10味中药抗沙眼衣原体活性的体外药敏试验
作者：汪培土 佟菊贞 涂裕英 李建军
单位：汪培土(510507广州武警广东省总队医院内二科)；佟菊贞 涂裕英 李建军(中山医科大学附属第一医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000323
沙眼衣原体(Ct)是非淋菌性尿道炎(NGU)的最重要的病原体之一。为探讨中药对Ct的抑制作用，我们采用微量细胞培养法和微量稀释法测定了10味中药对15株Ct国际标准株的体外药物敏感试验。现将实验结果报道如下。
一、材料和方法
(一)菌株：15株Ct国际标准株(7株Dm5亚型和8株Km5亚型)购于美国ATCC公司。
(二)细胞株：McCoy细胞由中山医科大学附属第一医院皮肤科实验室提供。
, 百拇医药
(三)主要试剂：RPMI1640培养基及制霉菌素为Gibco公司产品，放线菌酮为Sigma公司产品，其它试剂为国产分析纯产品。
(四)主要仪器和设备：-80℃低温冰箱及Mco-125型CO2培养箱为日本Sanyo公司产品。LXJ-Ⅱ型离心机为上海医用分析仪器厂产品。96孔细胞培养板为Gibco公司产品。倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品。
(五)中药煎剂的准备：水提法[1]：共10味中药(均购于广州医药材公司)，每种中药经品种鉴定和准确称量适当粉碎或切片，蒸馏水浸泡30min，加热煮沸。开始用强火沸腾后改用文火保持45min，搅拌趁热过滤。药渣再加入蒸馏水同法煎熬45min，过滤，两液混合经浓缩成1∶1液，即1mL煎液相当于1g生药。用2.5mol/L(10%)NaOH调节pH值至7.2，再次过滤分装试管，10磅30min高压灭菌，置-20℃冰箱保存，试验前用无抗生素营养液稀释。
(六)MIC测定方法[2-4]：首先以10倍稀释法稀释Ct标准株，将不同稀释度的菌液接种于96孔预先准备好的致密单层McCoy细胞培养板中使之在适合条件下培养48h，染色后使每个孔产生4.5×103包涵体数量的最大稀释度为滴定浓度。然后在形成致密单层McCoy细胞的96孔板中第1～11孔加入上述滴定浓度的Ct标准株50μL。此96孔板在室温下2000g离心1h后置37℃体积分数为5%CO2温箱中孵育2h。然后吸掉上清液，用不含抗生素营养液配制的按浓度梯度250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.9、1.96、0.98、0.49mg/mL共10个稀释度的中药煎剂200μL分别加入2～11孔。第1和第12孔加入不含抗生素营养液，使每孔液体体积均为200μL。第1孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。整块板室温下2000g离心1h后置37℃体积分数为5%CO2温箱中培养48h。最后弃上清液，甲醇固定，在倒置显微镜下观察结果。
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二、结果
(一)微量细胞培养法和微量稀释法测定10味中药对Ct的MIC值见表1。结果判定以实验株在低浓度即被抑制(镜检未见包涵体生长)表示该株对该药敏感，而在高浓度时方被抑制表示该株对该药不敏感或者耐药。
表1 10味中药体外抗沙眼衣原体活性情况
中药 药物浓度(mg/mL) MIC(mg/mL) 0.49 0.98 2.00 3.91 7.81 15.6 31.3 62.5 125 250 川连 1 2 2 5 5 - - - - - 0.49～7.81 大黄 - - - - - 1 9 5 - - 15.6～62.5 川柏 - - - - - 2 10 3 - - 15.6～62.5 败酱草 - - - - - 6 7 2 - - 15.6～62.5 地肤子 - - - - - 4 8 3 - - 15.6～62.5 龙胆草 - - - - - 10 - 5 - - 15.6～62.5 车前草 - - - - - - - - 1 9 ≥125 生栀子 - - - - - - - - 3 9 ≥125 柴胡 - - - - - - - - - 1 ≥250 茯苓 - - - - - - - - - - >250
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注：表中数字代表该药物在某浓度下被抑制的菌株数，-为未被抑制或非最低抑菌浓度
(二)结果表明Ct对川连有较高的敏感性，其MIC≤7.81mg/mL；对大黄、川柏、败酱草、地肤子、龙胆草的敏感性次之，其15.6mg/mL≤MIC≤62.5mg/mL；对生栀子、车前草、柴胡、茯苓不敏感，其MIC>62.5mg/mL。
三、讨论
通过本实验表明川连、大黄、川柏、龙胆草等中药有一定的体外抑制Ct效应，尽管药物在体内的疗效机制比体外抗菌作用更为复杂，但本实验可有助于临床上组方选择用药。
中药煎液的颜色对结果的判断有影响。大黄、川连等煎液均为深黄色的液体，与衣原体包涵体的碘染色颜色差不多，故覆盖包涵体的颜色使结果难以判断，这时应对不能判断的孔再次盲传来看有无包涵体产生。药物的细胞毒作用对体外敏感性的测定产生至关重要的影响。此外，中药的煎药方法、煎液性质以及培养条件的选择、接种量、无菌营养液的配制等对结果也可能产生影响。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，陈奇.中药药理学研究方法.第1版.北京：人民卫生出版社，1993.67-68.
2，白桦，佟菊贞，曾庆祥，等.46株泌尿生殖道沙眼衣原体分离株11株标准株对19种抗生素药物敏感性检测.皮肤性病防治.第1版.南京：江苏科学技术出版社，1994.277-281.
3，刘忠义，张国威，何云志.解脲支原体中药药敏试验.中华皮肤科杂志，1996，29：349-351.
4，Ehret JM, Judson FN. Susceptibility testing of Chlamydia trachomatis: from eggs to monoclonal antibodies. Antimicrob Agents Chemother, 1988,32:1295- 1299.
(收 稿 日 期 ： 1999- 10- 08), 百拇医药
单位：汪培土(510507广州武警广东省总队医院内二科)；佟菊贞 涂裕英 李建军(中山医科大学附属第一医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000323
沙眼衣原体(Ct)是非淋菌性尿道炎(NGU)的最重要的病原体之一。为探讨中药对Ct的抑制作用，我们采用微量细胞培养法和微量稀释法测定了10味中药对15株Ct国际标准株的体外药物敏感试验。现将实验结果报道如下。
一、材料和方法
(一)菌株：15株Ct国际标准株(7株Dm5亚型和8株Km5亚型)购于美国ATCC公司。
(二)细胞株：McCoy细胞由中山医科大学附属第一医院皮肤科实验室提供。
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(三)主要试剂：RPMI1640培养基及制霉菌素为Gibco公司产品，放线菌酮为Sigma公司产品，其它试剂为国产分析纯产品。
(四)主要仪器和设备：-80℃低温冰箱及Mco-125型CO2培养箱为日本Sanyo公司产品。LXJ-Ⅱ型离心机为上海医用分析仪器厂产品。96孔细胞培养板为Gibco公司产品。倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品。
(五)中药煎剂的准备：水提法[1]：共10味中药(均购于广州医药材公司)，每种中药经品种鉴定和准确称量适当粉碎或切片，蒸馏水浸泡30min，加热煮沸。开始用强火沸腾后改用文火保持45min，搅拌趁热过滤。药渣再加入蒸馏水同法煎熬45min，过滤，两液混合经浓缩成1∶1液，即1mL煎液相当于1g生药。用2.5mol/L(10%)NaOH调节pH值至7.2，再次过滤分装试管，10磅30min高压灭菌，置-20℃冰箱保存，试验前用无抗生素营养液稀释。
(六)MIC测定方法[2-4]：首先以10倍稀释法稀释Ct标准株，将不同稀释度的菌液接种于96孔预先准备好的致密单层McCoy细胞培养板中使之在适合条件下培养48h，染色后使每个孔产生4.5×103包涵体数量的最大稀释度为滴定浓度。然后在形成致密单层McCoy细胞的96孔板中第1～11孔加入上述滴定浓度的Ct标准株50μL。此96孔板在室温下2000g离心1h后置37℃体积分数为5%CO2温箱中孵育2h。然后吸掉上清液，用不含抗生素营养液配制的按浓度梯度250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.9、1.96、0.98、0.49mg/mL共10个稀释度的中药煎剂200μL分别加入2～11孔。第1和第12孔加入不含抗生素营养液，使每孔液体体积均为200μL。第1孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。整块板室温下2000g离心1h后置37℃体积分数为5%CO2温箱中培养48h。最后弃上清液，甲醇固定，在倒置显微镜下观察结果。
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二、结果
(一)微量细胞培养法和微量稀释法测定10味中药对Ct的MIC值见表1。结果判定以实验株在低浓度即被抑制(镜检未见包涵体生长)表示该株对该药敏感，而在高浓度时方被抑制表示该株对该药不敏感或者耐药。
表1 10味中药体外抗沙眼衣原体活性情况
中药 药物浓度(mg/mL) MIC(mg/mL) 0.49 0.98 2.00 3.91 7.81 15.6 31.3 62.5 125 250 川连 1 2 2 5 5 - - - - - 0.49～7.81 大黄 - - - - - 1 9 5 - - 15.6～62.5 川柏 - - - - - 2 10 3 - - 15.6～62.5 败酱草 - - - - - 6 7 2 - - 15.6～62.5 地肤子 - - - - - 4 8 3 - - 15.6～62.5 龙胆草 - - - - - 10 - 5 - - 15.6～62.5 车前草 - - - - - - - - 1 9 ≥125 生栀子 - - - - - - - - 3 9 ≥125 柴胡 - - - - - - - - - 1 ≥250 茯苓 - - - - - - - - - - >250
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注：表中数字代表该药物在某浓度下被抑制的菌株数，-为未被抑制或非最低抑菌浓度
(二)结果表明Ct对川连有较高的敏感性，其MIC≤7.81mg/mL；对大黄、川柏、败酱草、地肤子、龙胆草的敏感性次之，其15.6mg/mL≤MIC≤62.5mg/mL；对生栀子、车前草、柴胡、茯苓不敏感，其MIC>62.5mg/mL。
三、讨论
通过本实验表明川连、大黄、川柏、龙胆草等中药有一定的体外抑制Ct效应，尽管药物在体内的疗效机制比体外抗菌作用更为复杂，但本实验可有助于临床上组方选择用药。
中药煎液的颜色对结果的判断有影响。大黄、川连等煎液均为深黄色的液体，与衣原体包涵体的碘染色颜色差不多，故覆盖包涵体的颜色使结果难以判断，这时应对不能判断的孔再次盲传来看有无包涵体产生。药物的细胞毒作用对体外敏感性的测定产生至关重要的影响。此外，中药的煎药方法、煎液性质以及培养条件的选择、接种量、无菌营养液的配制等对结果也可能产生影响。
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参 考 文 献
1，陈奇.中药药理学研究方法.第1版.北京：人民卫生出版社，1993.67-68.
2，白桦，佟菊贞，曾庆祥，等.46株泌尿生殖道沙眼衣原体分离株11株标准株对19种抗生素药物敏感性检测.皮肤性病防治.第1版.南京：江苏科学技术出版社，1994.277-281.
3，刘忠义，张国威，何云志.解脲支原体中药药敏试验.中华皮肤科杂志，1996，29：349-351.
4，Ehret JM, Judson FN. Susceptibility testing of Chlamydia trachomatis: from eggs to monoclonal antibodies. Antimicrob Agents Chemother, 1988,32:1295- 1299.
(收 稿 日 期 ： 1999- 10- 08), 百拇医药