银屑病患者皮损白介素8基因表达的检测
作者：张开明 尹兴平 周敏 尹国华 杨小英
单位：张开明 尹兴平 周敏 尹国华 杨小英(030009 山西省太原市中心医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000215
近年研究显示，白介素8(IL-8)在银屑病皮损中增高，其检测方法主要是免疫组化法及原位杂交法等[1-5],但检测结果不太一致，可能与测定方法的敏感性不同有关。为此，我们采用原位聚合酶链反应(原位PCR)结合SP免疫组化法(ISPCR-SP)对银屑病患者皮损及皮损周边外观正常皮肤IL-8基因表达进行了研究，并同单独应用SP免疫组化方法进行了比较。
一、资料与方法
(一)临床病例:寻常型银屑病患者24例，为1996年6月至1998年12月本院皮肤科门诊和住院患者,具有典型皮疹,其中男18例，女6例；年龄14～57岁；病程20d至29年。所有取材均征得患者同意，常规消毒后，梭形切口包括皮疹及周边外观正常皮肤，然后分别切取皮疹及正常组织，中性缓冲甲醛液固定，常规石蜡制块。正常人对照组14例，为手术室切除的正常皮肤组织。
, 百拇医药
(二)试剂及仪器:IL-8引物由中国科学院生物工程所合成,引物序列为5′-ATGACTTCCAACCTGGCCGTG-3′和5′-TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3′;dNTP(Sigma产品)；Taq酶及10×缓冲液购自北京华美公司;鼠抗人IL-8单抗为美国Genzyme公司产品；过氧化酶标记的链霉亲合素(简称SP)试剂盒为Zymed公司生产，购自北京中山试剂公司；原位PCR仪(MJResearchPTC-100)。
(三)方法:原位PCR：石蜡切片5μm，分别置于特制原位PCR(同时两张为平行片子)以及普通载玻片上，常规二甲苯脱蜡至水，0.2mol/L盐酸处理10min,蛋白酶K消化10min,然后98℃灭活蛋白酶K,梯度乙醇脱水,在原位PCR载玻片上滴加PCR反应液35μL,加盖玻片(每次设阴性对照,不加引物,余同前)，用石蜡油封盖玻片，进行PCR扩增，首先PCR预变性1min，然后以94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min进入PCR循环,共30个循环，最后72℃终延伸7min，去掉盖玻片脱蜡，4%多聚甲醛固定30min，用pH7.2PBS冲片后立即进行SP免疫组化染色。
, 百拇医药
SP免疫组化法：原位PCR之后的组织以及常规石蜡切片脱蜡至水，然后按操作说明进行染色，IL-8表达阳性时，于结合部位可见棕色颗粒沉积，最后置显微镜下观察。
图像定量分析：采用SPINPSA-8显微图像分析系统，并参照有关文献[5]，在OlympusBX60200倍显微镜下，对视野下完整表皮进行切割，预置阳性细胞灰度值,进行如下测量:①阳性细胞数密度(×10-2/μm2),即被观测单位面积中阳性细胞数目;②面积密度(×10-2μm2/μm2),即阳性细胞面积的和与被观测的总面积之比。
表1 银屑病患者皮损及皮损周边正常 皮肤白介素8 ISPCRSP检测图像 定量分析结果(
±s) 组 别
, http://www.100md.com
例数
数密度(×10-2/μm2)
面积密度(×10-2 μm2/μm2)
皮损处
24
0.57±0.18
14.13±4.27
皮损周边正常皮肤
24
0.35±0.20
8.61±4.12
, http://www.100md.com
t值
2.87
2.53
P值
<0.01
<0.01
(四)统计处理:采用t检验。
三、讨论
我们通过原位PCR技术结合SP免疫组化法，并配合图像定量分析,比较准确和客观地反映了银屑病患者组织中IL-8表达的部位和水平，实验结果表明原位PCR技术可显著提高免疫组化的灵敏度，表明原位PCR结合SP免疫组化法检测IL-8基因表达灵敏度明显优于单纯免疫组化法。实验结果显示，银屑病患者皮损基底层、棘层及颗粒层均表达IL-8，而以基底层和棘层上层最明显。研究结果还显示，银屑病患者皮损周边外观正常皮肤均可检测到IL-8表达，但含量可能很少，非免疫组化和原位杂交可以检出。IL-8是一重要的致炎因子，在银屑病发病早期具有重要的作用，故皮疹周边的正常皮肤实际上可能已经是处于“亚临床”状态。通过实验观察，我们注意到原位PCR技术(如稳定性和重复性等)远不象液相PCR技术一样成熟，是一项比较复杂和操作技巧很高的方法，所以，其中许多问题需要在实验中进一步摸索和探讨。
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二、结果
采用ISPCR-SP法染色结果，24例寻常型银屑病患者皮损表皮及皮损周边外观正常皮肤表皮均可见IL-8表达，主要见于细胞核，少数细胞浆也可见，皮损处表达值显著高于周边正常皮肤(见表1)。14例正常人有3例表皮可见到IL-8阳性结果，但较弱。单纯SP免疫组化染色结果，24例患者中有16例皮损处可见IL-8表达阳性，而皮损周边外观正常皮肤有2例可见IL-8弱阳性反应，14例正常人对照者均为阴性反应。
参考文献
1.李红文,吴景兰，丁一，等.银屑病皮损区IL-8、HLA-DR、PLA2、ANAE、EGFRmRNA、c-fosmRNA的定位研究.中华皮肤科杂志，1999，32：82-84.
2.张开明，刘梅青，周敏，等.银屑病患者白介素8含量测定.中华皮肤科杂志，1995，28：319-321.
, http://www.100md.com
3.Gillitzer R, Ritter U, Spandau U, et al. Differential expression of GRO- alpha and IL- 8 mRNA in psoriasis:a model for neutrophil migration and accumulation in vivo. J Invest Dermatol， 1996， 107:778- 782.
4.Konstantinova NV,Duong D MT,Remenyik E,et al.Interleukin- 8 is induced in skin equivalents and is highest in those derived from psoriatic fibroblasts. J Invest Dermatol, 1996,107:615- 621.
5.刘元林,王发友,张晓东,等.银屑病角朊细胞Fas、Ice、Bax及bc1-2基因的表达.中华皮肤科杂志，1998，31：102-103.
收稿日期：1999-08-02, http://www.100md.com
单位：张开明 尹兴平 周敏 尹国华 杨小英(030009 山西省太原市中心医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000215
近年研究显示，白介素8(IL-8)在银屑病皮损中增高，其检测方法主要是免疫组化法及原位杂交法等[1-5],但检测结果不太一致，可能与测定方法的敏感性不同有关。为此，我们采用原位聚合酶链反应(原位PCR)结合SP免疫组化法(ISPCR-SP)对银屑病患者皮损及皮损周边外观正常皮肤IL-8基因表达进行了研究，并同单独应用SP免疫组化方法进行了比较。
一、资料与方法
(一)临床病例:寻常型银屑病患者24例，为1996年6月至1998年12月本院皮肤科门诊和住院患者,具有典型皮疹,其中男18例，女6例；年龄14～57岁；病程20d至29年。所有取材均征得患者同意，常规消毒后，梭形切口包括皮疹及周边外观正常皮肤，然后分别切取皮疹及正常组织，中性缓冲甲醛液固定，常规石蜡制块。正常人对照组14例，为手术室切除的正常皮肤组织。
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(二)试剂及仪器:IL-8引物由中国科学院生物工程所合成,引物序列为5′-ATGACTTCCAACCTGGCCGTG-3′和5′-TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3′;dNTP(Sigma产品)；Taq酶及10×缓冲液购自北京华美公司;鼠抗人IL-8单抗为美国Genzyme公司产品；过氧化酶标记的链霉亲合素(简称SP)试剂盒为Zymed公司生产，购自北京中山试剂公司；原位PCR仪(MJResearchPTC-100)。
(三)方法:原位PCR：石蜡切片5μm，分别置于特制原位PCR(同时两张为平行片子)以及普通载玻片上，常规二甲苯脱蜡至水，0.2mol/L盐酸处理10min,蛋白酶K消化10min,然后98℃灭活蛋白酶K,梯度乙醇脱水,在原位PCR载玻片上滴加PCR反应液35μL,加盖玻片(每次设阴性对照,不加引物,余同前)，用石蜡油封盖玻片，进行PCR扩增，首先PCR预变性1min，然后以94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min进入PCR循环,共30个循环，最后72℃终延伸7min，去掉盖玻片脱蜡，4%多聚甲醛固定30min，用pH7.2PBS冲片后立即进行SP免疫组化染色。
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SP免疫组化法：原位PCR之后的组织以及常规石蜡切片脱蜡至水，然后按操作说明进行染色，IL-8表达阳性时，于结合部位可见棕色颗粒沉积，最后置显微镜下观察。
图像定量分析：采用SPINPSA-8显微图像分析系统，并参照有关文献[5]，在OlympusBX60200倍显微镜下，对视野下完整表皮进行切割，预置阳性细胞灰度值,进行如下测量:①阳性细胞数密度(×10-2/μm2),即被观测单位面积中阳性细胞数目;②面积密度(×10-2μm2/μm2),即阳性细胞面积的和与被观测的总面积之比。
表1 银屑病患者皮损及皮损周边正常 皮肤白介素8 ISPCRSP检测图像 定量分析结果(
±s) 组 别, http://www.100md.com
例数
数密度(×10-2/μm2)
面积密度(×10-2 μm2/μm2)
皮损处
24
0.57±0.18
14.13±4.27
皮损周边正常皮肤
24
0.35±0.20
8.61±4.12
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t值
2.87
2.53
P值
<0.01
<0.01
(四)统计处理:采用t检验。
三、讨论
我们通过原位PCR技术结合SP免疫组化法，并配合图像定量分析,比较准确和客观地反映了银屑病患者组织中IL-8表达的部位和水平，实验结果表明原位PCR技术可显著提高免疫组化的灵敏度，表明原位PCR结合SP免疫组化法检测IL-8基因表达灵敏度明显优于单纯免疫组化法。实验结果显示，银屑病患者皮损基底层、棘层及颗粒层均表达IL-8，而以基底层和棘层上层最明显。研究结果还显示，银屑病患者皮损周边外观正常皮肤均可检测到IL-8表达，但含量可能很少，非免疫组化和原位杂交可以检出。IL-8是一重要的致炎因子，在银屑病发病早期具有重要的作用，故皮疹周边的正常皮肤实际上可能已经是处于“亚临床”状态。通过实验观察，我们注意到原位PCR技术(如稳定性和重复性等)远不象液相PCR技术一样成熟，是一项比较复杂和操作技巧很高的方法，所以，其中许多问题需要在实验中进一步摸索和探讨。
, 百拇医药
二、结果
采用ISPCR-SP法染色结果，24例寻常型银屑病患者皮损表皮及皮损周边外观正常皮肤表皮均可见IL-8表达，主要见于细胞核，少数细胞浆也可见，皮损处表达值显著高于周边正常皮肤(见表1)。14例正常人有3例表皮可见到IL-8阳性结果，但较弱。单纯SP免疫组化染色结果，24例患者中有16例皮损处可见IL-8表达阳性，而皮损周边外观正常皮肤有2例可见IL-8弱阳性反应，14例正常人对照者均为阴性反应。
参考文献
1.李红文,吴景兰，丁一，等.银屑病皮损区IL-8、HLA-DR、PLA2、ANAE、EGFRmRNA、c-fosmRNA的定位研究.中华皮肤科杂志，1999，32：82-84.
2.张开明，刘梅青，周敏，等.银屑病患者白介素8含量测定.中华皮肤科杂志，1995，28：319-321.
, http://www.100md.com
3.Gillitzer R, Ritter U, Spandau U, et al. Differential expression of GRO- alpha and IL- 8 mRNA in psoriasis:a model for neutrophil migration and accumulation in vivo. J Invest Dermatol， 1996， 107:778- 782.
4.Konstantinova NV,Duong D MT,Remenyik E,et al.Interleukin- 8 is induced in skin equivalents and is highest in those derived from psoriatic fibroblasts. J Invest Dermatol, 1996,107:615- 621.
5.刘元林,王发友,张晓东,等.银屑病角朊细胞Fas、Ice、Bax及bc1-2基因的表达.中华皮肤科杂志，1998，31：102-103.
收稿日期：1999-08-02, http://www.100md.com