人中性粒细胞防御素对念珠菌的抗菌活性研究
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中华皮肤科杂志 2000年第5期第33卷
作者：蒋献 冉玉平 吴琦 黄宁 王伯瑶 周光平
单位：蒋献 冉玉平 周光平(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)；吴琦 黄宁 王伯瑶(华西医科大学基础医学院感染免疫研究室)
关键词：人中性粒细胞防御素；念珠菌属；抗菌活性
中华皮肤科杂志000505
【摘要】目的探讨防御素在机体抗念珠菌中的作用及其抗菌机制。方法用5%乙酸提取人中性粒细胞中的酸溶性成分，采用凝胶过滤层析获得人中性粒细胞防御素(humanneutrophilpeptide，HNP)，检测HNP对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌等5株念珠菌的抗菌活性。同时用电镜观察防御素作用后念珠菌的超微结构变化。结果采用SephadexG100及BiogelP10凝胶过滤层析可获得纯化的HNP。HNP对白念珠菌M1012R、NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌等菌有抗菌活性，其活性随防御素浓度升高而增强。电镜观察见防御素作用后的念珠菌表面有明显的凹陷和穿孔，胞膜与胞壁分离及空泡形成等改变。结论HNP对念珠菌有较强的抗菌活性。
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In Vitro Antifungal Activity of Defensin from Human Neutrophils Against Some Candida spp.
JIANG Xian，RAN Yuping，WU Qi，et al.
(Dermato- Venereology Department, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
【Abstract】 Objective To investigate the role and mechanism of defensin from human neutrophilic granulocytes against some Candida spp. Methods Human neutrophil peptide(HNP) were isolated and purified by using gel filtration chromatography. The antifungal activity of HNP against Candida albicans M1012R, NIH A- 207, Candida tropicalis, Candida kefyr, and Candida guilliermondii was tested. The above fungi were observed under electron microscope after exposing to HNP. Results HNP was succesfully isolated and purified by Sephadex G100 and Bio- gel P10 gel filtration chromatography, and concentration- dependent candidcidal activity to Candida albicans M1012R, NIH A- 207, Candida kefyr, Candida tropicalis, and Candida guilliermondii of HNP was demonstreated in vitro. After exposing to HNP the Candida spp. were examined by electron microscope, profound cell wall changes such as cell surface collapse and perforation were noted,the separation of cell membrane from cell wall and formation of vacuole were also observed. Conclusion Human neutrophil peptide exerted potent antifungal activity against some Candida spp.
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【 Key words】 Human neutrophil peptide Candida Activity, antifungal
在哺乳动物防御致病微生物感染的全过程中，防御素起着十分重要的作用。防御素是一类内源性抗生素肽类分子，具广谱抗微生物活性，对多种微生物均具很强的杀伤活性,能有效地杀灭真菌、革兰阳性和阴性细菌，并能灭活某些病毒，对肿瘤细胞也有细胞毒性[1,2]。防御素是吞噬细胞不依赖氧(Oxygen-independentmechanism)杀菌作用的主要组成部分。
有研究[3,4]表明从家兔及人中性粒细胞分离出的防御素能有效杀灭白念珠菌(Candidaalbicans)和新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)。但防御素对其它致病念珠菌(包括引起皮肤真菌感染的念珠菌)是否亦有抗菌活性，迄今尚未见有更多的文献报道。本研究采用SephadexG100及BiogelP10凝胶过滤层析法对人中性粒细胞防御素加以纯化，检测了人中性粒细胞防御素(humanneutrophilpeptide)对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌等5株念珠菌的抗菌活性，以探讨防御素在机体抗致病念珠菌中的作用，并可能为防御素在皮肤真菌病临床治疗中的应用提供实验依据。
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材料和方法
一、实验材料
1.SephadexG100为Pharmacia产品，BiogelP10为Biorad产品。
2.念珠菌菌株：共4种5株菌，分别为白念珠菌M1012R、NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌，其中白念珠菌M1012R、NIHA-207系标准菌株，其余菌株系我科真菌实验室的保存菌株(购自北京大学医学真菌研究中心)。
3.常用试剂配方：沙堡液体培养基：1%蛋白胨、4%葡萄糖、0.05%放线菌酮、0.025%氯霉素。底层琼脂：1%琼脂糖、1%沙堡固体培养基、10mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)。2×营养琼脂：1%琼脂糖、2%蛋白胨、8%葡萄糖。
二、实验方法
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1.人中性粒细胞防御素的制备：参照吴琦等[5]的方法进行。
2.防御素抗念珠菌实验：菌株及防御素样品：取对数生长期念珠菌，PBS洗涤，用血球计数板计数后调整菌数至2×107个/mL。人中性粒细胞防御素用0.01%乙酸稀释成62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL等浓度。
琼脂糖弥散法抗菌实验：在10mL底层琼脂中加入对数生长期念珠菌(念珠菌终浓度为105个/mL)，混匀后倾入方形塑料平皿(Falcon产品)，在底层琼脂上打孔(直径3mm)，每孔加入5μL不同浓度防御素，阴性对照孔加入0.01%乙酸。将平皿倒置放入孵箱内，3h后在底层琼脂上覆盖一层2×营养琼脂，倒置，37℃过夜孵育。每一菌株同时作3个平皿。
美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗菌实验：取对数生长期念珠菌50μL，加入等体积不同浓度的人中性粒细胞防御素，对照管则加0.01mol/LPBS，于37℃恒温水浴3h。以0.02%美蓝染色3min后，镜检菌体呈深蓝色的为死菌，不着色的为活菌。计数300个菌中的死菌及活菌数，算出念珠菌的死亡率。抗菌实验重复3次。
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防御素作用后的电镜观察：实验管每管加入人中性粒细胞防御素(250μg/mL)和念珠菌(107个/mL)各0.1mL，对照管加入0.01mol/LPBS和念珠菌(107个/mL)各0.1mL，37℃恒温水浴3h后用2.5%戊二醛固定，常规方法处理标本后在扫描电镜(AMRAY1000-B型)及透射电镜(JEM-100SX型)下观察并照相。
结果
一、人中性粒细胞防御素
采用SephadexG100及BiogelP10凝胶过滤层析可获得纯化的人中性粒细胞防御素。
二、琼脂糖弥散法抗菌实验结果
琼脂糖弥散法显示人中性粒细胞防御素对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌均有抗菌活性。在实验孔中每孔加入0.312μg(62.5μg/mL×5μL)人中性粒细胞防御素时即对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌显示显著抗菌活性，随着每孔加入人中性粒细胞防御素的增多，抗菌环直径增大。5株念珠菌对人中性粒细胞防御素的敏感性依次为季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌、白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、热带念珠菌。
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三、美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗菌实验结果
选择对人中性粒细胞防御素敏感性高的白念珠菌M1012R、乳酒念珠菌、季也蒙念珠菌用美蓝染色法作体外抗菌实验，菌浓度为107个/mL。各菌株实验结果见图1～3。抗菌实验重复3次。每次计数300个菌中死菌数，求出3次实验死菌数的均数和标准差，结果见表1。
表1美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素杀菌活性
防御素浓度(μg/mL)
0
1.7±0.9
1.0±0.4
1.3±0.8
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74.0±4.9
86.6±9.2
87.6±6.3
125
84.0±4.9
91.6±9.2
93.0±6.3
250
86.6±2.7
93.3±4.7
95.0±6.3
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500
90.0±1.0
96.6±1.3
97.3±6.3
1000
94.6±0.3
100±0.0
98.3±9.0
四、经防御素作用后的念珠菌电镜观察结果
1.扫描电镜观察结果：由图4可见，人中性粒细胞防御素(250μg/mL)作用后的念珠菌与对照组比较，念珠菌菌体表面可见明显的凹陷及穿孔。白念珠菌M1012R和乳酒念珠菌菌体表面可见大小不一的凹陷，季也蒙念珠菌菌体表面可见穿孔。
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2.透射电镜观察结果：由图5可见，人中性粒细胞防御素(250μg/mL)作用后的念珠菌与对照组比较，念珠菌菌体断面结构不清晰，细胞内成分固缩成电子密度较高的团块，其间有大片空白，胞膜不连续，胞膜与胞壁分离。
讨论
吞噬细胞、粘膜表面及体液中的内源性抗菌分子(蛋白或多肽)是机体免疫防御的重要组成部分，寻找和鉴定这些抗菌分子不仅有助于深入了解和阐明正常的免疫功能，也必将推动感染性疾病的病因及防治研究。由于多数抗菌分子在体内的含量少，难以获得大量样品，因此，建立微量而敏感的抗菌实验方法在内源性抗菌分子的研究中显得极为重要。本研究表明琼脂糖弥散法抗菌实验具有灵敏度高，样品用量少，操作简便，并可同时检测多个样品等优点。在用琼脂糖弥散法分析了防御素对5株念珠菌的抗菌活性后，选择其中3株最敏感的菌株，进一步采用美蓝染色法检测了人中性粒细胞防御素对它们的抗菌作用，实验表明这两种方法所得的结果是一致的。利用美蓝染色法观察防御素的抗菌作用，方法简便，结果直观。两种实验方法均证实了人中性粒细胞防御素对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌5株念珠菌的抗菌活性，其中防御素对乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌的抗菌活为国际上首次报道。提示防御素在皮肤真菌感染性疾病临床应用中的潜在价值，值得进一步探索。
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图1美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗白念珠菌M1012R实验结果(0.02%美蓝染色，×400)，a:对照组白念珠菌M1012R，菌体不着色为活菌b:经人中性粒细胞防御素作用3h后的白念珠菌M1012R，菌体呈深蓝色为死菌
图2美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗乳酒念珠菌实验结果(0.02%美蓝染色，×400)2a:对照组乳酒念珠菌，菌体不着色为活菌2b:经人中性粒细胞防御素作用3h后的乳酒念珠菌，菌体呈深蓝色为死菌
图3美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗季也蒙念珠菌实验结果(0.02%美蓝染色，×400)，3a:对照组季也蒙念珠菌，菌体不着色为活菌3b:经人中性粒细胞防御素作用3h后的季也蒙念珠菌，菌体呈深蓝色为死菌
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图4经人中性粒细胞防御素作用3h后的念珠菌扫描
电镜观察结果(×5000)
图5经人中性粒细胞防御素作用3h后的念珠菌透射
电镜观察结果(×15000)
本研究发现，防御素作用后的念珠菌，在扫描电镜下可见菌体表面有明显的凹陷及穿孔，透射电镜下可见胞膜不连续，提示防御素的作用机制和靶细胞膜密切相关。有研究表明防御素只对有包膜的病毒起作用，且防御素是通过使靶细胞膜的通透性发生改变而发挥其抗菌活性的[6]。Lehrer等[7]的初步实验提示，白念珠菌表面有防御素的特异性结合位点，防御素粘附于白念珠菌胞壁上，可能通过使胞壁渗透性增加而致菌体死亡。利用人工脂质膜的实验显示防御素可能于膜上形成稳定的通道，尽管防御素分子太小而不能以单聚体的形式造成膜穿孔，但分子结构和电生理研究提示防御素分子能以多聚体的形式作用于胞膜，有学者[8]提出了由6个防御素分子的同源二聚体组成一个穿孔环的模型。精确的抗菌机理有待进一步研究。
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本课题部分由四川省卫生厅科研基金资助(962019)
参考文献
[1]Ogata K, Linzer BA, Zuberi RI, et al. Activity of defensins from human neutrophilic granulocytes against Mycobacterium avium- Mycobacterium intracellulare. Infect Immun， 1992， 60:4720- 4725.
[2]Selsted ME, Szklarek D,Lehrer RI. Purification and antibacterial activity of antimicrobial peptides of rabbit granulocytes. Infect Immun， 1984， 45: 150- 154.
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[3]Lehrer RI, Ganz T, Szklarek D, et al. Modulation of the in vitro candidacidal activity of human neutrophil defensins by target cell metabolism and divalent cations. J Clin Invest， 1988， 81:1829- 1835.
[4]Alcouloumre MS, Ghannoum MA, Ibrahim AS, et al. Fungicidal properties of defensin NP- 1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro. Antimicrob Agents Chemother， 1993， 37:2628- 2632.
[5]吴琦，徐罗玲，王伯瑶，等.人中性粒细胞防御素的分离纯化.中国免疫学杂志，1993，9:106-109.
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[6]Lehrer RI, Szklarek D.Mechanisms of microbicidal activity by defensins. Clin Res， 1987， 35:616- 619.
[7]Lehrer RI, Szklarek D, Ganz T, et al. Correlation of binding of rabbit granulocyte peptides to Candida albicans with candidacidal activity. Infect Immun， 1985， 49:207- 211.
[8]Wimley WC, Selsted ME, White SH. Interactions between human defensins and lipid bilayers: Evidence for formation of multimeric pores. Protein Sci， 1994,3:1362- 1373.
(收稿日期：2000-01-17), http://www.100md.com
单位：蒋献 冉玉平 周光平(610041成都，华西医科大学附属第一医院皮肤性病科)；吴琦 黄宁 王伯瑶(华西医科大学基础医学院感染免疫研究室)
关键词：人中性粒细胞防御素；念珠菌属；抗菌活性
中华皮肤科杂志000505
【摘要】目的探讨防御素在机体抗念珠菌中的作用及其抗菌机制。方法用5%乙酸提取人中性粒细胞中的酸溶性成分，采用凝胶过滤层析获得人中性粒细胞防御素(humanneutrophilpeptide，HNP)，检测HNP对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌等5株念珠菌的抗菌活性。同时用电镜观察防御素作用后念珠菌的超微结构变化。结果采用SephadexG100及BiogelP10凝胶过滤层析可获得纯化的HNP。HNP对白念珠菌M1012R、NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌等菌有抗菌活性，其活性随防御素浓度升高而增强。电镜观察见防御素作用后的念珠菌表面有明显的凹陷和穿孔，胞膜与胞壁分离及空泡形成等改变。结论HNP对念珠菌有较强的抗菌活性。
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In Vitro Antifungal Activity of Defensin from Human Neutrophils Against Some Candida spp.
JIANG Xian，RAN Yuping，WU Qi，et al.
(Dermato- Venereology Department, First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
【Abstract】 Objective To investigate the role and mechanism of defensin from human neutrophilic granulocytes against some Candida spp. Methods Human neutrophil peptide(HNP) were isolated and purified by using gel filtration chromatography. The antifungal activity of HNP against Candida albicans M1012R, NIH A- 207, Candida tropicalis, Candida kefyr, and Candida guilliermondii was tested. The above fungi were observed under electron microscope after exposing to HNP. Results HNP was succesfully isolated and purified by Sephadex G100 and Bio- gel P10 gel filtration chromatography, and concentration- dependent candidcidal activity to Candida albicans M1012R, NIH A- 207, Candida kefyr, Candida tropicalis, and Candida guilliermondii of HNP was demonstreated in vitro. After exposing to HNP the Candida spp. were examined by electron microscope, profound cell wall changes such as cell surface collapse and perforation were noted,the separation of cell membrane from cell wall and formation of vacuole were also observed. Conclusion Human neutrophil peptide exerted potent antifungal activity against some Candida spp.
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【 Key words】 Human neutrophil peptide Candida Activity, antifungal
在哺乳动物防御致病微生物感染的全过程中，防御素起着十分重要的作用。防御素是一类内源性抗生素肽类分子，具广谱抗微生物活性，对多种微生物均具很强的杀伤活性,能有效地杀灭真菌、革兰阳性和阴性细菌，并能灭活某些病毒，对肿瘤细胞也有细胞毒性[1,2]。防御素是吞噬细胞不依赖氧(Oxygen-independentmechanism)杀菌作用的主要组成部分。
有研究[3,4]表明从家兔及人中性粒细胞分离出的防御素能有效杀灭白念珠菌(Candidaalbicans)和新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)。但防御素对其它致病念珠菌(包括引起皮肤真菌感染的念珠菌)是否亦有抗菌活性，迄今尚未见有更多的文献报道。本研究采用SephadexG100及BiogelP10凝胶过滤层析法对人中性粒细胞防御素加以纯化，检测了人中性粒细胞防御素(humanneutrophilpeptide)对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌等5株念珠菌的抗菌活性，以探讨防御素在机体抗致病念珠菌中的作用，并可能为防御素在皮肤真菌病临床治疗中的应用提供实验依据。
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材料和方法
一、实验材料
1.SephadexG100为Pharmacia产品，BiogelP10为Biorad产品。
2.念珠菌菌株：共4种5株菌，分别为白念珠菌M1012R、NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌，其中白念珠菌M1012R、NIHA-207系标准菌株，其余菌株系我科真菌实验室的保存菌株(购自北京大学医学真菌研究中心)。
3.常用试剂配方：沙堡液体培养基：1%蛋白胨、4%葡萄糖、0.05%放线菌酮、0.025%氯霉素。底层琼脂：1%琼脂糖、1%沙堡固体培养基、10mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)。2×营养琼脂：1%琼脂糖、2%蛋白胨、8%葡萄糖。
二、实验方法
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1.人中性粒细胞防御素的制备：参照吴琦等[5]的方法进行。
2.防御素抗念珠菌实验：菌株及防御素样品：取对数生长期念珠菌，PBS洗涤，用血球计数板计数后调整菌数至2×107个/mL。人中性粒细胞防御素用0.01%乙酸稀释成62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL等浓度。
琼脂糖弥散法抗菌实验：在10mL底层琼脂中加入对数生长期念珠菌(念珠菌终浓度为105个/mL)，混匀后倾入方形塑料平皿(Falcon产品)，在底层琼脂上打孔(直径3mm)，每孔加入5μL不同浓度防御素，阴性对照孔加入0.01%乙酸。将平皿倒置放入孵箱内，3h后在底层琼脂上覆盖一层2×营养琼脂，倒置，37℃过夜孵育。每一菌株同时作3个平皿。
美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗菌实验：取对数生长期念珠菌50μL，加入等体积不同浓度的人中性粒细胞防御素，对照管则加0.01mol/LPBS，于37℃恒温水浴3h。以0.02%美蓝染色3min后，镜检菌体呈深蓝色的为死菌，不着色的为活菌。计数300个菌中的死菌及活菌数，算出念珠菌的死亡率。抗菌实验重复3次。
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防御素作用后的电镜观察：实验管每管加入人中性粒细胞防御素(250μg/mL)和念珠菌(107个/mL)各0.1mL，对照管加入0.01mol/LPBS和念珠菌(107个/mL)各0.1mL，37℃恒温水浴3h后用2.5%戊二醛固定，常规方法处理标本后在扫描电镜(AMRAY1000-B型)及透射电镜(JEM-100SX型)下观察并照相。
结果
一、人中性粒细胞防御素
采用SephadexG100及BiogelP10凝胶过滤层析可获得纯化的人中性粒细胞防御素。
二、琼脂糖弥散法抗菌实验结果
琼脂糖弥散法显示人中性粒细胞防御素对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌均有抗菌活性。在实验孔中每孔加入0.312μg(62.5μg/mL×5μL)人中性粒细胞防御素时即对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌显示显著抗菌活性，随着每孔加入人中性粒细胞防御素的增多，抗菌环直径增大。5株念珠菌对人中性粒细胞防御素的敏感性依次为季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌、白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、热带念珠菌。
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三、美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗菌实验结果
选择对人中性粒细胞防御素敏感性高的白念珠菌M1012R、乳酒念珠菌、季也蒙念珠菌用美蓝染色法作体外抗菌实验，菌浓度为107个/mL。各菌株实验结果见图1～3。抗菌实验重复3次。每次计数300个菌中死菌数，求出3次实验死菌数的均数和标准差，结果见表1。
表1美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素杀菌活性
防御素浓度(μg/mL)
0
1.7±0.9
1.0±0.4
1.3±0.8
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74.0±4.9
86.6±9.2
87.6±6.3
125
84.0±4.9
91.6±9.2
93.0±6.3
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86.6±2.7
93.3±4.7
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90.0±1.0
96.6±1.3
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1000
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100±0.0
98.3±9.0
四、经防御素作用后的念珠菌电镜观察结果
1.扫描电镜观察结果：由图4可见，人中性粒细胞防御素(250μg/mL)作用后的念珠菌与对照组比较，念珠菌菌体表面可见明显的凹陷及穿孔。白念珠菌M1012R和乳酒念珠菌菌体表面可见大小不一的凹陷，季也蒙念珠菌菌体表面可见穿孔。
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2.透射电镜观察结果：由图5可见，人中性粒细胞防御素(250μg/mL)作用后的念珠菌与对照组比较，念珠菌菌体断面结构不清晰，细胞内成分固缩成电子密度较高的团块，其间有大片空白，胞膜不连续，胞膜与胞壁分离。
讨论
吞噬细胞、粘膜表面及体液中的内源性抗菌分子(蛋白或多肽)是机体免疫防御的重要组成部分，寻找和鉴定这些抗菌分子不仅有助于深入了解和阐明正常的免疫功能，也必将推动感染性疾病的病因及防治研究。由于多数抗菌分子在体内的含量少，难以获得大量样品，因此，建立微量而敏感的抗菌实验方法在内源性抗菌分子的研究中显得极为重要。本研究表明琼脂糖弥散法抗菌实验具有灵敏度高，样品用量少，操作简便，并可同时检测多个样品等优点。在用琼脂糖弥散法分析了防御素对5株念珠菌的抗菌活性后，选择其中3株最敏感的菌株，进一步采用美蓝染色法检测了人中性粒细胞防御素对它们的抗菌作用，实验表明这两种方法所得的结果是一致的。利用美蓝染色法观察防御素的抗菌作用，方法简便，结果直观。两种实验方法均证实了人中性粒细胞防御素对白念珠菌M1012R、白念珠菌NIHA-207、乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌5株念珠菌的抗菌活性，其中防御素对乳酒念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌的抗菌活为国际上首次报道。提示防御素在皮肤真菌感染性疾病临床应用中的潜在价值，值得进一步探索。
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图1美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗白念珠菌M1012R实验结果(0.02%美蓝染色，×400)，a:对照组白念珠菌M1012R，菌体不着色为活菌b:经人中性粒细胞防御素作用3h后的白念珠菌M1012R，菌体呈深蓝色为死菌
图2美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗乳酒念珠菌实验结果(0.02%美蓝染色，×400)2a:对照组乳酒念珠菌，菌体不着色为活菌2b:经人中性粒细胞防御素作用3h后的乳酒念珠菌，菌体呈深蓝色为死菌
图3美蓝染色法测定人中性粒细胞防御素抗季也蒙念珠菌实验结果(0.02%美蓝染色，×400)，3a:对照组季也蒙念珠菌，菌体不着色为活菌3b:经人中性粒细胞防御素作用3h后的季也蒙念珠菌，菌体呈深蓝色为死菌
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图4经人中性粒细胞防御素作用3h后的念珠菌扫描
电镜观察结果(×5000)
图5经人中性粒细胞防御素作用3h后的念珠菌透射
电镜观察结果(×15000)
本研究发现，防御素作用后的念珠菌，在扫描电镜下可见菌体表面有明显的凹陷及穿孔，透射电镜下可见胞膜不连续，提示防御素的作用机制和靶细胞膜密切相关。有研究表明防御素只对有包膜的病毒起作用，且防御素是通过使靶细胞膜的通透性发生改变而发挥其抗菌活性的[6]。Lehrer等[7]的初步实验提示，白念珠菌表面有防御素的特异性结合位点，防御素粘附于白念珠菌胞壁上，可能通过使胞壁渗透性增加而致菌体死亡。利用人工脂质膜的实验显示防御素可能于膜上形成稳定的通道，尽管防御素分子太小而不能以单聚体的形式造成膜穿孔，但分子结构和电生理研究提示防御素分子能以多聚体的形式作用于胞膜，有学者[8]提出了由6个防御素分子的同源二聚体组成一个穿孔环的模型。精确的抗菌机理有待进一步研究。
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本课题部分由四川省卫生厅科研基金资助(962019)
参考文献
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(收稿日期：2000-01-17), http://www.100md.com