贵州省HIV－1感染毒株膜蛋白基因序列测定及流行病学分析
作者：雷世光 孙显光 邵一鸣 邢辉 杨宏亚 王丁力 乐斌 李豫
单位：雷世光 孙显光 杨宏亚 王丁力 乐斌 李豫(550001贵阳市，贵州省皮肤病性病防治研究所)；邵一鸣 邢辉(卫生部艾滋病预防与控制中心)
关键词：HIV-1序列分析流行病学
中华皮肤科杂志000301
【摘要】目的揭示贵州省HIV-1感染毒株的亚型分布及其流行态势。方法用巢式PCR法扩增HIV-1膜蛋白基因(env)，并经序列分析。结果核酸分离成功的11份全血标本中，B亚型7例，C、E亚型各2例；B亚型基因离散率为3.21%±1.4%，流行时间约3年，E和C亚型基因离散率为1.65%和0.98%，流行时间约1年。结论贵州省HIV-1感染毒株亚型分布广泛，来源复杂，预示今后将以性传播途径为主，防治难度较大。
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The env Gene Sequencing of HIV- 1 Strains and their Epidemic Status in Guizhou Province
LEI Shiguang
(Guizhou Provincial Institute of Dermatology and Venereology, Guiyang 550001)
SUN Xianguang
(Guizhou Provincial Institute of Dermatology and Venereology, Guiyang 550001)
SHAO Yiming
(Guizhou Provincial Institute of Dermatology and Venereology, Guiyang 550001)
, 百拇医药
【 Abstract】 Objective To reveal the distribution of subtypes of HIV- 1 and their epidemic status in Guizhou Province. Methods The provirus DNA of HIV was extracted from the peripheral blood mononuclear cells in 11 HIV- 1 infected individuals, the env gene of HIV was analysed by nested PCR and DNA sequencing. Results Among eleven HIV positive blood samples, 7 were subtype B (accounting for 64% ), 2 were subtype C (accounting for 18% ), another 2 were subtype E (accounting for 18% ). The genic dispersion rate of subtype B was 3.21± 1.4% , with 3 years epidemic in Guizhou. The genic dispersion rates among subtype E or C were 1.65% or 0.98% , respectively, with 1 year epidemic in Guizhou. Conclusions There are various subtypes of HIV strains in Guizhou Province,transmitted from different sources, which indicates that sexual transmission will be dominant in the future, and also more difficult to control.
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【 Key words】 HIV- 1 Sequence analysis Epidemiology
迄今为止，贵州省已先后发现HIV-1感染者100余例。为探索其亚型分布及变异情况，分析其流行态势,我们采集了20份1998年确认的HIV-1感染者全血样品进行核酸提取，巢式PCR基因扩增，膜蛋白基因序列测定和分析。
材料和方法
一、样本来源
吸毒感染者静脉血6份，采自贵阳、黔南两地区。性传播感染者静脉血4份，采自安顺、贵阳两地区。血源传播感染者静脉血10份，采自铜仁、六盘水、黔东南三地区。序列对照采用国际标准亚型(含YNBCON)。
二、核酸提取
采用Qiangen公司的QIAampblood试剂盒，按说明书操作。
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三、基因扩增与测序分析
1.引物：用预防医学科学院合成的NP21和NP22引物对为外侧引物；Env-C和Env-D3引物对为内侧引物。
2.方法：按NestedPCR进行。即：用5μL核酸样品与NP21、NP22初次扩增，95℃1min，94℃30s,56℃1min,72℃2min,30个循环；72℃10min。取1/10的反应产物再与ENV-c、ENV-g做第2次扩增，95℃1min，94℃20s,54℃1min,72℃1.5min，30个循环；72℃10min。
3.PCR产物的纯化：采用Qiangen公司的Qiaex试剂盒，按说明书提纯HIV基因片段，回收DNA溶于10mmol/LTris-HCl,pH8.7，经琼脂糖凝胶电泳后与标准品对照计核酸浓度。
4.核酸序列测定1μg样品量与6pmol/L引物经测序反应提纯后，在ABI公司产373A型DNA测序仪上进行序列测定。
, 百拇医药
表1 贵州省B、C、E亚型组内及其与国际各参考亚型的基因离散率 %
亚型 ACON BCON YN-B CCON DCON ECON FCON GCON E 22.12±0.18 20.52±0.74 21.44±0.71 21.52±0.19 23.77±0.51 3.48±0.26 20.19±1.33 24.96±1.59 C 20.57±0.32 21.66±0.64 24.96±0.99 2.32±0.48 22.70±0.66 23.98±0.66 18.84 20.83±0.98 B 24.03±1.16 7.23±0.95 3.31±1.04 24.01±1.81 18.16±1.33 22.86±1.20 18.45±1.40 25.33±1.67
注：ACON、BCON、CCON、DCON、ECON、FCON、GCON为国际A、B、C、D、E、F、G各亚型的共享序列，YN-B为云南省B亚型的共享序列
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5.序列分析：所测序列经DNA软件编辑后用GCG软件包进行分析。以Pileup程序进行排序并与国际标准序列进行比较，以Pretly程序计算共享序列，用Distance程序测定毒株间序列离散率，用Growtree程序做系统树状分析。
结果
一、Pileup程序排序
结果：GZ9803、GZ9804与国际标准ECON同源，定为E亚型;GZ9802、GZ9816与国际标准C亚型CCON同源，定为C亚型；其余GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809、GZ9814、GZ9808、GZ9813与国际标准B亚型BCON同源，定为欧美B亚型。其中GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809与我国云南1996年检出的B亚型同源性更为相近(96YN-BCON)。
二、Distance程序测定HIV毒株基因离散率
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贵州E亚型(GZ-E)组内离散率为1.65%，与国际标准E亚型(ECON)比较，离散率为3.48%±0.26%；贵州C亚型(GZ-C)组内离散率0.98%，与国际标准C亚型(CCON)比较，基因离散率为2.32%±0.48%；贵州B亚型(GZ-B)组内离散率为3.21%±1.40%，与国际标准B亚型(BCON)比较，离散率为7.23%±0.95%，与云南B亚型(YN-B)比较，离散率为3.31%±1.04%。详见表1。
三、Growtree程序自动生成系统树状图
结果：与基因排序相吻合，更直观地揭示贵州HIV-1流行毒株的亚型分布。详见图1。
图1 贵州HIV毒株系统结构树状图
讨论
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一、关于HIV-1毒株来源及分布
从结果看出，贵州HIV-1毒株中GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809与云南B亚型更接近，表明这些毒株主要从云南传入我省，而其余毒株则可能从沿海城市和其他省份传入。还可看出，在本文研究的20份标本中，真正核酸分离成功有排序结果的仅11份。其中云南B亚型4份(4/11)，欧美B亚型3份(3/11)，国际E亚型2份(2/11)，国际C亚型2份(2/11)。这一结果显示贵州HIV毒株来源广泛，分布复杂，尤其是主要通过性接触传播。目前国内仅少数省份有E、C亚型，在贵州不仅有，而且比例不小(占实验总数的4/11；占性传播感染者样本检出率的100%)。预示贵州今后HIV的流行，将以性接触传播的E、C亚型为主。
二、关于流行时间和变异
从表1看出，贵州B亚型组内基因离散率为3.21%±1.4%，其中GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809与云南流行株(YN-B)，即由欧美B亚型变异而来的云南B亚型[1,2]相接近，基因离散率为3.31%±1.04%，而GZ9809、GZ9814、GZ9808、GZ9813与国际标准B亚型(BCON)流行株相近者为7.23%±0.95%。有文献报道，用基因离散率来反应HIV毒株在某一地区变异程度，可按照平均每年基因离散率增加0.5%～1%计算[3,4]。基因离散率值越大，其毒株的变异程度越大，此毒株在某一地区的流行时间也越长。流行于我国云南的云南B亚型毒株传入贵州的时间约3年，而欧美B亚型毒株传入贵州的时间则较早。贵州E亚型组内基因离散率为1.65%，说明E亚型毒株传入贵州的时间约为1～2年。贵州C亚型毒株组内基因离散率为0.98%，表明C亚型毒株传入贵州时间更短，约为1年。
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三、关于流行态势
国内外对HIV-1毒株亚型分布的研究表明，B亚型主要经输血或静脉吸毒等血液传播，先流行于欧美后流行于东南亚；E亚型主要经性接触传播，主要流行于欧美。C亚型亦主要经性传播，主要流行于欧美和印度。众所周知，输血和静脉吸毒方式传播的B亚型完全可通过政策因素加以干预，在短期内迅速得以控制；而以性传播为主的E、C亚型是很难以通过政策因素在短期内加以控制。然而，E、C亚型在贵州流行时间不长，所占比例很大，随着时间的推移，其发展趋势将会越来越严重，这必将给贵州HIV的防治增加一定难度。
本课题为贵州省自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1，Kalish ML, Baldwin A, Raktham S, et al. The evolving molecular epidemiology of HIV- 1 envelope subtypes in injecting drug users in Bangkok. Thailand: implications for HIVvaccine trials. AIDS, 1995,9:851- 859.
, 百拇医药
2，邵一鸣，管永军，赵全壁，等.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9-16.
3，Ou CY, Takebe Y, Weniger BG, et al. Independent introduction of two major HIV- 1 genotypes into distinct high risk populations in Thailand. Lancet, 1993,341:1171- 1174.
4，Weniger BG, Tabede Y, Ou CY, et al. The molecular epidemiology of HIV in Asia. ADIS, 1994,8(Suppl 2):S1- S14.
(收 稿 日 期 ： 1999- 11- 10), 百拇医药
单位：雷世光 孙显光 杨宏亚 王丁力 乐斌 李豫(550001贵阳市，贵州省皮肤病性病防治研究所)；邵一鸣 邢辉(卫生部艾滋病预防与控制中心)
关键词：HIV-1序列分析流行病学
中华皮肤科杂志000301
【摘要】目的揭示贵州省HIV-1感染毒株的亚型分布及其流行态势。方法用巢式PCR法扩增HIV-1膜蛋白基因(env)，并经序列分析。结果核酸分离成功的11份全血标本中，B亚型7例，C、E亚型各2例；B亚型基因离散率为3.21%±1.4%，流行时间约3年，E和C亚型基因离散率为1.65%和0.98%，流行时间约1年。结论贵州省HIV-1感染毒株亚型分布广泛，来源复杂，预示今后将以性传播途径为主，防治难度较大。
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The env Gene Sequencing of HIV- 1 Strains and their Epidemic Status in Guizhou Province
LEI Shiguang
(Guizhou Provincial Institute of Dermatology and Venereology, Guiyang 550001)
SUN Xianguang
(Guizhou Provincial Institute of Dermatology and Venereology, Guiyang 550001)
SHAO Yiming
(Guizhou Provincial Institute of Dermatology and Venereology, Guiyang 550001)
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【 Abstract】 Objective To reveal the distribution of subtypes of HIV- 1 and their epidemic status in Guizhou Province. Methods The provirus DNA of HIV was extracted from the peripheral blood mononuclear cells in 11 HIV- 1 infected individuals, the env gene of HIV was analysed by nested PCR and DNA sequencing. Results Among eleven HIV positive blood samples, 7 were subtype B (accounting for 64% ), 2 were subtype C (accounting for 18% ), another 2 were subtype E (accounting for 18% ). The genic dispersion rate of subtype B was 3.21± 1.4% , with 3 years epidemic in Guizhou. The genic dispersion rates among subtype E or C were 1.65% or 0.98% , respectively, with 1 year epidemic in Guizhou. Conclusions There are various subtypes of HIV strains in Guizhou Province,transmitted from different sources, which indicates that sexual transmission will be dominant in the future, and also more difficult to control.
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【 Key words】 HIV- 1 Sequence analysis Epidemiology
迄今为止，贵州省已先后发现HIV-1感染者100余例。为探索其亚型分布及变异情况，分析其流行态势,我们采集了20份1998年确认的HIV-1感染者全血样品进行核酸提取，巢式PCR基因扩增，膜蛋白基因序列测定和分析。
材料和方法
一、样本来源
吸毒感染者静脉血6份，采自贵阳、黔南两地区。性传播感染者静脉血4份，采自安顺、贵阳两地区。血源传播感染者静脉血10份，采自铜仁、六盘水、黔东南三地区。序列对照采用国际标准亚型(含YNBCON)。
二、核酸提取
采用Qiangen公司的QIAampblood试剂盒，按说明书操作。
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三、基因扩增与测序分析
1.引物：用预防医学科学院合成的NP21和NP22引物对为外侧引物；Env-C和Env-D3引物对为内侧引物。
2.方法：按NestedPCR进行。即：用5μL核酸样品与NP21、NP22初次扩增，95℃1min，94℃30s,56℃1min,72℃2min,30个循环；72℃10min。取1/10的反应产物再与ENV-c、ENV-g做第2次扩增，95℃1min，94℃20s,54℃1min,72℃1.5min，30个循环；72℃10min。
3.PCR产物的纯化：采用Qiangen公司的Qiaex试剂盒，按说明书提纯HIV基因片段，回收DNA溶于10mmol/LTris-HCl,pH8.7，经琼脂糖凝胶电泳后与标准品对照计核酸浓度。
4.核酸序列测定1μg样品量与6pmol/L引物经测序反应提纯后，在ABI公司产373A型DNA测序仪上进行序列测定。
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表1 贵州省B、C、E亚型组内及其与国际各参考亚型的基因离散率 %
亚型 ACON BCON YN-B CCON DCON ECON FCON GCON E 22.12±0.18 20.52±0.74 21.44±0.71 21.52±0.19 23.77±0.51 3.48±0.26 20.19±1.33 24.96±1.59 C 20.57±0.32 21.66±0.64 24.96±0.99 2.32±0.48 22.70±0.66 23.98±0.66 18.84 20.83±0.98 B 24.03±1.16 7.23±0.95 3.31±1.04 24.01±1.81 18.16±1.33 22.86±1.20 18.45±1.40 25.33±1.67
注：ACON、BCON、CCON、DCON、ECON、FCON、GCON为国际A、B、C、D、E、F、G各亚型的共享序列，YN-B为云南省B亚型的共享序列
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5.序列分析：所测序列经DNA软件编辑后用GCG软件包进行分析。以Pileup程序进行排序并与国际标准序列进行比较，以Pretly程序计算共享序列，用Distance程序测定毒株间序列离散率，用Growtree程序做系统树状分析。
结果
一、Pileup程序排序
结果：GZ9803、GZ9804与国际标准ECON同源，定为E亚型;GZ9802、GZ9816与国际标准C亚型CCON同源，定为C亚型；其余GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809、GZ9814、GZ9808、GZ9813与国际标准B亚型BCON同源，定为欧美B亚型。其中GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809与我国云南1996年检出的B亚型同源性更为相近(96YN-BCON)。
二、Distance程序测定HIV毒株基因离散率
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贵州E亚型(GZ-E)组内离散率为1.65%，与国际标准E亚型(ECON)比较，离散率为3.48%±0.26%；贵州C亚型(GZ-C)组内离散率0.98%，与国际标准C亚型(CCON)比较，基因离散率为2.32%±0.48%；贵州B亚型(GZ-B)组内离散率为3.21%±1.40%，与国际标准B亚型(BCON)比较，离散率为7.23%±0.95%，与云南B亚型(YN-B)比较，离散率为3.31%±1.04%。详见表1。
三、Growtree程序自动生成系统树状图
结果：与基因排序相吻合，更直观地揭示贵州HIV-1流行毒株的亚型分布。详见图1。
图1 贵州HIV毒株系统结构树状图
讨论
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一、关于HIV-1毒株来源及分布
从结果看出，贵州HIV-1毒株中GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809与云南B亚型更接近，表明这些毒株主要从云南传入我省，而其余毒株则可能从沿海城市和其他省份传入。还可看出，在本文研究的20份标本中，真正核酸分离成功有排序结果的仅11份。其中云南B亚型4份(4/11)，欧美B亚型3份(3/11)，国际E亚型2份(2/11)，国际C亚型2份(2/11)。这一结果显示贵州HIV毒株来源广泛，分布复杂，尤其是主要通过性接触传播。目前国内仅少数省份有E、C亚型，在贵州不仅有，而且比例不小(占实验总数的4/11；占性传播感染者样本检出率的100%)。预示贵州今后HIV的流行，将以性接触传播的E、C亚型为主。
二、关于流行时间和变异
从表1看出，贵州B亚型组内基因离散率为3.21%±1.4%，其中GZ9812、GZ9815、GZ9811、GZ9809与云南流行株(YN-B)，即由欧美B亚型变异而来的云南B亚型[1,2]相接近，基因离散率为3.31%±1.04%，而GZ9809、GZ9814、GZ9808、GZ9813与国际标准B亚型(BCON)流行株相近者为7.23%±0.95%。有文献报道，用基因离散率来反应HIV毒株在某一地区变异程度，可按照平均每年基因离散率增加0.5%～1%计算[3,4]。基因离散率值越大，其毒株的变异程度越大，此毒株在某一地区的流行时间也越长。流行于我国云南的云南B亚型毒株传入贵州的时间约3年，而欧美B亚型毒株传入贵州的时间则较早。贵州E亚型组内基因离散率为1.65%，说明E亚型毒株传入贵州的时间约为1～2年。贵州C亚型毒株组内基因离散率为0.98%，表明C亚型毒株传入贵州时间更短，约为1年。
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三、关于流行态势
国内外对HIV-1毒株亚型分布的研究表明，B亚型主要经输血或静脉吸毒等血液传播，先流行于欧美后流行于东南亚；E亚型主要经性接触传播，主要流行于欧美。C亚型亦主要经性传播，主要流行于欧美和印度。众所周知，输血和静脉吸毒方式传播的B亚型完全可通过政策因素加以干预，在短期内迅速得以控制；而以性传播为主的E、C亚型是很难以通过政策因素在短期内加以控制。然而，E、C亚型在贵州流行时间不长，所占比例很大，随着时间的推移，其发展趋势将会越来越严重，这必将给贵州HIV的防治增加一定难度。
本课题为贵州省自然科学基金资助项目
参 考 文 献
1，Kalish ML, Baldwin A, Raktham S, et al. The evolving molecular epidemiology of HIV- 1 envelope subtypes in injecting drug users in Bangkok. Thailand: implications for HIVvaccine trials. AIDS, 1995,9:851- 859.
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2，邵一鸣，管永军，赵全壁，等.1995年云南瑞丽HIV-1毒株的基因变异和分析.病毒学报，1996，12：9-16.
3，Ou CY, Takebe Y, Weniger BG, et al. Independent introduction of two major HIV- 1 genotypes into distinct high risk populations in Thailand. Lancet, 1993,341:1171- 1174.
4，Weniger BG, Tabede Y, Ou CY, et al. The molecular epidemiology of HIV in Asia. ADIS, 1994,8(Suppl 2):S1- S14.
(收 稿 日 期 ： 1999- 11- 10), 百拇医药