聚合酶链反应检测单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段
作者：方险峰 白桦 宋彪 涂裕英
单位：510630广州，中山医科大学第三附属医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志/990616
单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白G(gG)基因位于HSVUS4序列区，是型间差异最大的一个糖蛋白基因，目前对其功能尚不甚明了，以此作为“靶位点”分型检测临床样本单纯疱疹病毒感染的PCR方法报道亦较少。我们建立并初步评价了一种可同时分型检测HSVgG基因的PCR方法，现报道如下。
一、材料与方法
1.临床标本：选择我科门诊临床诊断为生殖器疱疹(GH)的病例40例，共收集GH早期皮疹(水疱、脓疱)标本17份，中晚期皮疹(溃疡、结痂创面)标本23份，泌尿生殖道拭子标本40份。
, http://www.100md.com
2.HSV培养及鉴定：以Vero细胞分离培养HSV[1]。阳性培养结果以单克隆抗体间接免疫荧光试验予以鉴定(LP10抗HSV-ⅠgG，AP1抗HSV-ⅡgG，均由英国剑桥大学Minson教授惠赠)。HSV国际参考株HSV-ⅠF株，HSV-Ⅱ333株由湖北医科大学病毒研究所提供，并以微量空斑计数法标定病毒滴度。
3.HSVgG基因PCR方法：PCR引物设计参照已经公布的HSVDNA序列[1]，通过PCGENE软件比较HSV-Ⅰ及HSV-ⅡDNA的同源性，选择HSV-ⅠUS4序列区4351bp～4370bp片段为HSV-Ⅰ上游引物；HSV-ⅡHindⅢL序列区4707bp～4726bp片段为HSV-Ⅱ上游引物；HSV-ⅠUS4序列4818bp～4837bp(或HSV-ⅡHindⅢL序列区4903bp～4922bp)片段为型共同下游引物。按文献处理临床标本，构建PCR扩增反应体系并进行扩增反应[2]。温度循环按94℃45s、58℃45s、72℃1min进行。经2%琼脂糖凝胶电泳判断结果，出现216bp条带为HSV-Ⅱ阳性，出现490bp条带为HSV-Ⅰ阳性，对临床标本进行检测时以0.75空斑形成单位(pfu)HSV-ⅠF株及1.25pfuHSV-Ⅱ333株培养液为阳性对照(参见结果部分)。
, 百拇医药
对HSVgG基因PCR法与细胞培养法结果不一致的标本，以常用的HSVDNA聚合酶基因PCR法再次检测[3]。本文数据分析以SAS软件包进行χ2检验或精确概率法检验。
二、结果
1.引物设计：PCR引物选自gG基因跨膜区编码区，3条引物G+C含量均在61%左右，以PCROligo软件检索引物内部无重复序列，无发夹结构形成，引物间无4个以上连续碱基配对，且与已知DNA序列无配合。扩增产物在490bp及216bp处出现明亮带型，未见其它分子量带型出现。以标准病毒液为模板，当HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ量分别低于0.75pfu及1.25pfu时，即无明显扩增产物出现。
2.临床标本细胞培养法与HSVgG基因PCR法检测结果：80份临床标本细胞培养法与gG基因PCR法阳性者分别为32份(40%)及42份(52.5%)，两者差异具有显著性(P=0.005)；生殖器疱疹不同类型标本的阳性检出率见表1，中晚期皮疹标本HSVgG基因PCR法的阳性检出率显著高于细胞培养法(P=0.033)。30份细胞培养法与gG基因PCR法均阳性的标本，29份两法分型结果一致(HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ、HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ混合感染分别为2例、26例及1例)，1份细胞培养法示HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ混合感染，但gG基因PCR法示HSV-Ⅱ单独感染，经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测仍为HSV-Ⅱ单独感染。
, 百拇医药
细胞培养法与HSVgG基因PCR法出现14份不一致检测结果，12份gG基因PCR法阳性但细胞培养法阴性，经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测全部阳性。2份gG基因PCR法假阴性，经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测1份阳性，1份阴性。
表1 生殖器疱疹不同类型标本细胞培养法与gG基因PCR法的阳性检出率比较 标本类型
标本数
细胞培养阳性数(%)
PCR法*阳性数(%)
P值
早期皮疹拭子
17
16(94.1)
, 百拇医药
14(82.4)
0.301
中晚期皮疹拭子
23
5(21.7)
12(52.2)
0.033
泌尿生殖道拭子
40
11(27.5)
16(40.0)
0.172
, 百拇医药 注：为gG基因PCR法
若以细胞培养法及HSVDNA聚合酶基因PCR法为“扩大金标准”，则HSVgG基因PCR法的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为95.5%、100%、100%及94.7%。
三、讨论
近年来流行病学调查发现部分地区生殖器HSV-Ⅰ感染呈上升趋势[4]，对生殖器疱疹的临床诊断只进行HSV-Ⅱ检测，势必造成部分病例漏诊。为此我们选择了HSVgG基因跨膜区编码区，设计了两条型特异性上游引物及一条型共同下游引物，一次可同时分型扩增检测HSV-Ⅰ及HSV-ⅡDNA。扩增片段的长度相差一倍以上，结果易于判断。对生殖器疱疹标本检测的结果表明，gG基因PCR法不论在总体阳性率还是对生殖器疱疹中晚期皮疹标本的阳性检出率均显著高于细胞培养法(P值分别为0.005及0.033)；与单克隆抗体间接免疫荧光试验的比较证实其分型结果可靠，并可同时分型检测HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ，从而避免了HSV-Ⅰ的漏检，具有一定的临床应用价值。本文发现2份标本gG基因PCR法假阴性，对其细胞培养液再检测均阳性，排除了引物设计的影响；经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测1例阳性，1例阴性；证实gG基因PCR法假阴性的原因可能为标本HSV滴度过低，超过了gG基因PCR法的最低检测极限，尚有待改进。
, 百拇医药
参考文献
1 白桦，佟菊贞，叶兴东，等.生殖器疱疹的诊断及特征探讨.中华皮肤科杂志，1996，29：169-171.
2 伍新尧，罗超泉，杨英浩.基因诊断原理与临床.第1版.广州：中山大学出版社，1995.
3 Piiparinen H, Vaheri V. Genotyping of herpes simplex viruses by polymerase chain reaction. Arch Virol, 1991,119:275.
4 Nageswaran A, Shen RN, Kinghorn GR, et al. Apparent increase in the prevalence of herpes simplex virus type 1 genital infections among women. Genitourin Med, 1994,70:427.
(收稿：1998-11-18修回：1999-02-25), 百拇医药
单位：510630广州，中山医科大学第三附属医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志/990616
单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白G(gG)基因位于HSVUS4序列区，是型间差异最大的一个糖蛋白基因，目前对其功能尚不甚明了，以此作为“靶位点”分型检测临床样本单纯疱疹病毒感染的PCR方法报道亦较少。我们建立并初步评价了一种可同时分型检测HSVgG基因的PCR方法，现报道如下。
一、材料与方法
1.临床标本：选择我科门诊临床诊断为生殖器疱疹(GH)的病例40例，共收集GH早期皮疹(水疱、脓疱)标本17份，中晚期皮疹(溃疡、结痂创面)标本23份，泌尿生殖道拭子标本40份。
, http://www.100md.com
2.HSV培养及鉴定：以Vero细胞分离培养HSV[1]。阳性培养结果以单克隆抗体间接免疫荧光试验予以鉴定(LP10抗HSV-ⅠgG，AP1抗HSV-ⅡgG，均由英国剑桥大学Minson教授惠赠)。HSV国际参考株HSV-ⅠF株，HSV-Ⅱ333株由湖北医科大学病毒研究所提供，并以微量空斑计数法标定病毒滴度。
3.HSVgG基因PCR方法：PCR引物设计参照已经公布的HSVDNA序列[1]，通过PCGENE软件比较HSV-Ⅰ及HSV-ⅡDNA的同源性，选择HSV-ⅠUS4序列区4351bp～4370bp片段为HSV-Ⅰ上游引物；HSV-ⅡHindⅢL序列区4707bp～4726bp片段为HSV-Ⅱ上游引物；HSV-ⅠUS4序列4818bp～4837bp(或HSV-ⅡHindⅢL序列区4903bp～4922bp)片段为型共同下游引物。按文献处理临床标本，构建PCR扩增反应体系并进行扩增反应[2]。温度循环按94℃45s、58℃45s、72℃1min进行。经2%琼脂糖凝胶电泳判断结果，出现216bp条带为HSV-Ⅱ阳性，出现490bp条带为HSV-Ⅰ阳性，对临床标本进行检测时以0.75空斑形成单位(pfu)HSV-ⅠF株及1.25pfuHSV-Ⅱ333株培养液为阳性对照(参见结果部分)。
, 百拇医药
对HSVgG基因PCR法与细胞培养法结果不一致的标本，以常用的HSVDNA聚合酶基因PCR法再次检测[3]。本文数据分析以SAS软件包进行χ2检验或精确概率法检验。
二、结果
1.引物设计：PCR引物选自gG基因跨膜区编码区，3条引物G+C含量均在61%左右，以PCROligo软件检索引物内部无重复序列，无发夹结构形成，引物间无4个以上连续碱基配对，且与已知DNA序列无配合。扩增产物在490bp及216bp处出现明亮带型，未见其它分子量带型出现。以标准病毒液为模板，当HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ量分别低于0.75pfu及1.25pfu时，即无明显扩增产物出现。
2.临床标本细胞培养法与HSVgG基因PCR法检测结果：80份临床标本细胞培养法与gG基因PCR法阳性者分别为32份(40%)及42份(52.5%)，两者差异具有显著性(P=0.005)；生殖器疱疹不同类型标本的阳性检出率见表1，中晚期皮疹标本HSVgG基因PCR法的阳性检出率显著高于细胞培养法(P=0.033)。30份细胞培养法与gG基因PCR法均阳性的标本，29份两法分型结果一致(HSV-Ⅰ、HSV-Ⅱ、HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ混合感染分别为2例、26例及1例)，1份细胞培养法示HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ混合感染，但gG基因PCR法示HSV-Ⅱ单独感染，经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测仍为HSV-Ⅱ单独感染。
, 百拇医药
细胞培养法与HSVgG基因PCR法出现14份不一致检测结果，12份gG基因PCR法阳性但细胞培养法阴性，经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测全部阳性。2份gG基因PCR法假阴性，经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测1份阳性，1份阴性。
表1 生殖器疱疹不同类型标本细胞培养法与gG基因PCR法的阳性检出率比较 标本类型
标本数
细胞培养阳性数(%)
PCR法*阳性数(%)
P值
早期皮疹拭子
17
16(94.1)
, 百拇医药
14(82.4)
0.301
中晚期皮疹拭子
23
5(21.7)
12(52.2)
0.033
泌尿生殖道拭子
40
11(27.5)
16(40.0)
0.172
, 百拇医药 注：为gG基因PCR法
若以细胞培养法及HSVDNA聚合酶基因PCR法为“扩大金标准”，则HSVgG基因PCR法的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为95.5%、100%、100%及94.7%。
三、讨论
近年来流行病学调查发现部分地区生殖器HSV-Ⅰ感染呈上升趋势[4]，对生殖器疱疹的临床诊断只进行HSV-Ⅱ检测，势必造成部分病例漏诊。为此我们选择了HSVgG基因跨膜区编码区，设计了两条型特异性上游引物及一条型共同下游引物，一次可同时分型扩增检测HSV-Ⅰ及HSV-ⅡDNA。扩增片段的长度相差一倍以上，结果易于判断。对生殖器疱疹标本检测的结果表明，gG基因PCR法不论在总体阳性率还是对生殖器疱疹中晚期皮疹标本的阳性检出率均显著高于细胞培养法(P值分别为0.005及0.033)；与单克隆抗体间接免疫荧光试验的比较证实其分型结果可靠，并可同时分型检测HSV-Ⅰ及HSV-Ⅱ，从而避免了HSV-Ⅰ的漏检，具有一定的临床应用价值。本文发现2份标本gG基因PCR法假阴性，对其细胞培养液再检测均阳性，排除了引物设计的影响；经HSVDNA聚合酶基因PCR法再检测1例阳性，1例阴性；证实gG基因PCR法假阴性的原因可能为标本HSV滴度过低，超过了gG基因PCR法的最低检测极限，尚有待改进。
, 百拇医药
参考文献
1 白桦，佟菊贞，叶兴东，等.生殖器疱疹的诊断及特征探讨.中华皮肤科杂志，1996，29：169-171.
2 伍新尧，罗超泉，杨英浩.基因诊断原理与临床.第1版.广州：中山大学出版社，1995.
3 Piiparinen H, Vaheri V. Genotyping of herpes simplex viruses by polymerase chain reaction. Arch Virol, 1991,119:275.
4 Nageswaran A, Shen RN, Kinghorn GR, et al. Apparent increase in the prevalence of herpes simplex virus type 1 genital infections among women. Genitourin Med, 1994,70:427.
(收稿：1998-11-18修回：1999-02-25), 百拇医药