:轻度染色，2:中度染色，3:强染色。染色密度为KC阳性百分数,0:无染色，1:<25%的细胞染色，2:25%～50%细胞染色，3:50%～70%细胞染色，4:>70%的细胞染色。LFA-1[3]染色密度，0:无染色，1:1～10个炎细胞阳性，2:11～20个炎细胞染色阳性，3:21～75个炎细胞染色阳性，4:>75个炎细胞染色阳性。染色总评分：染色强度+染色范围。
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二、结果
(一)紫外线激发后临床表现：
1.自身对照组：照光侧涂有10%、1%6-MC处出现红斑肿胀,照光侧涂溶媒部位皮肤无反应,豚鼠右侧遮光,但涂有10%、1%6-MC及溶媒处皮肤无反应。
2.15只豚鼠6-MC+UVA激发后48h红斑水肿程度最强,皮肤红斑反应评价积分平均为1.57,在72～96h红斑积分保持不变。而9只豚鼠6-MC+UVB激发后24h红斑水肿程度最强,皮肤红斑反应评价积分平均为2.75,48h后红斑积分明显下降。皮肤红斑反应程度与本实验采用的6-MC浓度(10%、1%)无关。3.5例正常对照组,无诱导、未涂6-MC而单用UVA14J/cm2和28J/cm2照射组,皮肤无红斑反应,单用UVB70mJ/cm2和140mJ/cm2组,可见红斑反应。
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(二)UV激发后红斑的组织病理：
1.6-MC+UVA所引起的红斑：于48～72h取材做病理可见角化过度,棘层肥厚,海绵样水肿,细胞内水肿,网状变性,表皮内小水疱,少数坏死KC,真皮浅层小血管扩张,周围淋巴组织细胞及少许多形核白细胞(PMN)浸润。
2.6-MC+UVB所引起的红斑：于24h取材,表皮内见坏死KC,细胞内水肿,网状变性,PMN进入表皮并在角质层聚集,真皮浅层小血管扩张、充血,周围PMN、淋巴细胞浸润。
3.单用UVA组：于48h取材可见表皮灶性轻度海绵样水肿,真皮浅层小血管周围稀疏淋巴细胞浸润。
4.单用UVB组：于48h取材可见表皮灶性轻度海绵样水肿,真皮浅层小血管周围PMN、淋巴细胞浸润。
(三)ICAM-1/LFA-1免疫组化染色结果：
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1.ICAM-1免疫组化染色结果：KC膜棕色染色为ICAM-1阳性染色,正常皮肤ICAM-1在真皮小血管内皮细胞及周围淋巴细胞表面弱到中度染色。豚鼠6-MC+UVA红斑KCICAM-1染色均匀,从基底层到角质层几乎全层分布,染色范围广,染色强度多为中度。6-MC+UVB红斑KCICAM-1染色呈灶性,主要分布在棘细胞上层到角质层,在PMN进入表皮处呈强阳性,正常皮肤及单用UVA组KCICAM-1染色为阴性。6-MC+UVA红斑于72h染色评分为5.67±1.26,48h时为4.40±1.48，两者比较，差异有显著性(t检验，P<0.05)。6-MC+UVB红斑于24h染色评分为5.94±1.07，48h时为5.78±1.06，两者比较差异无显著性。
2.LFA-1免疫组化染色结果：正常皮肤真皮浅层淋巴细胞、PMN表面可见散在弱阳性染色,炎症时LFA-1表达增强,阳性染色细胞增多。6-MC+UVA红斑于72h染色评分为4.00±1.22，48h时为3.93±1.88；6-MC+UVB48h染色评分为6.56±0.77,24h时为6.00±1.12,与ICAM-1染色评分情况符合。单用UVA组在皮损处真皮浅层小血管周围可见少数LFA-1染色阳性的淋巴细胞、PMN。
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(四)ICAM-1与LFA-1相关性检验，r=0.45,P<0.01,ICAM-1/LFA-1染色评分与临床红斑反应程度相关性检验,r=0.70,P<0.01,均呈正相关。
三、讨论
6-MC是一种合成的香料,存在于许多日常生活用品中,是国际上公认的光敏剂,在275nm吸收最多,在320～400nm时产生第2个吸收峰值。筛选光敏物质常见的动物模型为豚鼠及小鼠。
本文建立了豚鼠6-MC+UVAPACD模型。从本实验结果分析,UVB红斑水肿最高积分在24h,较UVA强,但48h后很快消退,UVA红斑水肿最高积分在48h,并在48～72h保持不变。单用UVA照射组皮肤无红斑反应,单用UVB照射组皮肤可见红斑反应。说明UVB红斑出现早,反应强,但很快消退,UVA红斑出现晚,反应稍弱,但持续时间长。从临床情况看,6-MC+UVA红斑过程符合光引起的变态反应,6-MC+UVB红斑过程符合光生物学效应。从组织病理改变看,也可以说明6-MC+UVA红斑表现为变态反应性光敏性皮炎,6-MC+UVB红斑符合急性日晒伤。
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从我们所进行的豚鼠6-MC+UVA、6-MC+UVBICAM-1/LFA-1免疫组化染色结果看,6-MC+UVAICAM-1/LFA-1染色呈阳性,并于72h染色评分最高,与48h比较有统计学意义(P<0.05),6-MC+UVB红斑ICAM-1/LFA-1染色于24h染色评分最高,6-MC+UVA与6-MC+UVB染色评分在48h比较有统计学意义(P<0.05)。而单用UVA照射皮肤未见红斑,ICAM-1染色于48hKC表面为阴性。从染色部位看,6-MC+UVA与6-MC+UVB不同,6-MC+UVAICAM-1染色均匀,从基底层到角质层几乎全层分布,染色强度多为中度,6-MC+UVB染色呈灶性,主要分布在棘细胞上层到角质层,在PMN进入表皮处呈强阳性。因此,从ICAM-1/LFA-1免疫组化染色情况看,也支持6-MC+UVA是一个免疫学过程。志谢北京医科大学第一医院皮肤科涂平副教授、武玲慎技师
西安杨森皮肤科学教育和研究基金资助课题
参考文献
, http://www.100md.com
1 Baker JNWN,Allen MH,MacDonald DM. The effect of in vivo interferin- gamma on the distribution of LFA- 1 and ICAM- 1 in nomal human skin. J Invest Dermatol, 1989,93:439- 442.
2 Ichikawa H,Armstrong RB,Harber LC. Photoallergic contact dermatitis in guinea pigs:improved induction technique using Freund′ s complete adjuvant. J Invest Dermatol, 1981,76:498- 501.
3 Norris P,Poston RN,Thomas DS, et al. The expression of endothelial leukocyte adhesion molecule- 1(ELAM- 1),intercellular adhesion molecule- 1(ICMA- 1) and vascular adhesion molecule- 1(VCAM- 1) in experimental cutaneous inflammation:a comparison of ultraviolet B erythema and delayed hypersensitivity. J Invest Dermatol, 1991,96:763- 770.
(收稿：1999-01-11修回：1999-05-04), 百拇医药
单位：刘玲玲 朱学骏 100034北京医科大学第一医院皮肤科；王晓彦 现在内蒙古医学院附院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志/990619
光变态反应性接触性皮炎(PACD)是紫外线激发、细胞介导的对光敏物质的一种迟发性超敏反应,从组织学及发生机制上类似变态反应性接触性皮炎,所不同的是引起PACD的致敏物需要紫外线的活化才能诱导及激发这个反应。ICAM-1/LFA-1相互作用是使淋巴细胞/或单核细胞粘附角质形成细胞(KC)的主要途径。T细胞在KC表达ICAM-1上起重要作用,T细胞表面的LFA-1和KC表面的ICAM-1相结合产生T细胞浸润,浸润越明显,ICAM-1表达程度越高,提示ICAM-1在介导真皮炎症细胞浸润中起重要作用[1]。本研究利用光敏剂6-甲基香豆素(6-MC)制作豚鼠6-MC+UVAPACD模型,并以6-MC+UVB做对照,以ABC免疫组化法观察ICAM1/LFA-1在皮损处的表达情况并对其与皮肤炎症反应程度的相关性进行了分析,以探讨ICAM-1/LFA-1在PACD发生中的作用。
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一、材料和方法
(一)豚鼠PACD模型的建立：
1.动物及光源：29只白色雌性豚鼠由北京医科大学动物实验中心提供,体重250～300g,光源为德国Waldmann Lichttechnik紫外治疗灯,灯管为Philips TL20w/12RS荧光灯,UVA每管输出功率为40W,光谱为320～400nm,最强吸收波长355nm;UVB每管输出功率为20W,光谱范围280～320nm,最大波长310～315nm。照光距离20cm。
2.PACD诱导及激发步骤：光敏剂6-MC(德国),溶媒(丙酮∶酒精=1∶1),福氏完全佐剂(FCA,Gibco公司)。豚鼠颈肩部用石蜡∶松香为1∶1脱毛,脱毛区4cm×2cm,残留毳毛及角质用医用胶布粘脱,步骤按Ichikawa[2]所述进行。测UVA最小红斑量(MED)28J/cm2,诱导时采用14J/cm2,激发时28J/cm2,测UVBMED70mJ/cm2，诱导时140mJ/cm2,激发时60mJ/cm2。
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(二)活体取材：正常豚鼠背部及UV照射后红斑肿胀不同时相于背部皮损处活检取材,置于OCT包埋液并送冰冻-20℃储存备用。部分做常规染色,部分做ICAM-1/LFA-1免疫组化染色。
(三)免疫组化试剂及染色、观察方法：
1.免疫组化试剂及方法:多克隆兔抗人ICAM-1(CD54),效价1∶100,单克隆大鼠抗小鼠LFA-1,效价1∶200,生物素化的羊抗兔IgG(次级抗体),效价1∶300,链霉亲和素标记的过氧化物酶1∶300,以上抗体均购自北京生物技术公司。染色方法按免疫组化常规进行。
2.观察方法：每张切片由2位观察者独立计数,随机取染色区域的4个高倍视野(×400)染色细胞的平均数,ICAM-1用半定量评分。染色强度分0～3级,0:无染色，1:轻度染色，2:中度染色，3:强染色。染色密度为KC阳性百分数,0:无染色，1:<25%的细胞染色，2:25%～50%细胞染色，3:50%～70%细胞染色，4:>70%的细胞染色。LFA-1[3]染色密度，0:无染色，1:1～10个炎细胞阳性，2:11～20个炎细胞染色阳性，3:21～75个炎细胞染色阳性，4:>75个炎细胞染色阳性。染色总评分：染色强度+染色范围。
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二、结果
(一)紫外线激发后临床表现：
1.自身对照组：照光侧涂有10%、1%6-MC处出现红斑肿胀,照光侧涂溶媒部位皮肤无反应,豚鼠右侧遮光,但涂有10%、1%6-MC及溶媒处皮肤无反应。
2.15只豚鼠6-MC+UVA激发后48h红斑水肿程度最强,皮肤红斑反应评价积分平均为1.57,在72～96h红斑积分保持不变。而9只豚鼠6-MC+UVB激发后24h红斑水肿程度最强,皮肤红斑反应评价积分平均为2.75,48h后红斑积分明显下降。皮肤红斑反应程度与本实验采用的6-MC浓度(10%、1%)无关。3.5例正常对照组,无诱导、未涂6-MC而单用UVA14J/cm2和28J/cm2照射组,皮肤无红斑反应,单用UVB70mJ/cm2和140mJ/cm2组,可见红斑反应。
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(二)UV激发后红斑的组织病理：
1.6-MC+UVA所引起的红斑：于48～72h取材做病理可见角化过度,棘层肥厚,海绵样水肿,细胞内水肿,网状变性,表皮内小水疱,少数坏死KC,真皮浅层小血管扩张,周围淋巴组织细胞及少许多形核白细胞(PMN)浸润。
2.6-MC+UVB所引起的红斑：于24h取材,表皮内见坏死KC,细胞内水肿,网状变性,PMN进入表皮并在角质层聚集,真皮浅层小血管扩张、充血,周围PMN、淋巴细胞浸润。
3.单用UVA组：于48h取材可见表皮灶性轻度海绵样水肿,真皮浅层小血管周围稀疏淋巴细胞浸润。
4.单用UVB组：于48h取材可见表皮灶性轻度海绵样水肿,真皮浅层小血管周围PMN、淋巴细胞浸润。
(三)ICAM-1/LFA-1免疫组化染色结果：
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1.ICAM-1免疫组化染色结果：KC膜棕色染色为ICAM-1阳性染色,正常皮肤ICAM-1在真皮小血管内皮细胞及周围淋巴细胞表面弱到中度染色。豚鼠6-MC+UVA红斑KCICAM-1染色均匀,从基底层到角质层几乎全层分布,染色范围广,染色强度多为中度。6-MC+UVB红斑KCICAM-1染色呈灶性,主要分布在棘细胞上层到角质层,在PMN进入表皮处呈强阳性,正常皮肤及单用UVA组KCICAM-1染色为阴性。6-MC+UVA红斑于72h染色评分为5.67±1.26,48h时为4.40±1.48，两者比较，差异有显著性(t检验，P<0.05)。6-MC+UVB红斑于24h染色评分为5.94±1.07，48h时为5.78±1.06，两者比较差异无显著性。
2.LFA-1免疫组化染色结果：正常皮肤真皮浅层淋巴细胞、PMN表面可见散在弱阳性染色,炎症时LFA-1表达增强,阳性染色细胞增多。6-MC+UVA红斑于72h染色评分为4.00±1.22，48h时为3.93±1.88；6-MC+UVB48h染色评分为6.56±0.77,24h时为6.00±1.12,与ICAM-1染色评分情况符合。单用UVA组在皮损处真皮浅层小血管周围可见少数LFA-1染色阳性的淋巴细胞、PMN。
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(四)ICAM-1与LFA-1相关性检验，r=0.45,P<0.01,ICAM-1/LFA-1染色评分与临床红斑反应程度相关性检验,r=0.70,P<0.01,均呈正相关。
三、讨论
6-MC是一种合成的香料,存在于许多日常生活用品中,是国际上公认的光敏剂,在275nm吸收最多,在320～400nm时产生第2个吸收峰值。筛选光敏物质常见的动物模型为豚鼠及小鼠。
本文建立了豚鼠6-MC+UVAPACD模型。从本实验结果分析,UVB红斑水肿最高积分在24h,较UVA强,但48h后很快消退,UVA红斑水肿最高积分在48h,并在48～72h保持不变。单用UVA照射组皮肤无红斑反应,单用UVB照射组皮肤可见红斑反应。说明UVB红斑出现早,反应强,但很快消退,UVA红斑出现晚,反应稍弱,但持续时间长。从临床情况看,6-MC+UVA红斑过程符合光引起的变态反应,6-MC+UVB红斑过程符合光生物学效应。从组织病理改变看,也可以说明6-MC+UVA红斑表现为变态反应性光敏性皮炎,6-MC+UVB红斑符合急性日晒伤。
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从我们所进行的豚鼠6-MC+UVA、6-MC+UVBICAM-1/LFA-1免疫组化染色结果看,6-MC+UVAICAM-1/LFA-1染色呈阳性,并于72h染色评分最高,与48h比较有统计学意义(P<0.05),6-MC+UVB红斑ICAM-1/LFA-1染色于24h染色评分最高,6-MC+UVA与6-MC+UVB染色评分在48h比较有统计学意义(P<0.05)。而单用UVA照射皮肤未见红斑,ICAM-1染色于48hKC表面为阴性。从染色部位看,6-MC+UVA与6-MC+UVB不同,6-MC+UVAICAM-1染色均匀,从基底层到角质层几乎全层分布,染色强度多为中度,6-MC+UVB染色呈灶性,主要分布在棘细胞上层到角质层,在PMN进入表皮处呈强阳性。因此,从ICAM-1/LFA-1免疫组化染色情况看,也支持6-MC+UVA是一个免疫学过程。志谢北京医科大学第一医院皮肤科涂平副教授、武玲慎技师
西安杨森皮肤科学教育和研究基金资助课题
参考文献
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1 Baker JNWN,Allen MH,MacDonald DM. The effect of in vivo interferin- gamma on the distribution of LFA- 1 and ICAM- 1 in nomal human skin. J Invest Dermatol, 1989,93:439- 442.
2 Ichikawa H,Armstrong RB,Harber LC. Photoallergic contact dermatitis in guinea pigs:improved induction technique using Freund′ s complete adjuvant. J Invest Dermatol, 1981,76:498- 501.
3 Norris P,Poston RN,Thomas DS, et al. The expression of endothelial leukocyte adhesion molecule- 1(ELAM- 1),intercellular adhesion molecule- 1(ICMA- 1) and vascular adhesion molecule- 1(VCAM- 1) in experimental cutaneous inflammation:a comparison of ultraviolet B erythema and delayed hypersensitivity. J Invest Dermatol, 1991,96:763- 770.
(收稿：1999-01-11修回：1999-05-04), 百拇医药