临床少见致病酵母的致病力和体外药物敏感性及电泳核型的初步研究
作者：胡晓莉 李少平 王红 刘维达
单位：胡晓莉 王红 刘维达(210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所)；胡晓莉 李少平(进修医师，安徽医科大学附属医院皮肤科)
关键词：酵母菌；微生物敏感性试验；基因；真菌
中华皮肤科杂志000211
【摘要】目的 比较10种临床少见酵母致病力的大小，体外对抗真菌药物敏感性的高低以及电泳核型的差异。方法 用经环磷酰胺和氢化可的松联合免疫抑制的小鼠为感染模型，分别用10种酵母攻击，然后观察其存活期，并计数重要脏器中酵母的CFU；用微量稀释法测定这些酵母对氟康唑和酮康唑的MIC值；用脉冲场凝胶电泳技术确定这些酵母的电泳核型。结果 不同酵母的致病力大小不同，但均低于白念珠菌;对两种抗真菌药物的敏感性，不同酵母之间有差异；各酵母的染色体的大小和数目的区别则反映了其基因型特征。结论 不同的临床少见酵母其致病力，对氟康唑和酮康唑的敏感性及基因型均有较大差异。这些资料对临床诊治这类酵母引起的条件性真菌感染可有较大帮助。
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Study on Pathogenicity,Susceptibility to Antifungal Drugs and Electrophoretic Karyotype of Uncommon Pathogenic Yeasts
HU Xiaoli, LI Shaoping, WANG Hong， et al.
(Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medcial Sciences, Peking Union Medical College,Nanjing 210042)
【 Abstract】 Objective To investigate the pathogenicity, susceptibility to antifungal drugs, and electrophoretic karyotype of clinically uncommon pathogenic yeasts. Methods The immunocompromised mice, induced by hydrocortisone and cyclophosphamide, were challenged by the yeast cells, then their survival periods were observed, and the CFU/mL of yeast cells in the important internal organs were counted. The minimal inhibitory concentrations(MICs) of the yeasts were determined with microdilution method. The genomic total chromosomes of these yeasts were separated by PFGE. Results The pathogenicity of 10 yeasts,namely, Torulopsis glabrata, Sporobolomyces salmonicolor,Saccharomyces cerevisiae,Cryptococcus laurentii, Debaryomyces hansenii,Torulopsis globular,Trichosporon beigelii, Klocckera lemom, Geotrichum candidum and Rhodotorula rubra,varied and all were less virulent than that of C.albicans. The susceptibility of the yeasts to two antifungal agents,fluconazole and ketoconazole， was different.The PFGE pattern showed that different yeasts had different electrophoretic karyotypes. The numbers of chromosomes were 12 for S. cerevisiae,6 for T.beigelii,9 for D.hansenii,8 for T.glabrata,4 for K.lemom,7 for R.rubra,5 for S.salmonicolor and 10 for C.laurentii. Conclusion The clinically uncommon yeasts tested yield different pathogenicity, antifungal susceptibility and genotypes. These data could be helpful for the clinical diagnosis and treatment of mycoses caused by these yeasts.
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【 Key words】 Yeasts Microbial sensitivity tests Genes,fungal
随着免疫受损人群的迅速扩大，条件真菌感染的发病率在不断上升，其中由念珠菌、新生隐球菌和曲霉引起的深部真菌病占大多数，受到广泛的重视。但近年来有关临床少见或罕见酵母引起人类感染的报道逐渐增多。为了临床更有效地诊治这类酵母所致的感染，我们近期对10种临床少见酵母的致病力、抗真菌药物的敏感性以及电泳核型特征进行了研究。
资料与方法
1.实验菌种：红酵母(Y1)、罗伦隐球菌(Y2)、球]拟圆酵母(Y4)、柠檬型克勒克酵母(Y5)、汗逊酵母(Y7)、酿酒酵母(Y8)、光滑球拟酵母(Y10)、褐色掷孢酵母(Y12)以及作为对照的白念珠菌(C1a)均来自中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心；白地霉(B1)和白吉利毛孢子菌(M1)由天津长征医院真菌室提供。
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2.实验动物：普通级昆明种小鼠，8周龄，体重18～22g，雌雄各半。由江苏省实验动物中心提供。随机分为12组，每组12只。其中11组内再分为2个小组，6只为免疫抑制组，6只为免疫正常组。余1组6只为健康对照组，即无免疫抑制和菌液接种，另6只为免疫对照组，即免疫抑制后不接种菌液。
表1 10种临床少见致病酵母3种特性的比较
Y1
Y2
Y4
Y5
Y7
Y8
Y10
Y12
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M1
B1
C1a
存活期(平均天数)
免疫抑制组
7.50
4.50
5.50
6.67
4.83
3.67
3.17
3.50
, 百拇医药
7.17
6.07
2.50
免疫正常组
9.67
7.50
8.33
9.50
8.50
7.00
6.37
6.17
9.17
, 百拇医药
9.17
5.17
MIC(μg/mL)
氟康唑
64
32
32
64
32
32
8
8
64
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64
1
酮康唑
0.5
0.25
1.0
0.5
0.5
1.0
0.125
0.125
32
64
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0.125
染色体数(条)
7
10
8
4
9
12
10
5
6
-
8
注：B1因其最大染色体3Mb，原电泳条件未获成功。表中简称Y1为红酵母、Y2为罗伦隐球菌、Y4为球拟圆酵母、Y5为柠檬型克勒克酵母、Y7为汗逊酵母、Y8为酿酒酵母、Y10为光滑球拟酵母、Y12为褐色掷孢酵母、C1a为白念珠菌、B1为白地霉、M1为白吉利毛孢子菌
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3.免疫抑制：环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，批号：970450，剂量为75mg/kg；氢化可的松，扬州制药厂生产，批号：960311，剂量为125mg/kg。2药混合后腹腔内注射，每日1次，连续3d。
4.致病力测定：各菌株在沙堡培养基斜面活化后用无菌生理盐水制备菌悬液，用血球计数板调整菌液浓度为1×105CFU/mL，取0.1mL于小鼠尾静脉内注射,健康对照组则注射0.1mL生理盐水。小鼠接种后观察10d,记录死亡日期。在免疫缺陷组,将每组第3个死亡的小鼠解剖,取心、肝、肾脏分别整体剪碎研细后进行琼脂板法菌落计数。
5.MIC测定：微量液基稀释法采用本室已报道的方法和条件[1]，氟康唑药粉和酮康唑药粉分别由大连辉瑞制药有限公司和南京第二制药厂提供。每株菌重复3次，取均值。
6.电泳核型：方法见文献[2]。
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结果
1.生存期长短比较：在免疫缺陷组，生存期最短的为Y10组，平均3.17d,最长为Y1组，平均7.50d,而C1a组则为2.50d；在免疫正常组，最短为Y12组，6.17d,最长为Y1组，>9.67d，而C1a则为5.17d。两组做配对t检验，P<0.01,说明临床少见酵母对免疫受损个体的致病力显著增强。各菌种致病力大小的比较详见表1。
2.重要脏器中酵母的CFU计数：以心肝肾3个脏器9个菌种CFU的均数大小排列，由小至大依次为Y116,Y817,Y5214,Y2323,Y7486,Y12506,Y42069,B12733,Y103355。M1因培养污染青霉菌而未能计数。作为对照C1a为3840。在3个脏器中，受累最重的是肾脏，9个菌种平均CFU为2308/mL，而肝脏为408/mL，心脏190/mL，均显著少于肾脏。
3.对抗真菌药物的敏感性：各菌种对氟康唑和酮康唑两药的敏感性见表1。从表中可知临床少见酵母体外对氟康唑并不敏感甚至耐药，而对酮康唑则大多敏感。
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4.电泳核型：见图1。染色体数目最多者为酿酒酵母，共12条，最少为柠檬型克勒克酵母，仅4条。各菌种间带型差异很大，容易区分。
讨论
近些年来，人们不断发现以往仅寄居在人体体表及腔口或环境中罕见致病的酵母样真菌亦可引起感染，如红酵母、酿酒酵母可致腹膜炎、真菌血症、心内膜炎等；白地霉(虽不属酵母，但可产生类似于毛孢子菌的关节孢子，故也并入)可致支气管感染，毛孢子菌则可致免疫低下患者各种机会性感染[3-5]。本研究涉及的其它6种酵母已均有致深部真菌感染的报道。实际上由光滑球拟酵母(光滑念珠菌)引起的感染越来越多，发病率上升很快[6]，酿酒酵母亦常从临床标本中被分离出来，这些菌已不能算是“少见”。
从表1中可知，临床少见酵母对免疫正常个体的侵袭力较弱，而对免疫缺损，尤其是细胞免疫低下宿主的致病力则大为增强(P<0.01)，但仍弱于白念珠菌。在这些受试菌种中，致病力相对较强的是光滑球拟酵母(现多称光滑念珠菌)，褐色掷孢酵母和酿酒酵母，其次为罗伦隐球菌、汉逊酵母、球拟圆酵母和白地霉；较弱的则是柠檬型克勒克酵母、白吉利毛孢子菌和红酵母。从感染动物内脏受累的程度来看，除红酵母CFU最小(16/mL)和光滑念珠菌最大(3355/mL)，与其致病力大小一致外，其余均不平行，说明内脏中病原菌负荷的大小并非宿主死亡的主要原因，很可能有独特的毒力因子在起病理作用,尚需做进一步探讨。
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MIC测定的结果，各菌种对氟康唑几乎均不敏感，其MIC范围在8～64μg/mL之间，而作为对照的白念珠菌其MIC值则为1μg/mL，中度敏感；但对酮康唑，除白地霉和白吉利毛孢子菌外，其它各菌均较敏感，MIC范围在0.125～1μg/mL之间。这提示氟康唑可能不适于首选治疗由临床少见酵母引起的系统感染。光滑念珠菌本身对氟康唑不甚敏感已多见报道，其它少见酵母对该药活性亦低也可能缘自先天耐药，因为这些菌受到抗真菌药物的选择性压力的机会尚很少。除光滑念珠菌和酿酒酵母外，其余临床少见酵母的电泳核型尚未见报道。电泳核型是基因组染色体数目和大小在DNA水平的反映，可代表酵母菌基因型的基本特征。本研究结果显示各菌种间电泳核型差异较大，说明其遗传背景存在较大异质性，这正与这些菌种表型特征有显著区别相符。这些信息为进一步深入研究其致病因子的编码基因，分离特异片段用于分子诊断及耐药的分子机制打下了基础。
参考文献
1.刘维达，张秀丽，于长平.微量稀释法测定致病酵母对氟康唑敏感性.中国人兽共患病杂志，1996，12：38-40.
, 百拇医药
2.刘维达,郭宁如,吴绍熙,等.脉冲电泳用于确定念珠菌染色体数目和大小的研究.真菌学报，1996，15：65-69.
3.Sweet D, Reid M. Disseminated neonatal Trichosporon beigelii infection: Successful treatment with liposomal amphotericin B. J Infect, 1998,36:120- 121.
4.Gyaurgieva OH, Bogomolova TS, Gorshkova GZ, et al. Meningitis caused by Rhodotorula rubra in an HIV infected patient. J Med Veter Mycol, 1996, 34:357- 359.
5.Senneville E, Ajana F, Gerard Y, et al.Bilateral ureteral obstruction due to Saccharomyces cerevisiae fungus balls. Clin Infect Dis, 1996,23:636- 637.
6.Vazquez JA, Dembry LM, Sanchez V, et al. Nosocomial Candida glabrata colonization:an epidemiologic study. J Clin Microbiol, 1998,36:421- 426.
收稿日期：1999-04-09, 百拇医药
单位：胡晓莉 王红 刘维达(210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所)；胡晓莉 李少平(进修医师，安徽医科大学附属医院皮肤科)
关键词：酵母菌；微生物敏感性试验；基因；真菌
中华皮肤科杂志000211
【摘要】目的 比较10种临床少见酵母致病力的大小，体外对抗真菌药物敏感性的高低以及电泳核型的差异。方法 用经环磷酰胺和氢化可的松联合免疫抑制的小鼠为感染模型，分别用10种酵母攻击，然后观察其存活期，并计数重要脏器中酵母的CFU；用微量稀释法测定这些酵母对氟康唑和酮康唑的MIC值；用脉冲场凝胶电泳技术确定这些酵母的电泳核型。结果 不同酵母的致病力大小不同，但均低于白念珠菌;对两种抗真菌药物的敏感性，不同酵母之间有差异；各酵母的染色体的大小和数目的区别则反映了其基因型特征。结论 不同的临床少见酵母其致病力，对氟康唑和酮康唑的敏感性及基因型均有较大差异。这些资料对临床诊治这类酵母引起的条件性真菌感染可有较大帮助。
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Study on Pathogenicity,Susceptibility to Antifungal Drugs and Electrophoretic Karyotype of Uncommon Pathogenic Yeasts
HU Xiaoli, LI Shaoping, WANG Hong， et al.
(Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medcial Sciences, Peking Union Medical College,Nanjing 210042)
【 Abstract】 Objective To investigate the pathogenicity, susceptibility to antifungal drugs, and electrophoretic karyotype of clinically uncommon pathogenic yeasts. Methods The immunocompromised mice, induced by hydrocortisone and cyclophosphamide, were challenged by the yeast cells, then their survival periods were observed, and the CFU/mL of yeast cells in the important internal organs were counted. The minimal inhibitory concentrations(MICs) of the yeasts were determined with microdilution method. The genomic total chromosomes of these yeasts were separated by PFGE. Results The pathogenicity of 10 yeasts,namely, Torulopsis glabrata, Sporobolomyces salmonicolor,Saccharomyces cerevisiae,Cryptococcus laurentii, Debaryomyces hansenii,Torulopsis globular,Trichosporon beigelii, Klocckera lemom, Geotrichum candidum and Rhodotorula rubra,varied and all were less virulent than that of C.albicans. The susceptibility of the yeasts to two antifungal agents,fluconazole and ketoconazole， was different.The PFGE pattern showed that different yeasts had different electrophoretic karyotypes. The numbers of chromosomes were 12 for S. cerevisiae,6 for T.beigelii,9 for D.hansenii,8 for T.glabrata,4 for K.lemom,7 for R.rubra,5 for S.salmonicolor and 10 for C.laurentii. Conclusion The clinically uncommon yeasts tested yield different pathogenicity, antifungal susceptibility and genotypes. These data could be helpful for the clinical diagnosis and treatment of mycoses caused by these yeasts.
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【 Key words】 Yeasts Microbial sensitivity tests Genes,fungal
随着免疫受损人群的迅速扩大，条件真菌感染的发病率在不断上升，其中由念珠菌、新生隐球菌和曲霉引起的深部真菌病占大多数，受到广泛的重视。但近年来有关临床少见或罕见酵母引起人类感染的报道逐渐增多。为了临床更有效地诊治这类酵母所致的感染，我们近期对10种临床少见酵母的致病力、抗真菌药物的敏感性以及电泳核型特征进行了研究。
资料与方法
1.实验菌种：红酵母(Y1)、罗伦隐球菌(Y2)、球]拟圆酵母(Y4)、柠檬型克勒克酵母(Y5)、汗逊酵母(Y7)、酿酒酵母(Y8)、光滑球拟酵母(Y10)、褐色掷孢酵母(Y12)以及作为对照的白念珠菌(C1a)均来自中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心；白地霉(B1)和白吉利毛孢子菌(M1)由天津长征医院真菌室提供。
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2.实验动物：普通级昆明种小鼠，8周龄，体重18～22g，雌雄各半。由江苏省实验动物中心提供。随机分为12组，每组12只。其中11组内再分为2个小组，6只为免疫抑制组，6只为免疫正常组。余1组6只为健康对照组，即无免疫抑制和菌液接种，另6只为免疫对照组，即免疫抑制后不接种菌液。
表1 10种临床少见致病酵母3种特性的比较
Y1
Y2
Y4
Y5
Y7
Y8
Y10
Y12
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M1
B1
C1a
存活期(平均天数)
免疫抑制组
7.50
4.50
5.50
6.67
4.83
3.67
3.17
3.50
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7.17
6.07
2.50
免疫正常组
9.67
7.50
8.33
9.50
8.50
7.00
6.37
6.17
9.17
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9.17
5.17
MIC(μg/mL)
氟康唑
64
32
32
64
32
32
8
8
64
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64
1
酮康唑
0.5
0.25
1.0
0.5
0.5
1.0
0.125
0.125
32
64
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0.125
染色体数(条)
7
10
8
4
9
12
10
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6
-
8
注：B1因其最大染色体3Mb，原电泳条件未获成功。表中简称Y1为红酵母、Y2为罗伦隐球菌、Y4为球拟圆酵母、Y5为柠檬型克勒克酵母、Y7为汗逊酵母、Y8为酿酒酵母、Y10为光滑球拟酵母、Y12为褐色掷孢酵母、C1a为白念珠菌、B1为白地霉、M1为白吉利毛孢子菌
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3.免疫抑制：环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，批号：970450，剂量为75mg/kg；氢化可的松，扬州制药厂生产，批号：960311，剂量为125mg/kg。2药混合后腹腔内注射，每日1次，连续3d。
4.致病力测定：各菌株在沙堡培养基斜面活化后用无菌生理盐水制备菌悬液，用血球计数板调整菌液浓度为1×105CFU/mL，取0.1mL于小鼠尾静脉内注射,健康对照组则注射0.1mL生理盐水。小鼠接种后观察10d,记录死亡日期。在免疫缺陷组,将每组第3个死亡的小鼠解剖,取心、肝、肾脏分别整体剪碎研细后进行琼脂板法菌落计数。
5.MIC测定：微量液基稀释法采用本室已报道的方法和条件[1]，氟康唑药粉和酮康唑药粉分别由大连辉瑞制药有限公司和南京第二制药厂提供。每株菌重复3次，取均值。
6.电泳核型：方法见文献[2]。
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结果
1.生存期长短比较：在免疫缺陷组，生存期最短的为Y10组，平均3.17d,最长为Y1组，平均7.50d,而C1a组则为2.50d；在免疫正常组，最短为Y12组，6.17d,最长为Y1组，>9.67d，而C1a则为5.17d。两组做配对t检验，P<0.01,说明临床少见酵母对免疫受损个体的致病力显著增强。各菌种致病力大小的比较详见表1。
2.重要脏器中酵母的CFU计数：以心肝肾3个脏器9个菌种CFU的均数大小排列，由小至大依次为Y116,Y817,Y5214,Y2323,Y7486,Y12506,Y42069,B12733,Y103355。M1因培养污染青霉菌而未能计数。作为对照C1a为3840。在3个脏器中，受累最重的是肾脏，9个菌种平均CFU为2308/mL，而肝脏为408/mL，心脏190/mL，均显著少于肾脏。
3.对抗真菌药物的敏感性：各菌种对氟康唑和酮康唑两药的敏感性见表1。从表中可知临床少见酵母体外对氟康唑并不敏感甚至耐药，而对酮康唑则大多敏感。
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4.电泳核型：见图1。染色体数目最多者为酿酒酵母，共12条，最少为柠檬型克勒克酵母，仅4条。各菌种间带型差异很大，容易区分。
讨论
近些年来，人们不断发现以往仅寄居在人体体表及腔口或环境中罕见致病的酵母样真菌亦可引起感染，如红酵母、酿酒酵母可致腹膜炎、真菌血症、心内膜炎等；白地霉(虽不属酵母，但可产生类似于毛孢子菌的关节孢子，故也并入)可致支气管感染，毛孢子菌则可致免疫低下患者各种机会性感染[3-5]。本研究涉及的其它6种酵母已均有致深部真菌感染的报道。实际上由光滑球拟酵母(光滑念珠菌)引起的感染越来越多，发病率上升很快[6]，酿酒酵母亦常从临床标本中被分离出来，这些菌已不能算是“少见”。
从表1中可知，临床少见酵母对免疫正常个体的侵袭力较弱，而对免疫缺损，尤其是细胞免疫低下宿主的致病力则大为增强(P<0.01)，但仍弱于白念珠菌。在这些受试菌种中，致病力相对较强的是光滑球拟酵母(现多称光滑念珠菌)，褐色掷孢酵母和酿酒酵母，其次为罗伦隐球菌、汉逊酵母、球拟圆酵母和白地霉；较弱的则是柠檬型克勒克酵母、白吉利毛孢子菌和红酵母。从感染动物内脏受累的程度来看，除红酵母CFU最小(16/mL)和光滑念珠菌最大(3355/mL)，与其致病力大小一致外，其余均不平行，说明内脏中病原菌负荷的大小并非宿主死亡的主要原因，很可能有独特的毒力因子在起病理作用,尚需做进一步探讨。
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MIC测定的结果，各菌种对氟康唑几乎均不敏感，其MIC范围在8～64μg/mL之间，而作为对照的白念珠菌其MIC值则为1μg/mL，中度敏感；但对酮康唑，除白地霉和白吉利毛孢子菌外，其它各菌均较敏感，MIC范围在0.125～1μg/mL之间。这提示氟康唑可能不适于首选治疗由临床少见酵母引起的系统感染。光滑念珠菌本身对氟康唑不甚敏感已多见报道，其它少见酵母对该药活性亦低也可能缘自先天耐药，因为这些菌受到抗真菌药物的选择性压力的机会尚很少。除光滑念珠菌和酿酒酵母外，其余临床少见酵母的电泳核型尚未见报道。电泳核型是基因组染色体数目和大小在DNA水平的反映，可代表酵母菌基因型的基本特征。本研究结果显示各菌种间电泳核型差异较大，说明其遗传背景存在较大异质性，这正与这些菌种表型特征有显著区别相符。这些信息为进一步深入研究其致病因子的编码基因，分离特异片段用于分子诊断及耐药的分子机制打下了基础。
参考文献
1.刘维达，张秀丽，于长平.微量稀释法测定致病酵母对氟康唑敏感性.中国人兽共患病杂志，1996，12：38-40.
, 百拇医药
2.刘维达,郭宁如,吴绍熙,等.脉冲电泳用于确定念珠菌染色体数目和大小的研究.真菌学报，1996，15：65-69.
3.Sweet D, Reid M. Disseminated neonatal Trichosporon beigelii infection: Successful treatment with liposomal amphotericin B. J Infect, 1998,36:120- 121.
4.Gyaurgieva OH, Bogomolova TS, Gorshkova GZ, et al. Meningitis caused by Rhodotorula rubra in an HIV infected patient. J Med Veter Mycol, 1996, 34:357- 359.
5.Senneville E, Ajana F, Gerard Y, et al.Bilateral ureteral obstruction due to Saccharomyces cerevisiae fungus balls. Clin Infect Dis, 1996,23:636- 637.
6.Vazquez JA, Dembry LM, Sanchez V, et al. Nosocomial Candida glabrata colonization:an epidemiologic study. J Clin Microbiol, 1998,36:421- 426.
收稿日期：1999-04-09, 百拇医药