卡泊三醇对银屑病患者角质形成细胞的细胞周期素D1、周期蛋白依赖性激酶及其抑制物P16表达的影响
作者：李银涛 李世荫 桑建利 张波
单位：李银涛 世荫(100083 北京医科大学第三附属医院)；桑建利(北京师范大学生物系)；张波(北京医科大学病理系)
关键词：
中华皮肤科杂志000213
银屑病是以表皮过度增殖，伴角化不全及真皮淋巴细胞浸润为特征的慢性皮肤病。在细胞周期中G1期变异最大，其长短通常可决定细胞周期时间，并且细胞是在G1期决定继续进行增殖还是退出周期。所以，G1期的调控结果将对整个细胞周期产生重要影响。而细胞周期素D1(CyclinD1)、周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase4，CDK4)及周期蛋白依赖性激酶抑制物(Cyclin dependent kinase inhabitor,CKI)P16分子是G1期的主要调控者。同时，临床观察发现，卡泊三醇(calcipotriol,CPT)外用治疗银屑病疗效确切。因此，我们应用免疫组化法及原位杂交法分别检测了寻常型银屑病患者皮损用药前后表皮角质形成细胞(KC)中CyclinD1、CDK4及P16三者的mRNA及其蛋白质表达水平，以探讨CPT的临床疗效与上述3种分子表达量变化的关系。
, http://www.100md.com
一、材料和方法
(一)病例及取材：病例选自门诊及住院确诊的寻常型银屑病患者30例，其中进行期6例，静止期24例。实验前3个月未接受治疗，不伴有肿瘤及其他严重疾患。实验开始，患者接受大力士软膏(CPT软膏，为丹麦利昂制药有限公司产品)外用治疗，治疗1～5周后取材。用药治疗后的皮损面积较治疗前变小，浸润减轻，鳞屑消失，但大部分患者的皮损尚未完全消退。对照组10例标本取自正常人上臂皮肤(2例)和包皮(环切术8例)。环钻取材(全层皮肤)，常规10%甲醛固定，石蜡包埋。
(二)原位杂交：体外转录法标记cRNA探针，CyclinD1及P16探针以生物素标记，CDK4探针用地戈辛标记，地戈辛标记与检测试剂盒及Biotin-UTP为德国Boehringer Mamnheim公司产品，CyclinD1及P16杂交方法见文献[1]，CDK4杂交按地戈辛标记检测试剂盒提供方法进行。
, 百拇医药
(三)免疫组化：CyclinD1单抗及CDK4、P16多抗为美国SantaCruz公司产品，工作浓度均为1∶100。采用LSAB法对组织切片进行染色。SP试剂盒为美国Zymed公司产品。
(四)实验结果定量分析方法：在每例CDK4的原位杂交切片(NBT/BCIP显色)中随机选取10个400倍视野，用LEICAQ550/W(USA)图象处理分析系统检测每个视野的灰度值；其余每例切片(包括CyclinD1及P16的原位杂交和免疫组化切片，CDK4免疫组化切片,DAB显色)，随机选取10个400倍视野，并计数10个视野中的细胞总数及有阳性信号的细胞数，然后得出每张切片的阳性细胞百分率。
表1 银屑病患者皮损经卡泊三醇治疗后CyclinD1、CDK4及P16的mRNA及蛋白质表达水平比较(
±s) 组 别
, 百拇医药
例数
mRNA表达水平
蛋白质表达水平
CyclinD1
CDK4(灰度值)
P16
CyclinD1
CDK4
P16
正常人组
10
0.1697±0.0701
, 百拇医药
0.0543±0.0194
0.8482±0.0786
0.2929±0.0414
0.2879±0.0914
0.5334±0.1103
银屑病组
治疗前
22
0.8708±0.0609
0.2566±0.0978
0.3566±0.1203
, 百拇医药
0.4920±0.0730
0.5763±0.0869
0.2684±0.0682
治疗后
22
0.4011±0.1212
0.0966±0.0512
0.6831±0.1215
0.3260±0.0844
0.3451±0.0911
0.5184±0.0738
, 百拇医药
注：上述数值未注明单位者系阳性细胞百分率
(五)统计学处理：实验数据统计分析在SPSS/PC软件包上完成，三组间差异显著性检验用单因素方差分析Q检验；经Bartleett法检验方差不齐者，则选用秩和检验及两两比较。
二、结果
(一)原位杂交技术检测的阳性信号为：胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒(DAB显色)，或者，深蓝色或蓝紫颗粒(NBT/BCIP显色)。结果显示，正常人皮肤中CyclinD1、CDK4的mRNA不表达或仅在基底层弱表达，而P16的mRNA于表皮全层强表达；在银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4的mRNA于表皮全层强表达，而P16的mRNA仅在棘层上部弱表达；在经CPT治疗后的银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4及P16的mRNA分布于表皮全层，但前二者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损减弱，后者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损增强。以正向cRNA探针代替或不加cRNA探针为对照同时进行杂交，未见阳性信号。经定量分析及差异显著性检验，结果显示，3组中每项指标两两间差异均有显著性(P<0.05)。提示银屑病患者皮损经CPT治疗后，上述3项指标均有所改善，而与正常人皮肤相比则仍有差距。详见表1。(二)免疫组化技术检测的阳性信号为：胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒。结果显示，正常人皮肤中CyclinD1、CDK4的蛋白质不表达或仅在基底层和棘层下部弱表达，而P16的蛋白质于表皮全层强表达；在银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4的蛋白质于表皮全层强表达，而P16的蛋白质仅在棘层上部弱表达或不表达；在经CPT治疗后的银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4及P16的蛋白质分布于表皮全层，但前二者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损减弱，后者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损增强，且以棘层为著。不加Ⅰ抗的阴性对照未见阳性信号。经定量分析及差异显著性检验，结果显示，经CPT治疗后的银屑病皮损，其CyclinD1和CDK4的蛋白质表达水平较未经治疗的银屑病皮损低(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性0.05)；P16的蛋白质表达水平较未经治疗的银屑病患者皮损高(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性0.05)。详见表1。
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三、讨论
卡泊三醇是1,25(OH)2D3的类似物，近来临床研究发现1,25(OH)2D3及其类似物治疗银屑病疗效确切，实验研究发现，它们可以抑制表皮增殖，诱导其分化。同时有免疫调节活性。如Svendsen等研究发现[2]，1,25(OH)2D3可通过细胞密度、钙及血清依赖的方式抑制培养的人角质形成细胞的增殖，并促进其分化。Kobayashi等研究发现[3]，CPT的抗增殖效应与pRB的磷酸化有关，去磷酸化的pRB与E2F等转录因子结合后，使多种正性转录因子和细胞周期调控蛋白(如CyclinD1、CDK4、C-Myc)表达降低[4]。同时，CPT可使TGF-β1合成增加，而TGF-β1可抑制CDK4、CyclinE等的表达[4]。如此，可部分解释CPT的抗增殖效应。另外，1,25(OH)2D3可诱导HL60细胞内P27含量升高[5]；TGF-β可诱导HaCaT细胞内P15的mRNA和蛋白质水平明显增高[6]，结合本实验考虑，提示CPT对P16有正调作用。其作用可能系他通过对pRB的作用而间接调节P16，推断依据是，在缺少功能性pRB的细胞中，如T抗原转化的细胞，P16的水平往往较高，揭示pRB蛋白可能具有抑制P16基因表达的作用。然而，由于参与G1/S调控点的因子非常复杂，故目前尚不能确定CPT是通过何种途径或因子上调P16的。
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本实验检测了正常人皮肤及CPT治疗前后银屑病皮损中角质形成细胞的CyclinD1、CDK4及P16的mRNA和蛋白质表达情况，结果发现，银屑病皮损中角质形成细胞的CyclinD1、CDK4在mRNA和蛋白质水平上均较正常人皮肤表达增高，而P16表达降低(P<0.05)，与已有的研究结果相一致[7,8]，经CPT治疗后，其CyclinD1、CDK4在mRNA和蛋白质水平上的表达均被下调，而P16被上调(P<0.05)。本实验由于取材受到临床条件的限制，亦未设CPT软膏基质作对照，使分析实验结果有一定困难，但仍能在一定程度上说明CPT对CyclinD1、CDK4、P16表达水平的纠正，可能与其治疗银屑病的临床疗效有关。
国家教委博士研究生基金资助课题
参考文献
, 百拇医药
1.苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994.122-123,147-150.
2.Svendsen ML, Daneels G, Geysen J, et al. Proliferation and differentiation of cultured human keratinocytes is modulated by 1,25(OH)2D3 and synthetic vitamin D3 analogues in a cell density- ,calcium- and serum- dependent manner. Pharmacol Toxicol, 1997,80:49- 56.
3.Kobayashi T, Hashimoto K, Yoshikawa K. Growth inhibition of human keratinocytes by 1,25(OH)2D3 is linked to dephosphorylation of re-tinoblastoma gene product.Biochem Biophys Res Commun,1993,196:487-493.
, http://www.100md.com
4.糜漫天，张乾勇，朱俊东，等.视黄酸诱导细胞分化分子机制的研究进展.国外医学分子生物学分册，1998，20：17-22.
5.Wang QM, Jones JB, Studzinsks GP, et al. Cyclin- dependent kinase inhibitor p27 as a mediator of the G1- S phase block induced by 1,25(OH)2D3 in HL60 cell. Cancer Res, 1996,56:264- 267.
6.刘传聚，左嘉客.细胞周期“驱动器”中的负调控元件——CKIs.细胞生物学动态，1996，1：61-65.
7.陈军，桑建利，王永潮，等.CyclinD1和CDK4mRNA及其多肽在银屑病皮损表皮中的过表达.中华皮肤科杂志，1997，30：118-119.
8.陆前进，卢放根，颜兰香，等.银屑病患者皮损中CDK4和p16蛋白表达.中华皮肤科杂志，1998，31：104-105.
收稿日期：1998-12-21, 百拇医药
单位：李银涛 世荫(100083 北京医科大学第三附属医院)；桑建利(北京师范大学生物系)；张波(北京医科大学病理系)
关键词：
中华皮肤科杂志000213
银屑病是以表皮过度增殖，伴角化不全及真皮淋巴细胞浸润为特征的慢性皮肤病。在细胞周期中G1期变异最大，其长短通常可决定细胞周期时间，并且细胞是在G1期决定继续进行增殖还是退出周期。所以，G1期的调控结果将对整个细胞周期产生重要影响。而细胞周期素D1(CyclinD1)、周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase4，CDK4)及周期蛋白依赖性激酶抑制物(Cyclin dependent kinase inhabitor,CKI)P16分子是G1期的主要调控者。同时，临床观察发现，卡泊三醇(calcipotriol,CPT)外用治疗银屑病疗效确切。因此，我们应用免疫组化法及原位杂交法分别检测了寻常型银屑病患者皮损用药前后表皮角质形成细胞(KC)中CyclinD1、CDK4及P16三者的mRNA及其蛋白质表达水平，以探讨CPT的临床疗效与上述3种分子表达量变化的关系。
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一、材料和方法
(一)病例及取材：病例选自门诊及住院确诊的寻常型银屑病患者30例，其中进行期6例，静止期24例。实验前3个月未接受治疗，不伴有肿瘤及其他严重疾患。实验开始，患者接受大力士软膏(CPT软膏，为丹麦利昂制药有限公司产品)外用治疗，治疗1～5周后取材。用药治疗后的皮损面积较治疗前变小，浸润减轻，鳞屑消失，但大部分患者的皮损尚未完全消退。对照组10例标本取自正常人上臂皮肤(2例)和包皮(环切术8例)。环钻取材(全层皮肤)，常规10%甲醛固定，石蜡包埋。
(二)原位杂交：体外转录法标记cRNA探针，CyclinD1及P16探针以生物素标记，CDK4探针用地戈辛标记，地戈辛标记与检测试剂盒及Biotin-UTP为德国Boehringer Mamnheim公司产品，CyclinD1及P16杂交方法见文献[1]，CDK4杂交按地戈辛标记检测试剂盒提供方法进行。
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(三)免疫组化：CyclinD1单抗及CDK4、P16多抗为美国SantaCruz公司产品，工作浓度均为1∶100。采用LSAB法对组织切片进行染色。SP试剂盒为美国Zymed公司产品。
(四)实验结果定量分析方法：在每例CDK4的原位杂交切片(NBT/BCIP显色)中随机选取10个400倍视野，用LEICAQ550/W(USA)图象处理分析系统检测每个视野的灰度值；其余每例切片(包括CyclinD1及P16的原位杂交和免疫组化切片，CDK4免疫组化切片,DAB显色)，随机选取10个400倍视野，并计数10个视野中的细胞总数及有阳性信号的细胞数，然后得出每张切片的阳性细胞百分率。
表1 银屑病患者皮损经卡泊三醇治疗后CyclinD1、CDK4及P16的mRNA及蛋白质表达水平比较(
±s) 组 别, 百拇医药
例数
mRNA表达水平
蛋白质表达水平
CyclinD1
CDK4(灰度值)
P16
CyclinD1
CDK4
P16
正常人组
10
0.1697±0.0701
, 百拇医药
0.0543±0.0194
0.8482±0.0786
0.2929±0.0414
0.2879±0.0914
0.5334±0.1103
银屑病组
治疗前
22
0.8708±0.0609
0.2566±0.0978
0.3566±0.1203
, 百拇医药
0.4920±0.0730
0.5763±0.0869
0.2684±0.0682
治疗后
22
0.4011±0.1212
0.0966±0.0512
0.6831±0.1215
0.3260±0.0844
0.3451±0.0911
0.5184±0.0738
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注：上述数值未注明单位者系阳性细胞百分率
(五)统计学处理：实验数据统计分析在SPSS/PC软件包上完成，三组间差异显著性检验用单因素方差分析Q检验；经Bartleett法检验方差不齐者，则选用秩和检验及两两比较。
二、结果
(一)原位杂交技术检测的阳性信号为：胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒(DAB显色)，或者，深蓝色或蓝紫颗粒(NBT/BCIP显色)。结果显示，正常人皮肤中CyclinD1、CDK4的mRNA不表达或仅在基底层弱表达，而P16的mRNA于表皮全层强表达；在银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4的mRNA于表皮全层强表达，而P16的mRNA仅在棘层上部弱表达；在经CPT治疗后的银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4及P16的mRNA分布于表皮全层，但前二者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损减弱，后者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损增强。以正向cRNA探针代替或不加cRNA探针为对照同时进行杂交，未见阳性信号。经定量分析及差异显著性检验，结果显示，3组中每项指标两两间差异均有显著性(P<0.05)。提示银屑病患者皮损经CPT治疗后，上述3项指标均有所改善，而与正常人皮肤相比则仍有差距。详见表1。(二)免疫组化技术检测的阳性信号为：胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒。结果显示，正常人皮肤中CyclinD1、CDK4的蛋白质不表达或仅在基底层和棘层下部弱表达，而P16的蛋白质于表皮全层强表达；在银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4的蛋白质于表皮全层强表达，而P16的蛋白质仅在棘层上部弱表达或不表达；在经CPT治疗后的银屑病皮损中，其CyclinD1、CDK4及P16的蛋白质分布于表皮全层，但前二者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损减弱，后者的表达较未经CPT治疗的银屑病皮损增强，且以棘层为著。不加Ⅰ抗的阴性对照未见阳性信号。经定量分析及差异显著性检验，结果显示，经CPT治疗后的银屑病皮损，其CyclinD1和CDK4的蛋白质表达水平较未经治疗的银屑病皮损低(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性0.05)；P16的蛋白质表达水平较未经治疗的银屑病患者皮损高(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性0.05)。详见表1。
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三、讨论
卡泊三醇是1,25(OH)2D3的类似物，近来临床研究发现1,25(OH)2D3及其类似物治疗银屑病疗效确切，实验研究发现，它们可以抑制表皮增殖，诱导其分化。同时有免疫调节活性。如Svendsen等研究发现[2]，1,25(OH)2D3可通过细胞密度、钙及血清依赖的方式抑制培养的人角质形成细胞的增殖，并促进其分化。Kobayashi等研究发现[3]，CPT的抗增殖效应与pRB的磷酸化有关，去磷酸化的pRB与E2F等转录因子结合后，使多种正性转录因子和细胞周期调控蛋白(如CyclinD1、CDK4、C-Myc)表达降低[4]。同时，CPT可使TGF-β1合成增加，而TGF-β1可抑制CDK4、CyclinE等的表达[4]。如此，可部分解释CPT的抗增殖效应。另外，1,25(OH)2D3可诱导HL60细胞内P27含量升高[5]；TGF-β可诱导HaCaT细胞内P15的mRNA和蛋白质水平明显增高[6]，结合本实验考虑，提示CPT对P16有正调作用。其作用可能系他通过对pRB的作用而间接调节P16，推断依据是，在缺少功能性pRB的细胞中，如T抗原转化的细胞，P16的水平往往较高，揭示pRB蛋白可能具有抑制P16基因表达的作用。然而，由于参与G1/S调控点的因子非常复杂，故目前尚不能确定CPT是通过何种途径或因子上调P16的。
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本实验检测了正常人皮肤及CPT治疗前后银屑病皮损中角质形成细胞的CyclinD1、CDK4及P16的mRNA和蛋白质表达情况，结果发现，银屑病皮损中角质形成细胞的CyclinD1、CDK4在mRNA和蛋白质水平上均较正常人皮肤表达增高，而P16表达降低(P<0.05)，与已有的研究结果相一致[7,8]，经CPT治疗后，其CyclinD1、CDK4在mRNA和蛋白质水平上的表达均被下调，而P16被上调(P<0.05)。本实验由于取材受到临床条件的限制，亦未设CPT软膏基质作对照，使分析实验结果有一定困难，但仍能在一定程度上说明CPT对CyclinD1、CDK4、P16表达水平的纠正，可能与其治疗银屑病的临床疗效有关。
国家教委博士研究生基金资助课题
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1.苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994.122-123,147-150.
2.Svendsen ML, Daneels G, Geysen J, et al. Proliferation and differentiation of cultured human keratinocytes is modulated by 1,25(OH)2D3 and synthetic vitamin D3 analogues in a cell density- ,calcium- and serum- dependent manner. Pharmacol Toxicol, 1997,80:49- 56.
3.Kobayashi T, Hashimoto K, Yoshikawa K. Growth inhibition of human keratinocytes by 1,25(OH)2D3 is linked to dephosphorylation of re-tinoblastoma gene product.Biochem Biophys Res Commun,1993,196:487-493.
, http://www.100md.com
4.糜漫天，张乾勇，朱俊东，等.视黄酸诱导细胞分化分子机制的研究进展.国外医学分子生物学分册，1998，20：17-22.
5.Wang QM, Jones JB, Studzinsks GP, et al. Cyclin- dependent kinase inhibitor p27 as a mediator of the G1- S phase block induced by 1,25(OH)2D3 in HL60 cell. Cancer Res, 1996,56:264- 267.
6.刘传聚，左嘉客.细胞周期“驱动器”中的负调控元件——CKIs.细胞生物学动态，1996，1：61-65.
7.陈军，桑建利，王永潮，等.CyclinD1和CDK4mRNA及其多肽在银屑病皮损表皮中的过表达.中华皮肤科杂志，1997，30：118-119.
8.陆前进，卢放根，颜兰香，等.银屑病患者皮损中CDK4和p16蛋白表达.中华皮肤科杂志，1998，31：104-105.
收稿日期：1998-12-21, 百拇医药