链球菌抗原刺激的银屑病患者外周血单一核细胞培养上清液中TNF－α和IL－6的检测
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中华皮肤科杂志 2000年第5期第33卷
作者：张理涛 吕克己 高兴华 陈学荣 殷金珠 陈洪铎
单位：张理涛 高兴华 陈洪铎(110001沈阳,中国医科大学第一临床医院皮肤科)；吕克己(北京大学第三医院皮肤科)；陈学荣(北京大学第三医院皮肤科)；殷金珠(临床免疫室)
关键词：
中华皮肤科杂志000522
以往的研究表明[1],银屑病患者外周血单一核细胞(PBMC)对链球菌抗原刺激反应明显;而且,链球菌抗原刺激PBMC的培养上清液可促进人角质形成细胞DNA合成和细胞间粘附因子1(ICMA-1)、HLA-DR分子表达。说明培养上清液中的细胞因子发生了质或量的变化。为此，我们进一步检测了银屑病患者链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)变化。期望有助于探讨银屑病的发病机制。
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表1银屑病患者PBMC培养上清液中TNF-α和IL-6的检测结果
组别
例数
TNF-α活性(细胞死亡%)
IL-6活性(A值)
链球菌刺激*
PHA刺激**
PHA刺激
链球菌刺激
对照组
8
17.57±5.85
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28.66±18.39
0.686±0.202
0.436±0.038
银屑病组
12
11.47±5.78△
22.37±14.16
0.766±0.212
0.645±0.110△
注：*链球菌刺激的PBMC培养上清液，**PHA刺激的PBMC培养上清液，△与对照组比较，P<0.05
一、材料和方法
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(一)临床资料：临床和病理确诊的点滴状银屑病患者7例、斑块状5例；健康对照8例。点滴状病例多为初发,其中6例有上呼吸道感染病史；年龄17～39岁；病程1周至2年。斑块状患者年龄17～57岁；病程6个月至20年；所有患者至少1个月内未接受皮质类固醇及其他免疫抑制剂治疗。
(二)方法：
1.细胞:鼠纤维肉瘤细胞株WEHI-164、IL-6依赖细胞株7TD-1,来自北京大学临床免疫室。
2.细菌:β溶血型链球菌菌株,北京大学微生物教研室提供。
3.β溶血型链球菌的培养、收获及定量:见文献[1]。
4.各组PBMC24h培养上清液的收获及贮存见文献[1]。
, 百拇医药
5.结晶紫比色法检测PBMC培养上清液中TNF-α改变[2]:生长良好的WEHI-164细胞,用PRMI-1640配成5×105/mL细胞悬液。每孔100μL加入96孔板;分银屑病和对照组加入PHA和链球菌刺激的PBMC培养上清液,每孔100μL;37℃,体积分数5%CO2条件下24h;弃上清液,PBS洗1次;每孔加入0.5%结晶紫200μL,30min;弃结晶紫,用蒸馏水洗6～8次;每孔加入冰醋酸水溶液120μL振荡3min,测波长570nm处A值。TNF-α活性以细胞死亡百分比表示。细胞死亡百分比=[1-(实验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)]×100%,其中对照组为未加PBMC培养上清液者。
6.MTT法检测PBMC培养上清液中IL-6改变[2]:7TD-1细胞配成1×105/mL细胞悬液;每孔100μL加入96孔板;同时加入各组PBMC培养上清液,每孔20μL;再加入PRMI-1640培养基80μL/孔;
, 百拇医药
37℃,体积分数5%CO2条件下48h;培养结束前4h,每孔加入MTT50μL(5mg/mL);继续培养4h,离心弃上清液;加入盐酸异丙醇(1∶300)120μL/孔,测波长570nm处A值。以各组A值比较PBMC培养上清液中IL-6活性。
(三)统计学处理:用SPSS软件作组间t检验。
二、结果
链球菌抗原刺激的银屑病患者PBMC培养上清液中TNF-α水平下降(与健康对照比较，P<0.05)、IL-6水平升高(与对照组比较，P<0.05);而PHA刺激的PBMC培养上清液中各组TNF-α和IL-6水平两组比较差异无显著性。见表1。
三、讨论
TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生,活化的角质形成细胞也可以产生[3]。由于许多实验证明TNF-α体外可以明显抑制表皮细胞增殖[4],所以银屑病患者PBMC的链球菌抗原刺激培养上清液中TNF-α活性降低可能对疾病的发展有意义。银屑病患者在一定条件下,不能有效足量地产生抑制角质形成细胞增殖的TNF-α,可能是银屑病角质形成细胞过度增殖的原因之一。至于出现TNF-α活性下降的原因,除遗传因素导致PBMC功能缺陷之外,有可能链球菌抗原或超抗原只作用于T淋巴细胞，而对单核/巨噬细胞少有影响。本实验的另一个发现是链球菌抗原刺激的银屑病PBMC培养上清液中IL-6水平升高,从一个侧面证实了银屑病患者链球菌反应性T淋巴细胞的存在,有可能受链球菌抗原刺激活化的T淋巴细胞是IL-6的主要来源。
, 百拇医药
参考文献
[1]张理涛，陈学荣，殷金珠.β溶血型链球菌诱发点滴型银屑病发病机制的研究.中华皮肤科杂志，1999，32:99-100.
[2]钱玉昆,殷金珠.实用免疫学新技术.第1版.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1994.53-55.
[3] Kock A, Schwarz T, Kirnbauer R,et al. Human keratinocytes are a source for tumor necrosis factor alpha: Evidence for synthesis and release upon stimulation with endotoxin or ultraviolet light. J Exp Med， 1990， 172:1609- 1614.
[4] Kono T, Tanii T, Furukawa M, et al. Effect of human recombinant tumor necrosis alpha(TNF- alpha) on the proliferation potential of human keratinocytes cultured in serum- free medium. J Dermatol， 1990,17:409- 413.
(收稿日期：1999-11-09), 百拇医药
单位：张理涛 高兴华 陈洪铎(110001沈阳,中国医科大学第一临床医院皮肤科)；吕克己(北京大学第三医院皮肤科)；陈学荣(北京大学第三医院皮肤科)；殷金珠(临床免疫室)
关键词：
中华皮肤科杂志000522
以往的研究表明[1],银屑病患者外周血单一核细胞(PBMC)对链球菌抗原刺激反应明显;而且,链球菌抗原刺激PBMC的培养上清液可促进人角质形成细胞DNA合成和细胞间粘附因子1(ICMA-1)、HLA-DR分子表达。说明培养上清液中的细胞因子发生了质或量的变化。为此，我们进一步检测了银屑病患者链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)变化。期望有助于探讨银屑病的发病机制。
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表1银屑病患者PBMC培养上清液中TNF-α和IL-6的检测结果
组别
例数
TNF-α活性(细胞死亡%)
IL-6活性(A值)
链球菌刺激*
PHA刺激**
PHA刺激
链球菌刺激
对照组
8
17.57±5.85
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28.66±18.39
0.686±0.202
0.436±0.038
银屑病组
12
11.47±5.78△
22.37±14.16
0.766±0.212
0.645±0.110△
注：*链球菌刺激的PBMC培养上清液，**PHA刺激的PBMC培养上清液，△与对照组比较，P<0.05
一、材料和方法
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(一)临床资料：临床和病理确诊的点滴状银屑病患者7例、斑块状5例；健康对照8例。点滴状病例多为初发,其中6例有上呼吸道感染病史；年龄17～39岁；病程1周至2年。斑块状患者年龄17～57岁；病程6个月至20年；所有患者至少1个月内未接受皮质类固醇及其他免疫抑制剂治疗。
(二)方法：
1.细胞:鼠纤维肉瘤细胞株WEHI-164、IL-6依赖细胞株7TD-1,来自北京大学临床免疫室。
2.细菌:β溶血型链球菌菌株,北京大学微生物教研室提供。
3.β溶血型链球菌的培养、收获及定量:见文献[1]。
4.各组PBMC24h培养上清液的收获及贮存见文献[1]。
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5.结晶紫比色法检测PBMC培养上清液中TNF-α改变[2]:生长良好的WEHI-164细胞,用PRMI-1640配成5×105/mL细胞悬液。每孔100μL加入96孔板;分银屑病和对照组加入PHA和链球菌刺激的PBMC培养上清液,每孔100μL;37℃,体积分数5%CO2条件下24h;弃上清液,PBS洗1次;每孔加入0.5%结晶紫200μL,30min;弃结晶紫,用蒸馏水洗6～8次;每孔加入冰醋酸水溶液120μL振荡3min,测波长570nm处A值。TNF-α活性以细胞死亡百分比表示。细胞死亡百分比=[1-(实验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)]×100%,其中对照组为未加PBMC培养上清液者。
6.MTT法检测PBMC培养上清液中IL-6改变[2]:7TD-1细胞配成1×105/mL细胞悬液;每孔100μL加入96孔板;同时加入各组PBMC培养上清液,每孔20μL;再加入PRMI-1640培养基80μL/孔;
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37℃,体积分数5%CO2条件下48h;培养结束前4h,每孔加入MTT50μL(5mg/mL);继续培养4h,离心弃上清液;加入盐酸异丙醇(1∶300)120μL/孔,测波长570nm处A值。以各组A值比较PBMC培养上清液中IL-6活性。
(三)统计学处理:用SPSS软件作组间t检验。
二、结果
链球菌抗原刺激的银屑病患者PBMC培养上清液中TNF-α水平下降(与健康对照比较，P<0.05)、IL-6水平升高(与对照组比较，P<0.05);而PHA刺激的PBMC培养上清液中各组TNF-α和IL-6水平两组比较差异无显著性。见表1。
三、讨论
TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生,活化的角质形成细胞也可以产生[3]。由于许多实验证明TNF-α体外可以明显抑制表皮细胞增殖[4],所以银屑病患者PBMC的链球菌抗原刺激培养上清液中TNF-α活性降低可能对疾病的发展有意义。银屑病患者在一定条件下,不能有效足量地产生抑制角质形成细胞增殖的TNF-α,可能是银屑病角质形成细胞过度增殖的原因之一。至于出现TNF-α活性下降的原因,除遗传因素导致PBMC功能缺陷之外,有可能链球菌抗原或超抗原只作用于T淋巴细胞，而对单核/巨噬细胞少有影响。本实验的另一个发现是链球菌抗原刺激的银屑病PBMC培养上清液中IL-6水平升高,从一个侧面证实了银屑病患者链球菌反应性T淋巴细胞的存在,有可能受链球菌抗原刺激活化的T淋巴细胞是IL-6的主要来源。
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参考文献
[1]张理涛，陈学荣，殷金珠.β溶血型链球菌诱发点滴型银屑病发病机制的研究.中华皮肤科杂志，1999，32:99-100.
[2]钱玉昆,殷金珠.实用免疫学新技术.第1版.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1994.53-55.
[3] Kock A, Schwarz T, Kirnbauer R,et al. Human keratinocytes are a source for tumor necrosis factor alpha: Evidence for synthesis and release upon stimulation with endotoxin or ultraviolet light. J Exp Med， 1990， 172:1609- 1614.
[4] Kono T, Tanii T, Furukawa M, et al. Effect of human recombinant tumor necrosis alpha(TNF- alpha) on the proliferation potential of human keratinocytes cultured in serum- free medium. J Dermatol， 1990,17:409- 413.
(收稿日期：1999-11-09), 百拇医药