裸鼠重建毛囊的组织学研究
作者：吕中法 伍津津 刘荣卿 钟白玉 唐书谦 叶庆佾
单位：吕中法(400038重庆,第三军医大学西南医院皮肤科 现在第三军医大学新桥医院皮肤科)；伍津津(现在第三军医大学大坪医院皮肤科)；刘荣卿 钟白玉 唐书谦 叶庆佾(400038重庆,第三军医大学西南医院皮肤科)
关键词：毛囊；器官培养
中华皮肤科杂志000405
【摘要】目的观察毛乳头细胞诱导毛囊再生情况和毛囊重建情况。方法采用器官型培养技术和裸鼠移植技术，将培养的毛囊毛乳头细胞、真皮鞘细胞和头皮(或包皮)真皮成纤维细胞分别制成胶原凝胶，再接种于毛囊上皮上段、下段和球部细胞，进行体外培养和裸鼠移植试验。结果在毛囊毛乳头细胞与毛囊各段上皮细胞的器官型培养中均可见毛囊样结构形成；毛囊真皮鞘细胞凝胶上培养的毛球部细胞也重建出毛囊样结构。移植到裸鼠皮下后则可见较为完整的毛囊结构形成。结论低传代培养的毛乳头细胞在体内外均具有诱导毛囊再生的能力。
, 百拇医药
Histological Study of Reconstructed Hair Follicles
LU Zhongfa，WU Jinjin，LIU Rongqin，et al.
(Department of Dermatology，Third Military Medical University, Chongqing 400037)
【 Abstract】 Objective To observe the ability of dermal papilla cells inducing hair follicle regeneration and hair follicle reconstruction. Methods Gels of typeⅠ collagen(rat tail) separately populated with hair papillary cells(DPC), dermal sheath cells(DSC) or dermal fibroblasts were prepared. After contraction gels were mounted in a small tube. The epithelial cells of hair follicle were seeded onto these gels, grew in DMEM medium for a week, and lifted at the air-medium interface and grew for an additional week, then grafted into the subcutis of nude mice. Results The formation of hair follicle-like structure was observed in the combined culture of DPC with the cells of the upper fragment, lower portion and bulb of follicles or in organ culture of DSC with bulb cells. Nevertheless, when the cultures were implanted into the subcutis of nude mice, the relatively intact hair follicles were formed. Conclusion DPC can induce hair follicle regeneration and sustain hair follicle growth in vivo and in vitro.
, 百拇医药
【 Key words】 Hair follicle Organ culture
毛囊是一个具有周期性生长的皮肤附属器官，由上皮和真皮两部分组成。毛囊的真皮成 分特别是毛乳头细胞在诱导和维持毛囊的生长、再生以及毛发增长方面具有很重要的作 用[1]。我们利用毛乳头细胞制成凝胶，然后再接种毛囊上皮细胞，重建出了毛囊样结构 ，移植到裸鼠后形成较为完整的毛囊，现报道如下。
材料和方法
一、毛囊各种细胞的培养
参照伍津津等[2]方法进行。
1.分别培养出毛囊毛乳头细胞(DPC)、真皮鞘成纤维细胞(DSC)、和头皮(或包皮)真皮成 纤维细胞(FB)，并传代培养数次(<6代),各取1.5×l05个细胞，梯度离心后加入0.5mL小牛血 清。
, 百拇医药
2.吸4mL鼠尾胶原(质量浓度为1.0～1.5mg/mL)于冰浴中的青霉素小瓶中，加入浓缩的DMEM培养基，1NNaOH调pH，立即加入一种毛 囊真皮细胞的小牛血清细胞悬液，快速混合，制成间质细胞凝胶，然后吸到24孔板中。 当凝胶收缩到0.8～1.0cm时，加入一自行设计的玻璃导管(内径为0.8或1.0cm，高均为1.0 cm)，压住胶原凝胶以防止它继续收缩。
3.头皮标本经无菌处理后剪成0.3～0.5cm大小的小皮片，再从真皮和皮下组织交界处剪开 。加入0.5%的分离酶，4℃，消化16～18h。将皮片移入D-Hanks液中，分离表皮与真皮 ，再从表皮剪下毛囊，从真皮中挤出尚未游离出的毛囊，此段为毛囊上段；从皮下组织 中分出毛囊下部，再分成毛囊下段和毛球部。包皮标本经无菌处理后，0.5%的分离酶， 4℃，消化16～18h，将皮片移入D-Hanks液中，分离表皮与真皮。用0.125%胰蛋白酶加 0.02%EDTA消化毛囊各段上皮、头皮和包皮的表皮，用5%新生牛血清D-Hanks液中止消 化，分别吹散细胞，过筛，计数，离心。
, 百拇医药
二、毛囊器官型培养方法
将上述各种分离的毛囊上皮细胞和表皮角质形成 细胞分别接种到已准备好的间质细胞胶原凝胶上，与上述3种间质细胞凝胶组合，共组 成15组。每孔加5×105个细胞，加入DMEM培养基(含有EGFl0ng/mL，氢化可的松0.4μg/ mL，胰岛素5μg/mL)1mL培养，每2d换液1次。浸没培养1周，待上皮细胞融合后进行气 液界面培养，在真皮替代物下加入用不锈钢筛网制成的衬垫，再培养1周,进行裸鼠移植 ；或再培养6周后做病理检查。
图1毛囊毛乳头细胞与毛囊上皮细胞器官型培养8周(HE染色×400)
图2毛囊毛乳头细胞与 毛囊上皮细胞的器官型培养物裸鼠移植后8周(HE染色×40)
, http://www.100md.com
三、裸鼠移植试验
选l～3个月大裸鼠，雌雄不限，用0.8%戊巴比妥钠0.15mL行裸鼠腹腔内注射，数分钟后用 针尖刺激裸鼠皮肤，仅有轻微反应，表明麻醉成功，常规消毒裸鼠背部皮肤，无菌条件 下将裸鼠背部两侧各剪开一长约1cm的切口，钝性分离皮下组织，将培养组织移植到裸 鼠皮下。然后缝合皮肤并包扎,部分移植物用自制玻璃导管固定，1周后拆线。上述裸鼠 移植后分别于第6、8、12周切下移植部位标本，进行组织学检查。
四、组织学检查
部分培养组织和移植后的组织分别用Bouins液固定，常规石蜡切片，HE染色。
结果
一、毛囊器官型培养物的组织学检查结果
在DPC加毛囊各段上皮细胞的器官型培养物中可见毛囊样结构形成,由数层同心圆排列的 上皮细胞组成,胞浆嗜伊红,中心为嗜伊红角化物质,可见色素颗粒(图1)。DSC加毛球部细胞 的器官型培养物也可形成毛囊样结构。包皮或头皮FB与毛囊上皮组合在毛囊器官型培养 中未见毛囊样结构形成。DPC与头皮或包皮角质形成细胞组合也不能形成毛囊样结构。
, 百拇医药
二、裸鼠移植标本的组织学检查结果
二种移植方法中以小室内移植较复杂，该法拆线后即可见移植区有较多的色素，说明移 植物存活。皮下移植则要到10d左右才能见到移植区色素沉着。移植12周内未见移植区有 毛发纤维长出。
组织学检查发现DPC与毛囊上段、下段、球部细胞组成的毛囊器官型培养物，植到裸鼠 上后可形成较为完整的毛囊，HE染色显示毛囊由数层上皮细胞呈同心圆排列而成，中心 为嗜伊红染色的角化物质，位于真皮深层和皮下组织中(图2)，接近移植物的毛囊较大， 而离移植物较远的毛囊相对较小。非移植区域裸鼠皮肤切片未见毛囊。
DSC与毛囊球部细胞组成的毛囊器官型培养物移植到裸鼠后可见毛囊形成，形态与DPC形 成的类似。这些结果与其在器官型培养中的结果一致。包皮、头皮FB与毛囊各段上皮组 成的毛囊器官型培养物移植到裸鼠后未见毛囊形成，移植区域可见较多黑素颗粒。 DSC与毛囊上、下段上皮细胞的组合也未见到毛囊形成。DPC与头皮或包皮角质形成细胞 组成的毛囊器官型培养物移植到裸鼠后可见角囊肿形成，未见毛囊样结构。
, 百拇医药
讨论
本文通过观察DPC与毛囊各段上皮细胞进行器官型培养和裸鼠移植试验，发现DPC细胞在 体外合适条件下可诱导毛囊上皮细胞形成毛囊样结构，移植到裸鼠体内后能形成更为完 整的毛囊，说明毛囊在适当的条件下可以重建，为临床上治疗提供了新的线索。
DPC具有诱导毛囊再生和支持毛发生长的特征已为众多实验所证实。我们成功地用培养 的DPC与毛囊各段上皮细胞在毛囊器官型培养中重建了毛囊样结构,支持了培养的DPC具 有诱导毛囊再生和支持毛发生长的观点。但在器官型培养条件下，DPC不能诱导长出毛 发纤维，提示该模型有待完善。
DSC与毛球部细胞组成的毛囊器官型培养可形成毛囊样结构，提示DSC与毛球部细胞共同 作用后也能获得诱导毛囊形成的功能。与伍津津等[2]报告的一致。DSC在胚胎发生、形 态学和生物学特征上与DPC紧密相关，有研究发现，当DPC被人为破坏或去除时，DSC可 以转换为DPC，形成新的毛乳头，支持毛发生长[3]。我们的结果支持了DSC可能是DPC的 贮备细胞的观点。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(39500131)
参考文献
[1]Jahoda CA, Reynolds AJ. Dermal- epidermal interactions: adult follicle- derived cell populations and hair growth.Dermatol Clin,1996,14:573- 583.
[2]伍津津，刘荣卿，叶庆佾,等.重建毛囊的组织学研究.第三军医大学学报,1998,20：114-
117.
[3] Jahoda CA, Horne KA, Mauger A, et al. Cellular and extracellular involvement in the regeneration of the rat lower vibrissa follicle. Development,1992,114:887- 897.
(收稿日期：1999-09-20), http://www.100md.com
单位：吕中法(400038重庆,第三军医大学西南医院皮肤科 现在第三军医大学新桥医院皮肤科)；伍津津(现在第三军医大学大坪医院皮肤科)；刘荣卿 钟白玉 唐书谦 叶庆佾(400038重庆,第三军医大学西南医院皮肤科)
关键词：毛囊；器官培养
中华皮肤科杂志000405
【摘要】目的观察毛乳头细胞诱导毛囊再生情况和毛囊重建情况。方法采用器官型培养技术和裸鼠移植技术，将培养的毛囊毛乳头细胞、真皮鞘细胞和头皮(或包皮)真皮成纤维细胞分别制成胶原凝胶，再接种于毛囊上皮上段、下段和球部细胞，进行体外培养和裸鼠移植试验。结果在毛囊毛乳头细胞与毛囊各段上皮细胞的器官型培养中均可见毛囊样结构形成；毛囊真皮鞘细胞凝胶上培养的毛球部细胞也重建出毛囊样结构。移植到裸鼠皮下后则可见较为完整的毛囊结构形成。结论低传代培养的毛乳头细胞在体内外均具有诱导毛囊再生的能力。
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Histological Study of Reconstructed Hair Follicles
LU Zhongfa，WU Jinjin，LIU Rongqin，et al.
(Department of Dermatology，Third Military Medical University, Chongqing 400037)
【 Abstract】 Objective To observe the ability of dermal papilla cells inducing hair follicle regeneration and hair follicle reconstruction. Methods Gels of typeⅠ collagen(rat tail) separately populated with hair papillary cells(DPC), dermal sheath cells(DSC) or dermal fibroblasts were prepared. After contraction gels were mounted in a small tube. The epithelial cells of hair follicle were seeded onto these gels, grew in DMEM medium for a week, and lifted at the air-medium interface and grew for an additional week, then grafted into the subcutis of nude mice. Results The formation of hair follicle-like structure was observed in the combined culture of DPC with the cells of the upper fragment, lower portion and bulb of follicles or in organ culture of DSC with bulb cells. Nevertheless, when the cultures were implanted into the subcutis of nude mice, the relatively intact hair follicles were formed. Conclusion DPC can induce hair follicle regeneration and sustain hair follicle growth in vivo and in vitro.
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【 Key words】 Hair follicle Organ culture
毛囊是一个具有周期性生长的皮肤附属器官，由上皮和真皮两部分组成。毛囊的真皮成 分特别是毛乳头细胞在诱导和维持毛囊的生长、再生以及毛发增长方面具有很重要的作 用[1]。我们利用毛乳头细胞制成凝胶，然后再接种毛囊上皮细胞，重建出了毛囊样结构 ，移植到裸鼠后形成较为完整的毛囊，现报道如下。
材料和方法
一、毛囊各种细胞的培养
参照伍津津等[2]方法进行。
1.分别培养出毛囊毛乳头细胞(DPC)、真皮鞘成纤维细胞(DSC)、和头皮(或包皮)真皮成 纤维细胞(FB)，并传代培养数次(<6代),各取1.5×l05个细胞，梯度离心后加入0.5mL小牛血 清。
, 百拇医药
2.吸4mL鼠尾胶原(质量浓度为1.0～1.5mg/mL)于冰浴中的青霉素小瓶中，加入浓缩的DMEM培养基，1NNaOH调pH，立即加入一种毛 囊真皮细胞的小牛血清细胞悬液，快速混合，制成间质细胞凝胶，然后吸到24孔板中。 当凝胶收缩到0.8～1.0cm时，加入一自行设计的玻璃导管(内径为0.8或1.0cm，高均为1.0 cm)，压住胶原凝胶以防止它继续收缩。
3.头皮标本经无菌处理后剪成0.3～0.5cm大小的小皮片，再从真皮和皮下组织交界处剪开 。加入0.5%的分离酶，4℃，消化16～18h。将皮片移入D-Hanks液中，分离表皮与真皮 ，再从表皮剪下毛囊，从真皮中挤出尚未游离出的毛囊，此段为毛囊上段；从皮下组织 中分出毛囊下部，再分成毛囊下段和毛球部。包皮标本经无菌处理后，0.5%的分离酶， 4℃，消化16～18h，将皮片移入D-Hanks液中，分离表皮与真皮。用0.125%胰蛋白酶加 0.02%EDTA消化毛囊各段上皮、头皮和包皮的表皮，用5%新生牛血清D-Hanks液中止消 化，分别吹散细胞，过筛，计数，离心。
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二、毛囊器官型培养方法
将上述各种分离的毛囊上皮细胞和表皮角质形成 细胞分别接种到已准备好的间质细胞胶原凝胶上，与上述3种间质细胞凝胶组合，共组 成15组。每孔加5×105个细胞，加入DMEM培养基(含有EGFl0ng/mL，氢化可的松0.4μg/ mL，胰岛素5μg/mL)1mL培养，每2d换液1次。浸没培养1周，待上皮细胞融合后进行气 液界面培养，在真皮替代物下加入用不锈钢筛网制成的衬垫，再培养1周,进行裸鼠移植 ；或再培养6周后做病理检查。
图1毛囊毛乳头细胞与毛囊上皮细胞器官型培养8周(HE染色×400)
图2毛囊毛乳头细胞与 毛囊上皮细胞的器官型培养物裸鼠移植后8周(HE染色×40)
, http://www.100md.com
三、裸鼠移植试验
选l～3个月大裸鼠，雌雄不限，用0.8%戊巴比妥钠0.15mL行裸鼠腹腔内注射，数分钟后用 针尖刺激裸鼠皮肤，仅有轻微反应，表明麻醉成功，常规消毒裸鼠背部皮肤，无菌条件 下将裸鼠背部两侧各剪开一长约1cm的切口，钝性分离皮下组织，将培养组织移植到裸 鼠皮下。然后缝合皮肤并包扎,部分移植物用自制玻璃导管固定，1周后拆线。上述裸鼠 移植后分别于第6、8、12周切下移植部位标本，进行组织学检查。
四、组织学检查
部分培养组织和移植后的组织分别用Bouins液固定，常规石蜡切片，HE染色。
结果
一、毛囊器官型培养物的组织学检查结果
在DPC加毛囊各段上皮细胞的器官型培养物中可见毛囊样结构形成,由数层同心圆排列的 上皮细胞组成,胞浆嗜伊红,中心为嗜伊红角化物质,可见色素颗粒(图1)。DSC加毛球部细胞 的器官型培养物也可形成毛囊样结构。包皮或头皮FB与毛囊上皮组合在毛囊器官型培养 中未见毛囊样结构形成。DPC与头皮或包皮角质形成细胞组合也不能形成毛囊样结构。
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二、裸鼠移植标本的组织学检查结果
二种移植方法中以小室内移植较复杂，该法拆线后即可见移植区有较多的色素，说明移 植物存活。皮下移植则要到10d左右才能见到移植区色素沉着。移植12周内未见移植区有 毛发纤维长出。
组织学检查发现DPC与毛囊上段、下段、球部细胞组成的毛囊器官型培养物，植到裸鼠 上后可形成较为完整的毛囊，HE染色显示毛囊由数层上皮细胞呈同心圆排列而成，中心 为嗜伊红染色的角化物质，位于真皮深层和皮下组织中(图2)，接近移植物的毛囊较大， 而离移植物较远的毛囊相对较小。非移植区域裸鼠皮肤切片未见毛囊。
DSC与毛囊球部细胞组成的毛囊器官型培养物移植到裸鼠后可见毛囊形成，形态与DPC形 成的类似。这些结果与其在器官型培养中的结果一致。包皮、头皮FB与毛囊各段上皮组 成的毛囊器官型培养物移植到裸鼠后未见毛囊形成，移植区域可见较多黑素颗粒。 DSC与毛囊上、下段上皮细胞的组合也未见到毛囊形成。DPC与头皮或包皮角质形成细胞 组成的毛囊器官型培养物移植到裸鼠后可见角囊肿形成，未见毛囊样结构。
, 百拇医药
讨论
本文通过观察DPC与毛囊各段上皮细胞进行器官型培养和裸鼠移植试验，发现DPC细胞在 体外合适条件下可诱导毛囊上皮细胞形成毛囊样结构，移植到裸鼠体内后能形成更为完 整的毛囊，说明毛囊在适当的条件下可以重建，为临床上治疗提供了新的线索。
DPC具有诱导毛囊再生和支持毛发生长的特征已为众多实验所证实。我们成功地用培养 的DPC与毛囊各段上皮细胞在毛囊器官型培养中重建了毛囊样结构,支持了培养的DPC具 有诱导毛囊再生和支持毛发生长的观点。但在器官型培养条件下，DPC不能诱导长出毛 发纤维，提示该模型有待完善。
DSC与毛球部细胞组成的毛囊器官型培养可形成毛囊样结构，提示DSC与毛球部细胞共同 作用后也能获得诱导毛囊形成的功能。与伍津津等[2]报告的一致。DSC在胚胎发生、形 态学和生物学特征上与DPC紧密相关，有研究发现，当DPC被人为破坏或去除时，DSC可 以转换为DPC，形成新的毛乳头，支持毛发生长[3]。我们的结果支持了DSC可能是DPC的 贮备细胞的观点。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(39500131)
参考文献
[1]Jahoda CA, Reynolds AJ. Dermal- epidermal interactions: adult follicle- derived cell populations and hair growth.Dermatol Clin,1996,14:573- 583.
[2]伍津津，刘荣卿，叶庆佾,等.重建毛囊的组织学研究.第三军医大学学报,1998,20：114-
117.
[3] Jahoda CA, Horne KA, Mauger A, et al. Cellular and extracellular involvement in the regeneration of the rat lower vibrissa follicle. Development,1992,114:887- 897.
(收稿日期：1999-09-20), http://www.100md.com