解脲支原体第一群各型在不同人群泌尿生殖道中的检测
作者：周向昭 马燕燕 孔繁荣 段逸群 王玮臻 朱学骏
单位：孔繁荣 马燕燕 朱学骏(100034北京医科大学第一医院皮肤科)；周向昭(现在张家口医学院附属第一医院皮肤科)；段逸群 王玮臻(武汉市第一医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000325
解脲支原体(Uu)为性传播疾病(STD)中非淋菌性尿道炎(NGU)的重要病原体之一，分为2个生物群和14个血清型。第1群包括1、3、6、14四个血清型，第2群包括其余10个血清型[1]。在人类泌尿生殖道定殖或引起感染的Uu绝大部分为第1群[2]。本研究首先用Uu分群引物对321份泌尿生殖道标本进行PCR扩增分群，在此基础上，对Uu阳性标本进一步用分型引物结合酶切的方法进行分型研究。最后再根据型的酶切位点，用特异的限制性内切酶对分型结果进一步验证，初步探讨Uu分群分型在不同人群泌尿生殖道定殖与感染的关系。
, 百拇医药
一、材料与方法
(一)分群检测：
1.标本来源：1996年3月至1997年10月采集了321份泌尿生殖道标本，其中34份NGU伴发慢性前列腺炎患者前列腺液，99份STD门诊患者尿道或宫颈分泌物，其中54份取自女性患者，45份取自男性患者，138份卖淫妇女宫颈分泌物，50份妇科门诊及孕妇宫颈分泌物，其中妇科门诊患者25份，孕妇25份。
2.DNA模板的制备：按我科实验室常规进行[3]。
3.引物：参照Teng等的设计[4]，合成下列引物。Uu通用引物UMS-125，UMA226，第1群扩增片段长403bp，第2群448bp。Uu第1群特异引物UMS51，UMA427，扩增片段长429bp。
4.PCR扩增：反应体系25μL，94℃、62℃、72℃各1min，进行35个循环，最后在72℃延伸5min；扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳在紫外灯上检测。
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(二)分型检测：
1.DNA：分群检测得到的Uu阳性标本。
2.限制性内切酶消化：限制性内切酶HinfⅠ及RsaⅠ，酶切反应体系20μL，37℃,3h,2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯上观察结果。
3.根据我们对Uu第1群MB抗原基因N端克隆测序结果，设计合成了Uu分型引物UMS51(5′-ATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC-3′)，UMAU1(5′-ATGACCTTTTGTAACTAGAT-3′)，PCR扩增Uu1型和Uu6型，扩增片段长230bp；UMS51(5′-TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTAC-3′)，UMAU3(5′-CTAAATGACCTTTTTCAAGTGTAC-3′)，PCR扩增Uu3型，扩增片段长230bp。
二、结果
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1.分群结果：引物UMS-125、UMA226PCR扩增321份泌尿生殖道标本，结果111份阳性，扩增片段均长403bp，全部为第1群，与引物UMS51、UMA427的扩增结果相符(图1)。
图1 引物UMS-125,UMA226及UMS51,UMA427 PCR 扩增结果
在111份Uu阳性标本中，NGU伴慢性前列腺炎21例(21/34，61.8%)；STD门诊患者13例(13/99，13.1%)，其中女9例，男4例；卖淫妇女宫颈分泌物60份(60/138，43.5%)；妇科门诊及孕妇宫颈分泌物17份(17/50，34%)，其中妇科门诊患者6例(6/25，24%)，孕妇11例(11/25，42%)。
2.分型结果：对111份Uu第1群阳性扩增标本进一步用UMS51、UMAU1及UMS51，UMAU3引物进行分型，扩增片段长度均为230bp(图2)。结果显示Uu3型全部阳性，Uu1型和Uu6型27份阳性，其中NGU伴慢性前列腺炎15例(71.4%)，STD门诊患者4份(30.7%)，卖淫妇女宫颈分泌物7份(11.7%)，妇科门诊及孕妇宫颈分泌物1份(24.3%)。
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图2 分型引物UMS51,UMAU1 及时性UMS51,UMAU3 PSR扩增结果
3.限制性内切酶消化结果：用限制性内切酶HinfⅠ消化Uu第1群UMS-125，UMA226扩增阳性标本，UMS51，UMAU1扩增阳性的STD门诊患者的标本有2例出现3条带，分别为142bp、261bp和403bp；其余均被切成2条带，分别为142bp和261bp(图3)。
图3 限制性内切酶Hinf I消化分型结果
4.用RsaⅠ酶切验证分型结果：RsaⅠ酶切111份Uu第1群UMS51，UMA427阳性扩增标本，27份标本出现183bp、246bp和429bp3条带，其余标本则出现183bp和246bp2条带。
三、讨论
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通用引物UMS-125，UMA226及第1群特异引物UMS51，UMA427PCR扩增本组321份泌尿生殖道标本，Uu阳性111份，占34.6%(111/321)，且全部为第1群。结果显示，泌尿生殖道Uu定殖或引起感染绝大部分为第1群，与孔繁荣等[2]1995年报道的结果一致。
在分群基础上，对111份Uu第1群阳性标本用PCR结合限制性内切酶消化的方法进行分型检测。结果Uu3型全部阳性，占100%，Uu1型27份，其中有2份合并Uu6型寄居。RsaⅠ酶切111份UMS51，UMA427扩增阳性的第1群阳性标本，酶切条带分析表明，Uu3型全部阳性，Uu1型合并Uu6型27份，与PCR扩增结果一致。
本研究在进行分型检测中发现，111份Uu第1群阳性标本中，Uu3型全部阳性，合并Uu1型27份，Uu6型2份，提示Uu第1群在泌尿生殖道定殖或感染不只为单纯型而且还存在着复合型。Uu3型在各组人群中检出率最高，推测此型普遍定殖于Uu阳性的泌尿生殖道中，很可能是与Uu1型、Uu6型或其它微生物具有协同致病或条件致病的病原体。Uu1型阳性标本27份，包括NGU伴慢性前列腺炎15份，均伴有明显的NGU临床症状；STD门诊患者4份，全部为女性，有不同程度的白带增多，其中1例盆腔炎4年，临床怀疑NGU引起，1例伴有滴虫性阴道炎，丈夫患有尖锐湿疣，其余2例均有非婚性接触史；卖淫妇女宫颈分泌物7份，均有非婚性接触史；孕妇中发现1例，未见有临床症状。这一结果显示，Uu1型在具有明显临床症状的NGU伴慢性前列腺炎患者中检出较高，其余人群中伴有不同程度的临床症状，并多数有非婚性接触史，提示Uu1型可能有直接致病性，其发病机理有待于进一步研究。Uu6型检出率很低，阳性标本2份来自STD门诊患者，其他人群中均未检出，表明在人泌尿生殖道中很少，其与临床致病的关系还有待于探讨。总之，Uu第1群各型在临床致病中可能具有不同的作用。
, 百拇医药
西安杨森皮肤科学教育与研究基金资助课题
参 考 文 献
1，Cassell GH, Waetes KB, Watson HL, et al. Ureaplasma urealyticum intrauterine infection: role in prematurity and disease in newborns. J Clin Microbiol, 1993,31:69- 87.
2，孔繁荣，朱学骏，周骏马，等.泌尿生殖道解脲脲原体的分群研究.中华流行病学杂志，1995，16(1-A)：41-42.
3，孔繁荣，朱学骏，陈洪，等.聚合酶链反应及组织病理诊断尖锐湿疣的比较研究.中华皮肤科杂志，1993，26：340-342.
4，Teng LJ, Zheng X, Glass JI, et al. Ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple banded antigen gene. J Clin Microbiol, 1994,32:1464- 1469.
(收 稿 日 期 ： 1999- 06- 23), 百拇医药
单位：孔繁荣 马燕燕 朱学骏(100034北京医科大学第一医院皮肤科)；周向昭(现在张家口医学院附属第一医院皮肤科)；段逸群 王玮臻(武汉市第一医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000325
解脲支原体(Uu)为性传播疾病(STD)中非淋菌性尿道炎(NGU)的重要病原体之一，分为2个生物群和14个血清型。第1群包括1、3、6、14四个血清型，第2群包括其余10个血清型[1]。在人类泌尿生殖道定殖或引起感染的Uu绝大部分为第1群[2]。本研究首先用Uu分群引物对321份泌尿生殖道标本进行PCR扩增分群，在此基础上，对Uu阳性标本进一步用分型引物结合酶切的方法进行分型研究。最后再根据型的酶切位点，用特异的限制性内切酶对分型结果进一步验证，初步探讨Uu分群分型在不同人群泌尿生殖道定殖与感染的关系。
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一、材料与方法
(一)分群检测：
1.标本来源：1996年3月至1997年10月采集了321份泌尿生殖道标本，其中34份NGU伴发慢性前列腺炎患者前列腺液，99份STD门诊患者尿道或宫颈分泌物，其中54份取自女性患者，45份取自男性患者，138份卖淫妇女宫颈分泌物，50份妇科门诊及孕妇宫颈分泌物，其中妇科门诊患者25份，孕妇25份。
2.DNA模板的制备：按我科实验室常规进行[3]。
3.引物：参照Teng等的设计[4]，合成下列引物。Uu通用引物UMS-125，UMA226，第1群扩增片段长403bp，第2群448bp。Uu第1群特异引物UMS51，UMA427，扩增片段长429bp。
4.PCR扩增：反应体系25μL，94℃、62℃、72℃各1min，进行35个循环，最后在72℃延伸5min；扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳在紫外灯上检测。
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(二)分型检测：
1.DNA：分群检测得到的Uu阳性标本。
2.限制性内切酶消化：限制性内切酶HinfⅠ及RsaⅠ，酶切反应体系20μL，37℃,3h,2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯上观察结果。
3.根据我们对Uu第1群MB抗原基因N端克隆测序结果，设计合成了Uu分型引物UMS51(5′-ATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTACC-3′)，UMAU1(5′-ATGACCTTTTGTAACTAGAT-3′)，PCR扩增Uu1型和Uu6型，扩增片段长230bp；UMS51(5′-TGTGGATCCTTCTGGGCTATGACATTAGGTGTTAC-3′)，UMAU3(5′-CTAAATGACCTTTTTCAAGTGTAC-3′)，PCR扩增Uu3型，扩增片段长230bp。
二、结果
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1.分群结果：引物UMS-125、UMA226PCR扩增321份泌尿生殖道标本，结果111份阳性，扩增片段均长403bp，全部为第1群，与引物UMS51、UMA427的扩增结果相符(图1)。
图1 引物UMS-125,UMA226及UMS51,UMA427 PCR 扩增结果
在111份Uu阳性标本中，NGU伴慢性前列腺炎21例(21/34，61.8%)；STD门诊患者13例(13/99，13.1%)，其中女9例，男4例；卖淫妇女宫颈分泌物60份(60/138，43.5%)；妇科门诊及孕妇宫颈分泌物17份(17/50，34%)，其中妇科门诊患者6例(6/25，24%)，孕妇11例(11/25，42%)。
2.分型结果：对111份Uu第1群阳性扩增标本进一步用UMS51、UMAU1及UMS51，UMAU3引物进行分型，扩增片段长度均为230bp(图2)。结果显示Uu3型全部阳性，Uu1型和Uu6型27份阳性，其中NGU伴慢性前列腺炎15例(71.4%)，STD门诊患者4份(30.7%)，卖淫妇女宫颈分泌物7份(11.7%)，妇科门诊及孕妇宫颈分泌物1份(24.3%)。
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图2 分型引物UMS51,UMAU1 及时性UMS51,UMAU3 PSR扩增结果
3.限制性内切酶消化结果：用限制性内切酶HinfⅠ消化Uu第1群UMS-125，UMA226扩增阳性标本，UMS51，UMAU1扩增阳性的STD门诊患者的标本有2例出现3条带，分别为142bp、261bp和403bp；其余均被切成2条带，分别为142bp和261bp(图3)。
图3 限制性内切酶Hinf I消化分型结果
4.用RsaⅠ酶切验证分型结果：RsaⅠ酶切111份Uu第1群UMS51，UMA427阳性扩增标本，27份标本出现183bp、246bp和429bp3条带，其余标本则出现183bp和246bp2条带。
三、讨论
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通用引物UMS-125，UMA226及第1群特异引物UMS51，UMA427PCR扩增本组321份泌尿生殖道标本，Uu阳性111份，占34.6%(111/321)，且全部为第1群。结果显示，泌尿生殖道Uu定殖或引起感染绝大部分为第1群，与孔繁荣等[2]1995年报道的结果一致。
在分群基础上，对111份Uu第1群阳性标本用PCR结合限制性内切酶消化的方法进行分型检测。结果Uu3型全部阳性，占100%，Uu1型27份，其中有2份合并Uu6型寄居。RsaⅠ酶切111份UMS51，UMA427扩增阳性的第1群阳性标本，酶切条带分析表明，Uu3型全部阳性，Uu1型合并Uu6型27份，与PCR扩增结果一致。
本研究在进行分型检测中发现，111份Uu第1群阳性标本中，Uu3型全部阳性，合并Uu1型27份，Uu6型2份，提示Uu第1群在泌尿生殖道定殖或感染不只为单纯型而且还存在着复合型。Uu3型在各组人群中检出率最高，推测此型普遍定殖于Uu阳性的泌尿生殖道中，很可能是与Uu1型、Uu6型或其它微生物具有协同致病或条件致病的病原体。Uu1型阳性标本27份，包括NGU伴慢性前列腺炎15份，均伴有明显的NGU临床症状；STD门诊患者4份，全部为女性，有不同程度的白带增多，其中1例盆腔炎4年，临床怀疑NGU引起，1例伴有滴虫性阴道炎，丈夫患有尖锐湿疣，其余2例均有非婚性接触史；卖淫妇女宫颈分泌物7份，均有非婚性接触史；孕妇中发现1例，未见有临床症状。这一结果显示，Uu1型在具有明显临床症状的NGU伴慢性前列腺炎患者中检出较高，其余人群中伴有不同程度的临床症状，并多数有非婚性接触史，提示Uu1型可能有直接致病性，其发病机理有待于进一步研究。Uu6型检出率很低，阳性标本2份来自STD门诊患者，其他人群中均未检出，表明在人泌尿生殖道中很少，其与临床致病的关系还有待于探讨。总之，Uu第1群各型在临床致病中可能具有不同的作用。
, 百拇医药
西安杨森皮肤科学教育与研究基金资助课题
参 考 文 献
1，Cassell GH, Waetes KB, Watson HL, et al. Ureaplasma urealyticum intrauterine infection: role in prematurity and disease in newborns. J Clin Microbiol, 1993,31:69- 87.
2，孔繁荣，朱学骏，周骏马，等.泌尿生殖道解脲脲原体的分群研究.中华流行病学杂志，1995，16(1-A)：41-42.
3，孔繁荣，朱学骏，陈洪，等.聚合酶链反应及组织病理诊断尖锐湿疣的比较研究.中华皮肤科杂志，1993，26：340-342.
4，Teng LJ, Zheng X, Glass JI, et al. Ureaplasma urealyticum biovar specificity and diversity are encoded in multiple banded antigen gene. J Clin Microbiol, 1994,32:1464- 1469.
(收 稿 日 期 ： 1999- 06- 23), 百拇医药