淋球菌对环丙沙星的耐药性及耐药机制的研究
作者：李珊山 刘鹤松 钟淑侠 张林 邢天蕴
单位：130021长春，白求恩医科大学第一临床学院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000423
自80年代以来，喹诺酮类药物在无合并症淋病的治疗中起了重要作用。然而，近年来随 着该药的广泛应用，淋球菌对其敏感性逐年降低。淋球菌对喹诺酮耐药性的产生主要与 gyrA基因点突变有关。为探讨淋球菌对环丙沙星的耐药机制，我们采用聚合酶链反应( PCR)和限制性片段分析，对56株淋球菌分离株进行环丙沙星敏感性测定和gyrA点突变的 检测，结果如下。
一、材料与方法
(一)菌株来源：56株淋球菌野生株取自1998～1999年我院性病门诊淋病患者。WHO参考 株A、B、C、D、E和环丙沙星标准品由中国医学科学院皮肤病研究所提供。
, 百拇医药
(二)gyrA的QRDR基因扩增及限制酶酶切：取各淋球菌分离株1个菌落形成单位，加裂解 液15μL，置65℃10min，95℃8min。15000r/min离心5min，上清液作为DNA模板。根据淋球 菌gyrA的QRDR合成引物[1,2]，正向链为5′-CGCG ATGCACGAGCTAAAAA-3′，反向链为 5′-CCGTCTATCAGCACATAACGCATAG CGAAATTTTGCGCCATACGGACGATGGAG -3′，扩增片段长度为165bp，其中在第91位丝氨酸密码子(Ser-91)处有一HinfΙ酶切 位点，而在95位天冬氨酸密码子(Asp-95)处无HinfΙ位点，反向链引物起始于Asp- 95附近，通过划线碱基A的置换，在Asp-95处人工产生第2个HinfΙ酶切位点。
PCR总体积为50μL，含10×PCR缓冲液5μL，dNTPs200μmol/L，引物各0.2μmol/L，模板5 μL，TaqDNA聚合酶1.5U。经94℃1min、52℃50s和72℃50s， 共35个循环。取PCR产物5μL，加HinfΙ5U，置37℃4h。酶切产物在3%琼脂糖凝胶中电 泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
二、结果
56株淋球菌临床株及参考株经PCR扩增，均产生165bp片段。用HinfΙ酶切PCR产物，参考 株产生96bp和54bp片段。3株临床株产生111bp和54bp片段，表明在Ser-91位点有突变，这 3株菌的MIC值分别为0.0125、0.5和0.5μg/mL。其余53株均未被HinfΙ酶切，表明在Ser-91和 Asp-95处均有突变。
三、讨论
据报道gyrA点突变，尤其是Ser-91和Asp-95密码子(相当于大肠杆菌的Ser-83和Asp- 87)的改变与淋球菌对喹诺酮敏感性降低密切相关，因此分析gyrA氨基酸的改变对于明 确喹诺酮耐药机制具有重要意义。然而，gyrA基因测序费时、昂贵，不适用于流行病学 研究。由于Ser-91含有一个HinfⅠ位点,故可用限制酶酶切检测其点突变,但Asp-95不含有 限制酶位点,常规方法难以检测其突变,本研究应用引物特异性限制位点修饰法在Asp- 95处引入一个碱基置换,产生一个人工的HinfⅠ位点,使Ser-91和Asp-95的突变可以同时检 测出来。56株淋球菌分离株在Ser-91处有突变，而95%的菌株在Ser-91和Asp-95处均有 突变，表明Ser-91或Asp-95的氨基酸取代可能使菌株对氟喹诺酮的敏感性下降。仅在 Ser-91位点突变的3个菌株MIC值不超过1μg/mL，提示单一位点突变多引起低度耐药，而 在53个双位点突变的菌株中，只有4株MIC值≤0.5μg/mL，其余均≥1μg/mL，且MIC≥4μ g/mL的菌株占77%，提示双位点突变多引起高度耐药。因此，筛查gyrA点突变对于预测喹 诺酮治疗淋病的效果可能具有一定的临床意义。
, 百拇医药
参考文献
[1]Deguchi T, Yasuda M, Nakano M, et al. Rapid detection of point mutations of the Neisseria gonorrhoeae gyrA gene associated with decreased susceptibilities to quinolones. J Clin Microbiol,1996,34:2255- 2258.
[2]Deguchi T, Yasuda M, Asano M, et al.DNA gyrase mutations in quinolone- resistant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother, 1995,39:561- 563.
(收稿日期：1999-10-15), 百拇医药
单位：130021长春，白求恩医科大学第一临床学院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000423
自80年代以来，喹诺酮类药物在无合并症淋病的治疗中起了重要作用。然而，近年来随 着该药的广泛应用，淋球菌对其敏感性逐年降低。淋球菌对喹诺酮耐药性的产生主要与 gyrA基因点突变有关。为探讨淋球菌对环丙沙星的耐药机制，我们采用聚合酶链反应( PCR)和限制性片段分析，对56株淋球菌分离株进行环丙沙星敏感性测定和gyrA点突变的 检测，结果如下。
一、材料与方法
(一)菌株来源：56株淋球菌野生株取自1998～1999年我院性病门诊淋病患者。WHO参考 株A、B、C、D、E和环丙沙星标准品由中国医学科学院皮肤病研究所提供。
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(二)gyrA的QRDR基因扩增及限制酶酶切：取各淋球菌分离株1个菌落形成单位，加裂解 液15μL，置65℃10min，95℃8min。15000r/min离心5min，上清液作为DNA模板。根据淋球 菌gyrA的QRDR合成引物[1,2]，正向链为5′-CGCG ATGCACGAGCTAAAAA-3′，反向链为 5′-CCGTCTATCAGCACATAACGCATAG CGAAATTTTGCGCCATACGGACGATGGAG -3′，扩增片段长度为165bp，其中在第91位丝氨酸密码子(Ser-91)处有一HinfΙ酶切 位点，而在95位天冬氨酸密码子(Asp-95)处无HinfΙ位点，反向链引物起始于Asp- 95附近，通过划线碱基A的置换，在Asp-95处人工产生第2个HinfΙ酶切位点。
PCR总体积为50μL，含10×PCR缓冲液5μL，dNTPs200μmol/L，引物各0.2μmol/L，模板5 μL，TaqDNA聚合酶1.5U。经94℃1min、52℃50s和72℃50s， 共35个循环。取PCR产物5μL，加HinfΙ5U，置37℃4h。酶切产物在3%琼脂糖凝胶中电 泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。
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二、结果
56株淋球菌临床株及参考株经PCR扩增，均产生165bp片段。用HinfΙ酶切PCR产物，参考 株产生96bp和54bp片段。3株临床株产生111bp和54bp片段，表明在Ser-91位点有突变，这 3株菌的MIC值分别为0.0125、0.5和0.5μg/mL。其余53株均未被HinfΙ酶切，表明在Ser-91和 Asp-95处均有突变。
三、讨论
据报道gyrA点突变，尤其是Ser-91和Asp-95密码子(相当于大肠杆菌的Ser-83和Asp- 87)的改变与淋球菌对喹诺酮敏感性降低密切相关，因此分析gyrA氨基酸的改变对于明 确喹诺酮耐药机制具有重要意义。然而，gyrA基因测序费时、昂贵，不适用于流行病学 研究。由于Ser-91含有一个HinfⅠ位点,故可用限制酶酶切检测其点突变,但Asp-95不含有 限制酶位点,常规方法难以检测其突变,本研究应用引物特异性限制位点修饰法在Asp- 95处引入一个碱基置换,产生一个人工的HinfⅠ位点,使Ser-91和Asp-95的突变可以同时检 测出来。56株淋球菌分离株在Ser-91处有突变，而95%的菌株在Ser-91和Asp-95处均有 突变，表明Ser-91或Asp-95的氨基酸取代可能使菌株对氟喹诺酮的敏感性下降。仅在 Ser-91位点突变的3个菌株MIC值不超过1μg/mL，提示单一位点突变多引起低度耐药，而 在53个双位点突变的菌株中，只有4株MIC值≤0.5μg/mL，其余均≥1μg/mL，且MIC≥4μ g/mL的菌株占77%，提示双位点突变多引起高度耐药。因此，筛查gyrA点突变对于预测喹 诺酮治疗淋病的效果可能具有一定的临床意义。
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参考文献
[1]Deguchi T, Yasuda M, Nakano M, et al. Rapid detection of point mutations of the Neisseria gonorrhoeae gyrA gene associated with decreased susceptibilities to quinolones. J Clin Microbiol,1996,34:2255- 2258.
[2]Deguchi T, Yasuda M, Asano M, et al.DNA gyrase mutations in quinolone- resistant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother, 1995,39:561- 563.
(收稿日期：1999-10-15), 百拇医药