良性与恶性皮肤淋巴增生性疾病的细胞凋亡和增殖指数研究
作者：应作霖 孙建方 曾学思 姜祎群 桑红桂 李阿梅
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志000427
我们采用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的d-UTP-生物素缺口末端标记(TUNEL) 技术检测凋亡细胞，同时应用抗增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化法检测增殖细胞，研 究各种良恶性皮肤淋巴增生性疾病中细胞凋亡指数、增殖指数以及两者之间的比率，探 讨它们在皮肤淋巴增生性疾病中的意义。
一、材料和方法
1.标本：共51份良恶性皮肤淋巴增生性疾病的皮肤标本，男32例，女19例。包括10份斑 块期蕈样肉芽肿(MF)、10份肿瘤期MF、11份非MF和Sézary综合征的皮肤T细胞淋巴瘤( NCTCL)、10份皮肤B细胞淋巴瘤(CBCL)和10份皮肤假性淋巴瘤。所有标本均取自本所 病理科1992～1999年保存的石蜡包埋组织块。经临床、组织病理学和免疫组化结果证实诊 断。我们仅使用治疗前的皮肤标本作实验研究。
, http://www.100md.com
2.试剂：鼠抗人PCNA单克隆抗体购自Dako公司，ABC试剂盒购自Vector公司，凋亡检测试 剂盒购自华美公司。
3.TUNEL法检测凋亡细胞：主要步骤为，切片常规脱蜡水化；20μg/mL蛋白酶K室温消化 20min；0.3%过氧化氢甲醇溶液室温处理20min；加标记缓冲液室温15min；加TDT和生物素 -11-dUTP湿盒中37℃孵育60min；封闭液室温孵育20min，再加1∶50稀释的亲和素-辣根 过氧化物酶(Avidin-HRP)置湿盒中37℃孵育30min；最后加DAB显色液显色10min；苏木素 复染，常规封片，显微镜检查。以双蒸水代替TDT作阴性对照，DNAaseⅠ处理的切片作阳 性对照。细胞凋亡阳性结果为胞核染成棕黄色，根据染色结果分为阳性和阴性细胞。每 张切片选取10个高倍视野(×400)，计数1000个淋巴样细胞中的TUNEL阳性细胞，计算 凋亡指数(即每1000个细胞中TUNEL阳性细胞所占的百分比)。
4.免疫组化ABC方法检测PCNA：主要步骤为切片脱蜡水化，抗PCNA抗体(抗体稀释度 为1∶100)作为一抗，4℃孵育过夜，采用ABC试剂盒进行检测，DAB显色液显色，苏木 素复染，显微镜检查。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性的切片作阳性对照。 PCNA阳性结果为细胞核染成棕黄色，根据染色结果分为标记和未标记细胞，增殖指数的 计算方法同凋亡指数。
, 百拇医药
5.统计学分析：采用SPSS统计软件包进行数据统计，多组间均值的两两比较采用Tukey检 验。
二、结果
TUNEL阳性细胞代表凋亡细胞，PCNA阳性细胞代表增殖细胞。斑块期MF、肿瘤期MF、NCTCL及CBCL中的凋亡和增殖细胞 均为散在稀疏分布；皮肤假性淋巴瘤中则更为稀少。表1总结了各种良恶性皮肤淋巴增 生性疾病的凋亡指数、增殖指数以及两者之间的比率。凋亡指数：皮肤假性淋巴瘤的凋 亡指数明显低于各种恶性皮肤淋巴增生性疾病，经统计学分析，差异有显著性(P< 0.01)。斑块期MF的凋亡指数比肿瘤期MF及其它皮肤淋巴增生性疾病高(P<0.01)。
增殖指数：皮肤假性淋巴瘤的增殖指数明显低于MF、NCTCL和CBCL(P<0.01)。斑块期 MF的增殖指数比肿瘤期MF低(P<0.01)。
凋亡指数与增殖指数之间的比率：肿瘤期MF、NCTCL和CBCL几乎相同(0.2～0.3)，统计 学分析差异无显著性。但斑块期MF的凋亡和增殖指数的比率(0.683)明显高于肿瘤期 MF及其它皮肤淋巴增生性疾病(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 各种皮肤皮肤淋巴增生性疾病的凋永和增殖指数
组别
例数
凋亡指数(
±s)
增殖指数(±s)
凋亡指数/增殖指数
斑块期MF
10
6.9±1.2
10.1±2.3
, 百拇医药
0.638
肿瘤MF
10
4.8±1.0
19.9±3.3
0.241
NCTCL
11
4.5±1.1
18.3±3.1
0.246
CBCL
10
, 百拇医药
3.9±1.1
16.4±2.4
0.238
皮肤假性淋巴瘤
10
0.8±0.3
3.5±0.5
0.229
三、讨论
Leoncini等[1]研究发现细胞凋亡指数与系统性非何杰金淋巴瘤的预后有关，但凋亡指数与 皮肤淋巴增生性疾病的关系研究不多。我们使用TUNEL技术研究各种良恶性皮肤淋巴增 生性疾病的凋亡指数，同时检测它们的细胞增殖指数。结果发现肿瘤期MF、NCTCL和 CBCL的凋亡指数、增殖指数以及凋亡与增殖指数的比率是相似的。皮肤假性淋巴瘤属良 性淋巴增生性疾病，其细胞增殖指数和凋亡指数均明显低于其它恶性淋巴增生性疾病， 这与该病良性的临床生物学行为相一致。但是凋亡指数与增殖指数的比率在皮肤假性淋 巴瘤与斑块期MF以外的恶性淋巴瘤之间无差别，故这一比值在鉴别良恶性淋巴瘤方面无 价值。
, 百拇医药
部分斑块期MF(Ⅱ期)的皮损可自行消退，部分斑块期MF可进一步发展为肿瘤期MF(Ⅲ期 )[2]。Arends等[3]研究结果显示肿瘤细胞的凋亡可以引起肿瘤的消退。我们发现斑块期 MF的细胞凋亡指数明显高于本文研究的其他疾病，提示部分斑块期MF的皮损自发性消 退可能与肿瘤细胞凋亡有关。斑块期MF的增殖指数明显低于肿瘤期MF，提示细胞增殖 指数与皮肤淋巴瘤的恶性程度有关，这与Dummer等[4]的研究结果相同。由于斑块期MF的 细胞增殖指数比肿瘤期MF低，而凋亡指数比肿瘤期高，因此其凋亡指数与增殖指数的比 率比肿瘤期MF明显增高。肿瘤期MF的肿瘤细胞增殖活性比斑块期明显增高，而细胞凋 亡相对减少，提示其疾病的侵袭性有所增加，这与临床上肿瘤期MF的恶性程度比斑块期MF高相一致[5]。
细胞增殖指数在某些恶性肿瘤中可作为预后指标。但我们认为结合评价凋亡指数和增殖 指数可更全面地反映各种皮肤淋巴瘤的临床生物学行为，因为它反映的不仅仅是肿瘤细 胞的增殖部分，而且还有细胞的凋亡部分。本文结果提示结合研究凋亡指数、增殖指数 以及两者之间的比率对评估各种良恶性皮肤淋巴增生性疾病的临床生物学行为有一定的 意义。
, 百拇医药
参考文献
[1]Leoncini L, Del Vecchio MT, Mehga T, et al. Correlations between apoptotic and proliferative indices in malignant non-Hodgkin's lymphomas. Am J Pathol, 1993,142:755- 763.
[2]邱丙森.蕈样肉芽肿.见：杨国亮，王侠生，主编.现代皮肤病学.第1版.上海：上海医科大
学出版社，1996.1025-1029.
[3]Arends MJ, Willie AH. Apoptosis: mechanisms and roles in pathology. Int Rev Exp Pathol,1991, 32:223- 254.
, 百拇医药
[4]Dummer R, Michie SA, Kell D, et al. Expression of bcl- 2 protein and Ki- 67 nuclear proliferation antigen in benign and malignant cutaneous T- cell infiltrates. J Cutan Pathol, 1995,22:11- 17.
[5]Kikuchi A, Nishikawa T. Apoptotic and proliferating cells in cutaneous lymphoproliferative diseases. Arch Dermatol,1997,133:829- 833.
(收稿日期：1999-09-08), 百拇医药
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志000427
我们采用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的d-UTP-生物素缺口末端标记(TUNEL) 技术检测凋亡细胞，同时应用抗增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化法检测增殖细胞，研 究各种良恶性皮肤淋巴增生性疾病中细胞凋亡指数、增殖指数以及两者之间的比率，探 讨它们在皮肤淋巴增生性疾病中的意义。
一、材料和方法
1.标本：共51份良恶性皮肤淋巴增生性疾病的皮肤标本，男32例，女19例。包括10份斑 块期蕈样肉芽肿(MF)、10份肿瘤期MF、11份非MF和Sézary综合征的皮肤T细胞淋巴瘤( NCTCL)、10份皮肤B细胞淋巴瘤(CBCL)和10份皮肤假性淋巴瘤。所有标本均取自本所 病理科1992～1999年保存的石蜡包埋组织块。经临床、组织病理学和免疫组化结果证实诊 断。我们仅使用治疗前的皮肤标本作实验研究。
, http://www.100md.com
2.试剂：鼠抗人PCNA单克隆抗体购自Dako公司，ABC试剂盒购自Vector公司，凋亡检测试 剂盒购自华美公司。
3.TUNEL法检测凋亡细胞：主要步骤为，切片常规脱蜡水化；20μg/mL蛋白酶K室温消化 20min；0.3%过氧化氢甲醇溶液室温处理20min；加标记缓冲液室温15min；加TDT和生物素 -11-dUTP湿盒中37℃孵育60min；封闭液室温孵育20min，再加1∶50稀释的亲和素-辣根 过氧化物酶(Avidin-HRP)置湿盒中37℃孵育30min；最后加DAB显色液显色10min；苏木素 复染，常规封片，显微镜检查。以双蒸水代替TDT作阴性对照，DNAaseⅠ处理的切片作阳 性对照。细胞凋亡阳性结果为胞核染成棕黄色，根据染色结果分为阳性和阴性细胞。每 张切片选取10个高倍视野(×400)，计数1000个淋巴样细胞中的TUNEL阳性细胞，计算 凋亡指数(即每1000个细胞中TUNEL阳性细胞所占的百分比)。
4.免疫组化ABC方法检测PCNA：主要步骤为切片脱蜡水化，抗PCNA抗体(抗体稀释度 为1∶100)作为一抗，4℃孵育过夜，采用ABC试剂盒进行检测，DAB显色液显色，苏木 素复染，显微镜检查。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性的切片作阳性对照。 PCNA阳性结果为细胞核染成棕黄色，根据染色结果分为标记和未标记细胞，增殖指数的 计算方法同凋亡指数。
, 百拇医药
5.统计学分析：采用SPSS统计软件包进行数据统计，多组间均值的两两比较采用Tukey检 验。
二、结果
TUNEL阳性细胞代表凋亡细胞，PCNA阳性细胞代表增殖细胞。斑块期MF、肿瘤期MF、NCTCL及CBCL中的凋亡和增殖细胞 均为散在稀疏分布；皮肤假性淋巴瘤中则更为稀少。表1总结了各种良恶性皮肤淋巴增 生性疾病的凋亡指数、增殖指数以及两者之间的比率。凋亡指数：皮肤假性淋巴瘤的凋 亡指数明显低于各种恶性皮肤淋巴增生性疾病，经统计学分析，差异有显著性(P< 0.01)。斑块期MF的凋亡指数比肿瘤期MF及其它皮肤淋巴增生性疾病高(P<0.01)。
增殖指数：皮肤假性淋巴瘤的增殖指数明显低于MF、NCTCL和CBCL(P<0.01)。斑块期 MF的增殖指数比肿瘤期MF低(P<0.01)。
凋亡指数与增殖指数之间的比率：肿瘤期MF、NCTCL和CBCL几乎相同(0.2～0.3)，统计 学分析差异无显著性。但斑块期MF的凋亡和增殖指数的比率(0.683)明显高于肿瘤期 MF及其它皮肤淋巴增生性疾病(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 各种皮肤皮肤淋巴增生性疾病的凋永和增殖指数
组别
例数
凋亡指数(
±s)增殖指数(
±s)凋亡指数/增殖指数
斑块期MF
10
6.9±1.2
10.1±2.3
, 百拇医药
0.638
肿瘤MF
10
4.8±1.0
19.9±3.3
0.241
NCTCL
11
4.5±1.1
18.3±3.1
0.246
CBCL
10
, 百拇医药
3.9±1.1
16.4±2.4
0.238
皮肤假性淋巴瘤
10
0.8±0.3
3.5±0.5
0.229
三、讨论
Leoncini等[1]研究发现细胞凋亡指数与系统性非何杰金淋巴瘤的预后有关，但凋亡指数与 皮肤淋巴增生性疾病的关系研究不多。我们使用TUNEL技术研究各种良恶性皮肤淋巴增 生性疾病的凋亡指数，同时检测它们的细胞增殖指数。结果发现肿瘤期MF、NCTCL和 CBCL的凋亡指数、增殖指数以及凋亡与增殖指数的比率是相似的。皮肤假性淋巴瘤属良 性淋巴增生性疾病，其细胞增殖指数和凋亡指数均明显低于其它恶性淋巴增生性疾病， 这与该病良性的临床生物学行为相一致。但是凋亡指数与增殖指数的比率在皮肤假性淋 巴瘤与斑块期MF以外的恶性淋巴瘤之间无差别，故这一比值在鉴别良恶性淋巴瘤方面无 价值。
, 百拇医药
部分斑块期MF(Ⅱ期)的皮损可自行消退，部分斑块期MF可进一步发展为肿瘤期MF(Ⅲ期 )[2]。Arends等[3]研究结果显示肿瘤细胞的凋亡可以引起肿瘤的消退。我们发现斑块期 MF的细胞凋亡指数明显高于本文研究的其他疾病，提示部分斑块期MF的皮损自发性消 退可能与肿瘤细胞凋亡有关。斑块期MF的增殖指数明显低于肿瘤期MF，提示细胞增殖 指数与皮肤淋巴瘤的恶性程度有关，这与Dummer等[4]的研究结果相同。由于斑块期MF的 细胞增殖指数比肿瘤期MF低，而凋亡指数比肿瘤期高，因此其凋亡指数与增殖指数的比 率比肿瘤期MF明显增高。肿瘤期MF的肿瘤细胞增殖活性比斑块期明显增高，而细胞凋 亡相对减少，提示其疾病的侵袭性有所增加，这与临床上肿瘤期MF的恶性程度比斑块期MF高相一致[5]。
细胞增殖指数在某些恶性肿瘤中可作为预后指标。但我们认为结合评价凋亡指数和增殖 指数可更全面地反映各种皮肤淋巴瘤的临床生物学行为，因为它反映的不仅仅是肿瘤细 胞的增殖部分，而且还有细胞的凋亡部分。本文结果提示结合研究凋亡指数、增殖指数 以及两者之间的比率对评估各种良恶性皮肤淋巴增生性疾病的临床生物学行为有一定的 意义。
, 百拇医药
参考文献
[1]Leoncini L, Del Vecchio MT, Mehga T, et al. Correlations between apoptotic and proliferative indices in malignant non-Hodgkin's lymphomas. Am J Pathol, 1993,142:755- 763.
[2]邱丙森.蕈样肉芽肿.见：杨国亮，王侠生，主编.现代皮肤病学.第1版.上海：上海医科大
学出版社，1996.1025-1029.
[3]Arends MJ, Willie AH. Apoptosis: mechanisms and roles in pathology. Int Rev Exp Pathol,1991, 32:223- 254.
, 百拇医药
[4]Dummer R, Michie SA, Kell D, et al. Expression of bcl- 2 protein and Ki- 67 nuclear proliferation antigen in benign and malignant cutaneous T- cell infiltrates. J Cutan Pathol, 1995,22:11- 17.
[5]Kikuchi A, Nishikawa T. Apoptotic and proliferating cells in cutaneous lymphoproliferative diseases. Arch Dermatol,1997,133:829- 833.
(收稿日期：1999-09-08), 百拇医药