维A酸对细胞周期素D1、周期蛋白依赖性激酶4及P16表达的影响
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中华皮肤科杂志 2000年第5期第33卷
作者：李银涛 李世荫 张波 潘德海
单位：李银涛 李世荫(100083北京大学第三医院皮肤科)；张波(北京大学病理系)；潘德海(中日友好医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000521
银屑病患者皮损表皮细胞增殖周期较正常皮肤明显缩短。在细胞周期中G1期变异最大，细胞周期素D1(cyclinD1)、周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase4，CDK4)及周期蛋白依赖性激酶抑制物(cyclin dependent kinaseinhabitor,CKI)P16分子是G1期的主要调控者。我们应用维A酸霜外用治疗银屑病皮损，然后分别检测了其皮损用药前后表皮角质形成细胞中CyclinD1、CDK4及P16三者的mRNA及其蛋白质表达水平，报道如下。
, 百拇医药
一、材料和方法
(一)病例及取材：病例选自门诊及住院确诊的寻常型银屑病患者13例，其中斑块状损害11例，点滴状损害2例。实验前3个月内未使用皮质类固醇、免疫抑制剂、维A酸类及维生素D3类药物，亦未接受其他系统治疗，不伴有肿瘤及其他严重疾患。年龄25～72岁，病程6周至30年。实验开始，13例患者仅外用迪维霜治疗，治疗2～5周后取材。其中2例用药治疗后的皮损基本消退，11例治疗后的皮损面积较治疗前变小，浸润减轻，鳞屑消失，但皮损尚未完全消退。正常人组皮肤取自正常成人包皮环切术8例，正常成人上臂皮肤2例，共计10块。银屑病皮损用环钻取材(全层皮肤)，常规3.33mol/L(10%)中性福尔马林固定，石蜡包埋，室温存放。
(二)主要试剂及仪器：CDK4的cDNA质粒由美国冷泉港实验室DavidBeach博士惠赠，CyclinD1及P16cDNA质粒由北京大学病理系张波教授惠赠。Dig-RNA标记与检测试剂盒及Biotin-21-UTP为德国BoehringerMamnheim产品。RNA聚合酶(SP6、T3和T7)及质粒线性化酶(XhoⅠ,SamⅠ和EcoRⅠ)为美国Promaga产品。CyclinD1单抗及CDK4、P16多抗为美国SantaCruz产品。过氧化物酶标记的链霉亲合素蛋白(SP)染色试剂盒为美国Zymed产品。迪维霜(0.025%维A酸)为重庆华邦制药有限公司产品。图像处理分析系统为LEICAQ550/WUSA。
, 百拇医药
(三)方法：①探针的制备：CyclinD1、CDK4及P16的cDNA质粒用相应的质粒线性化酶酶切，所得cDNA片段分别为1.4kb、1.3kb和0.8kb，经纯化后作为模板，按照文献[1]提供的方法，将CyclinD1、P16及CDK4分别制备成生物素标记的CyclinD1及P16的cRNA探针和地高辛标记的CDK4的cRNA探针。②原位杂交：蜡块连续切片7μm厚。切片前玻片用2%三氨丙基三乙氧基硅烷(APES)胶处理，以防脱片。生物素标记的cRNA探针进行的原位杂交方法参见文献[1]；地高辛标记的cRNA探针的原位杂交按Dig-RNA标记与检测试剂盒提供的方法进行。③探针特异性阴性对照：杂交液中不加探针或以正向Dig-cRNA探针代替反向Dig-cRNA探针，其余操作相同。④免疫组化：LSAB法操作依照SPTM试剂盒提供的方法进行。CyclinD1单抗及CDK4、P16多抗工作浓度均为1∶100。⑤抗体特异性阴性对照：以PBS溶液代替一抗，其余操作相同。⑥实验结果的定量分析方法：在每张CDK4的原位杂交切片中随机选取10个400倍视野，用图像处理分析系统检测每个视野的灰度值，然后得出每张切片的平均灰度值；在其余每张切片(包括CyclinD1和P16的原位杂交切片及免疫组化切片，CDK4免疫组化切片)，随机选取10个400倍视野，并计数10个视野中的细胞总数及阳性细胞数，然后得出每张切片的阳性细胞百分率。⑦统计学处理：实验统计分析在SPSS/PC软件包上完成。3组之间显著性检验用单因素方差分析及Q检验；经Bartlett法检验方差不齐者，则选用秩和检验(KruskalandWallis法)及其两两比较。
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二、结果
(一)原位杂交CyclinD1、CDK4及P16的mRNA定量分析结果：银屑病皮损经维A酸治疗后，其CyclinD1和CDK4的mRNA表达水平较未经治疗的银屑病皮损低，较正常人的皮肤高(P<0.05)；P16的mRNA表达水平较未经治疗的银屑病皮损高，较正常人皮肤低(P<0.05)。见表1。
(二)免疫组化CyclinD1、CDK4及P16的蛋白质定量分析结果：未经治疗的银屑病皮损，其CyclinD1和CDK4的蛋白质表达水平较正常人皮肤高(P<0.05)；P16的蛋白质表达水平较正常人皮肤低(P<0.05)。经维A酸治疗后，其CyclinD1的蛋白质表达水平较银屑病皮损低(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)；其CDK4的蛋白质表达水平较银屑病皮损低(P<0.05)，较正常人皮肤高(P<0.05)；其P16的蛋白质表达水平较银屑病皮损高(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)。
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表1银屑病皮损经维A酸治疗后CyclinD1、CDK4及P16的mRNA和蛋白质表达水平比较(
±s)
组别
例数
mRNA
蛋白质
CyclinD1
CDK4
P16
CyclinD1
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CDK4
P16
正常人组
10
0.1697±0.0701
0.0543±0.0194
0.8482±0.0786
0.2929±0.0414
0.2879±0.0914
0.5334±0.1103
银屑病组
, 百拇医药 13
0.8640±0.0740
0.2610±0.1008
0.3597±0.1081
0.4863±0.0843
0.5637±0.0616
0.2555±0.0638
维A酸治疗组
13
0.4842±0.1510
0.1089±0.0481
, 百拇医药
0.5848±0.1307
0.3381±0.0938
0.4665±0.0665
0.5200±0.1079
国家教委博士研究生基金资助课题(93095)
参考文献
[1]苏慧慈主编.原位杂交.第1版.北京：中国科学技术出版社，1994.122-150.
(收稿日期：1999-11-01), http://www.100md.com
单位：李银涛 李世荫(100083北京大学第三医院皮肤科)；张波(北京大学病理系)；潘德海(中日友好医院皮肤科)
关键词：
中华皮肤科杂志000521
银屑病患者皮损表皮细胞增殖周期较正常皮肤明显缩短。在细胞周期中G1期变异最大，细胞周期素D1(cyclinD1)、周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase4，CDK4)及周期蛋白依赖性激酶抑制物(cyclin dependent kinaseinhabitor,CKI)P16分子是G1期的主要调控者。我们应用维A酸霜外用治疗银屑病皮损，然后分别检测了其皮损用药前后表皮角质形成细胞中CyclinD1、CDK4及P16三者的mRNA及其蛋白质表达水平，报道如下。
, 百拇医药
一、材料和方法
(一)病例及取材：病例选自门诊及住院确诊的寻常型银屑病患者13例，其中斑块状损害11例，点滴状损害2例。实验前3个月内未使用皮质类固醇、免疫抑制剂、维A酸类及维生素D3类药物，亦未接受其他系统治疗，不伴有肿瘤及其他严重疾患。年龄25～72岁，病程6周至30年。实验开始，13例患者仅外用迪维霜治疗，治疗2～5周后取材。其中2例用药治疗后的皮损基本消退，11例治疗后的皮损面积较治疗前变小，浸润减轻，鳞屑消失，但皮损尚未完全消退。正常人组皮肤取自正常成人包皮环切术8例，正常成人上臂皮肤2例，共计10块。银屑病皮损用环钻取材(全层皮肤)，常规3.33mol/L(10%)中性福尔马林固定，石蜡包埋，室温存放。
(二)主要试剂及仪器：CDK4的cDNA质粒由美国冷泉港实验室DavidBeach博士惠赠，CyclinD1及P16cDNA质粒由北京大学病理系张波教授惠赠。Dig-RNA标记与检测试剂盒及Biotin-21-UTP为德国BoehringerMamnheim产品。RNA聚合酶(SP6、T3和T7)及质粒线性化酶(XhoⅠ,SamⅠ和EcoRⅠ)为美国Promaga产品。CyclinD1单抗及CDK4、P16多抗为美国SantaCruz产品。过氧化物酶标记的链霉亲合素蛋白(SP)染色试剂盒为美国Zymed产品。迪维霜(0.025%维A酸)为重庆华邦制药有限公司产品。图像处理分析系统为LEICAQ550/WUSA。
, 百拇医药
(三)方法：①探针的制备：CyclinD1、CDK4及P16的cDNA质粒用相应的质粒线性化酶酶切，所得cDNA片段分别为1.4kb、1.3kb和0.8kb，经纯化后作为模板，按照文献[1]提供的方法，将CyclinD1、P16及CDK4分别制备成生物素标记的CyclinD1及P16的cRNA探针和地高辛标记的CDK4的cRNA探针。②原位杂交：蜡块连续切片7μm厚。切片前玻片用2%三氨丙基三乙氧基硅烷(APES)胶处理，以防脱片。生物素标记的cRNA探针进行的原位杂交方法参见文献[1]；地高辛标记的cRNA探针的原位杂交按Dig-RNA标记与检测试剂盒提供的方法进行。③探针特异性阴性对照：杂交液中不加探针或以正向Dig-cRNA探针代替反向Dig-cRNA探针，其余操作相同。④免疫组化：LSAB法操作依照SPTM试剂盒提供的方法进行。CyclinD1单抗及CDK4、P16多抗工作浓度均为1∶100。⑤抗体特异性阴性对照：以PBS溶液代替一抗，其余操作相同。⑥实验结果的定量分析方法：在每张CDK4的原位杂交切片中随机选取10个400倍视野，用图像处理分析系统检测每个视野的灰度值，然后得出每张切片的平均灰度值；在其余每张切片(包括CyclinD1和P16的原位杂交切片及免疫组化切片，CDK4免疫组化切片)，随机选取10个400倍视野，并计数10个视野中的细胞总数及阳性细胞数，然后得出每张切片的阳性细胞百分率。⑦统计学处理：实验统计分析在SPSS/PC软件包上完成。3组之间显著性检验用单因素方差分析及Q检验；经Bartlett法检验方差不齐者，则选用秩和检验(KruskalandWallis法)及其两两比较。
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二、结果
(一)原位杂交CyclinD1、CDK4及P16的mRNA定量分析结果：银屑病皮损经维A酸治疗后，其CyclinD1和CDK4的mRNA表达水平较未经治疗的银屑病皮损低，较正常人的皮肤高(P<0.05)；P16的mRNA表达水平较未经治疗的银屑病皮损高，较正常人皮肤低(P<0.05)。见表1。
(二)免疫组化CyclinD1、CDK4及P16的蛋白质定量分析结果：未经治疗的银屑病皮损，其CyclinD1和CDK4的蛋白质表达水平较正常人皮肤高(P<0.05)；P16的蛋白质表达水平较正常人皮肤低(P<0.05)。经维A酸治疗后，其CyclinD1的蛋白质表达水平较银屑病皮损低(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)；其CDK4的蛋白质表达水平较银屑病皮损低(P<0.05)，较正常人皮肤高(P<0.05)；其P16的蛋白质表达水平较银屑病皮损高(P<0.05)，与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)。
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表1银屑病皮损经维A酸治疗后CyclinD1、CDK4及P16的mRNA和蛋白质表达水平比较(
±s)组别
例数
mRNA
蛋白质
CyclinD1
CDK4
P16
CyclinD1
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CDK4
P16
正常人组
10
0.1697±0.0701
0.0543±0.0194
0.8482±0.0786
0.2929±0.0414
0.2879±0.0914
0.5334±0.1103
银屑病组
, 百拇医药 13
0.8640±0.0740
0.2610±0.1008
0.3597±0.1081
0.4863±0.0843
0.5637±0.0616
0.2555±0.0638
维A酸治疗组
13
0.4842±0.1510
0.1089±0.0481
, 百拇医药
0.5848±0.1307
0.3381±0.0938
0.4665±0.0665
0.5200±0.1079
国家教委博士研究生基金资助课题(93095)
参考文献
[1]苏慧慈主编.原位杂交.第1版.北京：中国科学技术出版社，1994.122-150.
(收稿日期：1999-11-01), http://www.100md.com