c－fos和c－myc 原癌基因与bFGF在烧伤后早期创面组织中的表达规律
作者：顾小曼 付小兵 杨银辉 孙同柱 蒋礼先
单位：解放军第304医院，北京 100037
关键词：烧伤；癌基因蛋白；免疫组化；bFGF
西北国防医学杂志990406 摘要：目的：探讨烧伤后创面组织原癌基因c-fos、c-myc和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达顺序及分布规律。方法：采用深Ⅱ度烫伤模型，将42只大鼠分为7组，即正常对照组、烫伤后3 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d组。用SP免疫组化方法研究烫伤后不同时间点内源性c-fos、c-myc和bFGF蛋白的表达规律及分布特征。结果：烧伤可以诱导c-fos、c-myc和bFGF表达，但三者的表达模式不尽相同，正常皮肤即有c-fos表达，伤后3 h达峰值，以后逐渐下降，1天以后降至最低水平，其阳性颗粒主要分布于表皮基底细胞胞浆及真皮成纤维细胞的胞核内。c-myc的表达在伤后3天达最高值，阳性信号分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中；而bFGF则在伤后6 h开始出现，伤后第1天达最高值，主要分布于真皮层的成纤维细胞的胞浆中。结论：烧伤可以诱导皮肤创面组织原癌基因c-fos、c-myc及bFGF的表达，其表达具有时相与部位分布特征。三者表达的时相性提示在烧伤后早期原癌基因与生长因子基因之间具有相互调控作用，而这种调控作用对后期组织修复将产生一定的影响。
, 百拇医药
中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0254-02
The expression characteristics of c-fos,c-myc and bFGF in early burned tissues
GU Xiao-man,FU Xiao-bing,YANG Yin-hui,et al.
(304 hospital,PLA,Beijing,100037)
Abstract:Purpose:To investigate the sequence and characteristics of expression of endogeneous c-fos,c-myc and basic fibroblasts growth factor(bFGF)in burned tissues.Methods:A partial thickness burn of 30% TBSA was created on the back of Wistar rats.Immunohistochemistry was used to detect the expressions of these proteins in normal and the burned skins from 3 h,6 h,1 d,3 d,7 d and 14 d postburn.Results:The expression of c-fos,c-myc and bFGF could be induced by burn,but these three proteins showed different expression models in sequence and distribution.Expression of c-fos increased and peaked at 3 h postburn;The positive granules were mainly distributed in cytoplasm of basal cells and neucleus of fibroblasts.The expression of bFGF protein increased at 6 h and peaked at 1 d postburn,and was distributed in cytoplasm of fibroblasts.C-myc protein peaked at 3 d postburn and was also distributed in cytoplasm of fibroblasts.Conclusion:Thermal injury can induce c-fos,c-myc and bFGF expression which showed phasic control and regional distribution.The phasic expression of these three proteins indicate that there is regulatory relationship between proto-oncogenes and growth factor in early burn which has some effects on late tissue repair.
, 百拇医药
Key words:Burn;Oncoprotein;Immunohistochemistry;bFGF
创伤修复的经典观念偏重于组织学和病理学的描述。随着细胞生物学、分子生物学和生物化学的深入发展，人们对创伤修复的认识不断丰富和深化。近年来人们发现许多体液介质和细胞介质通过调节炎症细胞和修复细胞，进而参与了组织修复进程，其中多肽生长因子在这些调节介质中占有极重要的地位[1]。近年来的研究认为，原癌基因在早期胚胎发育、细胞生长、分化和组织损伤修复过程中发挥了重要作用。机体在缺血、缺氧、热休克、辐射和应激等情况下都可以诱导c-fos、c-myc等一过性表达。但在创伤修复过程中，原癌基因与生长因子之间具有复杂的相互调控关系[2]。本研究利用大鼠深Ⅱ度烫伤模型，对热损伤诱导的原癌基因与bFGF的表达特征作了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 动物模型：雄性Wistar大鼠40只，体重250～300 g，随机分为7组，经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为0.15 ml/100 g体重，刮除背部30%TBSA背毛，致伤组置于98℃水中8 s，造成30%TBSA烫伤创面，经组织学证实为深Ⅱ度烫伤。伤后按每100 g体重腹腔注射生理盐水4 ml行休克期复苏，并于伤后3 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d各取6只大鼠的创面组织和2只大鼠的正常皮肤，分别置于10%中性福尔马林和4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋，切片5 μm备用。
, 百拇医药
1.2 bFGF和Fos蛋白免疫组化检测：石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O237℃孵育10 min，以消除内源性过氧化氢酶活性，PBS洗后置于0.01 M，pH 6.0的柠檬酸中行抗原热修复，5%正常山羊血清封闭后加入适当稀释的c-fos一抗(中山生物技术有限公司)4℃过夜，PBS漂洗，滴加生物素标记的二抗37℃孵育20 min，PBS漂洗，滴加辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育30 min后DAB(二氨基联苯氨)显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察，阳性颗粒为棕黄色，同时设无一抗的空白对照。
1.3 c-myc蛋白免疫组化检测：冰冻切片5 μm室温放置30 min后，滴加10%福尔马林固定10 min，PBS漂洗，3%过氧化氢孵育5～10 min，消除内源性过氧化酶的活性，以下接石蜡切片免疫组化步骤。
2 结果
免疫组化结果显示，烧伤能诱导创面组织c-fos、c-myc和bFGF的表达，但三者表达不尽相同，c-fos在伤后3 h表达水平最高，主要分布于真皮层成纤维细胞及部分单核细胞的胞核中，c-myc在伤后3 d表达最高，主要分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中；而bFGF则在伤后6 h开始出现，伤后1 d到达最高值，主要分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中(见图1)。
, 百拇医药
图1 创面愈合过程中c-fos、bFGF和c-myc蛋白表达
3 讨论
体表烧伤修复的基本病理过程包括皮肤和肉芽组织的再生两方面，二者既相互协同又各具特征。其中细胞的增殖与迁移是创伤愈合过程中最为重要的细胞反应。有研究表明，原癌基因c-fos与c-myc在控制细胞增殖中具有重要作用。许多因素如缺血、缺氧都可以诱导它们一过性表达。bFGF作为一重要的促修复生长因子，近年来有较多报道。但最近的研究发现，损伤诱导的bFGF与原癌基因c-fos、c-myc之间具有某种内在的联系。Chen等利用手术结扎兔膀胱的一侧动脉造成膀胱缺血模型，发现立即早期基因c-fos和c-jun在伤后1 h即有表达，c-myc在伤后6 h即可探测到，而bFGF在缺血2 h即有表达，至缺血8 h到达峰值，升高了3～5倍[3]。Akira等利用Wistar大鼠为模型，结扎其大脑中动脉造成一局灶性缺血模型，观察bFGF mRNA与c-fos、c-jun mRNA的表达，结果发现缺血再灌注1 h后即有c-fos表达，而bFGF mRNA则在再灌注6 h后出现，12 h到达峰值[4]。我们的研究发现，皮肤烧伤后3 h，c-fos表达到达峰值，bFGF在伤后1 d到达峰值，而c-myc在伤后3 d到达峰值。以上结果提示了一个有趣的现象，即c-fos、c-myc、bFGF的表达具有某种时相的内在联系。
, 百拇医药
体外研究证实，c-fos为一反式作用因子，不是直接同DNA结合，而是同其它一些特异序列的转录因子如c-jun结合形成活性蛋白(AP-1)而起作用[5]。AP-1可以识别基因序列中的TRE位点，而许多生长相关基因如bFGF、c-myc等基因的启动子区就含有TRE位点，AR-1可以与之结合，启动这些基因的转录[6]。细胞周期的有序运行是细胞增殖的重要保证，这种有序运行受一系列细胞分裂周期基因(cell division cycle genes，CDC基因)顺序表达的调控。Pledge认为一个静止细胞(G0细胞)进入细胞周期运行，必须经过两个阶段，即“获能”(competence)与“前进”(progression)，在获能因子的作用下，细胞获得进入S期的潜能，而在前进因子的作用下，细胞进入分裂期(S期)。c-myc便为一获能基因，辅助获能因子获得进入有丝分裂期的潜能，在细胞增殖中起了重要作用。根据本实验结果并结合相关报告可以认为，从调控顺序性来讲，首先是创伤激活了c-fos基因，再通过c-fos基因本身或AP-1复合物识别bFGF基因中的TRE位点，由此而激活bFGF，最终导致一系列修复效应。因此，烧伤后创面组织部分原癌基因表达的有序性和受控性并与生长因子相互调控的特点，它们共同作用并调节着创面的愈合过程。
, 百拇医药
基金项目：全军“九五”医学科研规划重点项目(982090)
作者简介：顾小曼(1970-)，女，硕士，实习研究员
参考文献：
[1]付小兵，王德文，主编.创伤修复基础[M].北京：人民军医出版社，1997.117-118.
[2]Yang H,Linda C,Boris WH,et al.Activation of mitogen-activated protein kinases(ERK/JNK) and AP-1 transcription factor in rat carotid arteries after balloon injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17：2808-2816.
, http://www.100md.com [3]Chen Minwei,Ralph B,Robert ML.Genetic and cellular response to unilateral ischemia of the rabbit urinary bladder[J].J Urol，1996，155：732-737.
[4]Akira I,Atsuo M,Kazuo Y.Expression of basic fibroblast growth factor mRNA after transient focal ischemia:comparison with expression of c-fos,c-jun,and hsp 70 mRNA[J].J Neurotrauma，1997，14(4)：201-209.
[5]Martin P,Nobes DC.An early molecular component of the wound healing response in rat embros-induction of c-fos protein in cells at the epidermal wound margin[J].Mech Dev，1992，38：209-216.
[6]Qingbo X,Yusen L,Myriam G,et al.Acute hypertension activates mitogen-activated protein kinases in arterial wall[J].J Clin Invest，1996，97(2)：508-514.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药
单位：解放军第304医院，北京 100037
关键词：烧伤；癌基因蛋白；免疫组化；bFGF
西北国防医学杂志990406 摘要：目的：探讨烧伤后创面组织原癌基因c-fos、c-myc和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达顺序及分布规律。方法：采用深Ⅱ度烫伤模型，将42只大鼠分为7组，即正常对照组、烫伤后3 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d组。用SP免疫组化方法研究烫伤后不同时间点内源性c-fos、c-myc和bFGF蛋白的表达规律及分布特征。结果：烧伤可以诱导c-fos、c-myc和bFGF表达，但三者的表达模式不尽相同，正常皮肤即有c-fos表达，伤后3 h达峰值，以后逐渐下降，1天以后降至最低水平，其阳性颗粒主要分布于表皮基底细胞胞浆及真皮成纤维细胞的胞核内。c-myc的表达在伤后3天达最高值，阳性信号分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中；而bFGF则在伤后6 h开始出现，伤后第1天达最高值，主要分布于真皮层的成纤维细胞的胞浆中。结论：烧伤可以诱导皮肤创面组织原癌基因c-fos、c-myc及bFGF的表达，其表达具有时相与部位分布特征。三者表达的时相性提示在烧伤后早期原癌基因与生长因子基因之间具有相互调控作用，而这种调控作用对后期组织修复将产生一定的影响。
, 百拇医药
中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0254-02
The expression characteristics of c-fos,c-myc and bFGF in early burned tissues
GU Xiao-man,FU Xiao-bing,YANG Yin-hui,et al.
(304 hospital,PLA,Beijing,100037)
Abstract:Purpose:To investigate the sequence and characteristics of expression of endogeneous c-fos,c-myc and basic fibroblasts growth factor(bFGF)in burned tissues.Methods:A partial thickness burn of 30% TBSA was created on the back of Wistar rats.Immunohistochemistry was used to detect the expressions of these proteins in normal and the burned skins from 3 h,6 h,1 d,3 d,7 d and 14 d postburn.Results:The expression of c-fos,c-myc and bFGF could be induced by burn,but these three proteins showed different expression models in sequence and distribution.Expression of c-fos increased and peaked at 3 h postburn;The positive granules were mainly distributed in cytoplasm of basal cells and neucleus of fibroblasts.The expression of bFGF protein increased at 6 h and peaked at 1 d postburn,and was distributed in cytoplasm of fibroblasts.C-myc protein peaked at 3 d postburn and was also distributed in cytoplasm of fibroblasts.Conclusion:Thermal injury can induce c-fos,c-myc and bFGF expression which showed phasic control and regional distribution.The phasic expression of these three proteins indicate that there is regulatory relationship between proto-oncogenes and growth factor in early burn which has some effects on late tissue repair.
, 百拇医药
Key words:Burn;Oncoprotein;Immunohistochemistry;bFGF
创伤修复的经典观念偏重于组织学和病理学的描述。随着细胞生物学、分子生物学和生物化学的深入发展，人们对创伤修复的认识不断丰富和深化。近年来人们发现许多体液介质和细胞介质通过调节炎症细胞和修复细胞，进而参与了组织修复进程，其中多肽生长因子在这些调节介质中占有极重要的地位[1]。近年来的研究认为，原癌基因在早期胚胎发育、细胞生长、分化和组织损伤修复过程中发挥了重要作用。机体在缺血、缺氧、热休克、辐射和应激等情况下都可以诱导c-fos、c-myc等一过性表达。但在创伤修复过程中，原癌基因与生长因子之间具有复杂的相互调控关系[2]。本研究利用大鼠深Ⅱ度烫伤模型，对热损伤诱导的原癌基因与bFGF的表达特征作了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 动物模型：雄性Wistar大鼠40只，体重250～300 g，随机分为7组，经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为0.15 ml/100 g体重，刮除背部30%TBSA背毛，致伤组置于98℃水中8 s，造成30%TBSA烫伤创面，经组织学证实为深Ⅱ度烫伤。伤后按每100 g体重腹腔注射生理盐水4 ml行休克期复苏，并于伤后3 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d各取6只大鼠的创面组织和2只大鼠的正常皮肤，分别置于10%中性福尔马林和4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋，切片5 μm备用。
, 百拇医药
1.2 bFGF和Fos蛋白免疫组化检测：石蜡切片常规脱蜡至水，3%H2O237℃孵育10 min，以消除内源性过氧化氢酶活性，PBS洗后置于0.01 M，pH 6.0的柠檬酸中行抗原热修复，5%正常山羊血清封闭后加入适当稀释的c-fos一抗(中山生物技术有限公司)4℃过夜，PBS漂洗，滴加生物素标记的二抗37℃孵育20 min，PBS漂洗，滴加辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育30 min后DAB(二氨基联苯氨)显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察，阳性颗粒为棕黄色，同时设无一抗的空白对照。
1.3 c-myc蛋白免疫组化检测：冰冻切片5 μm室温放置30 min后，滴加10%福尔马林固定10 min，PBS漂洗，3%过氧化氢孵育5～10 min，消除内源性过氧化酶的活性，以下接石蜡切片免疫组化步骤。
2 结果
免疫组化结果显示，烧伤能诱导创面组织c-fos、c-myc和bFGF的表达，但三者表达不尽相同，c-fos在伤后3 h表达水平最高，主要分布于真皮层成纤维细胞及部分单核细胞的胞核中，c-myc在伤后3 d表达最高，主要分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中；而bFGF则在伤后6 h开始出现，伤后1 d到达最高值，主要分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中(见图1)。
, 百拇医药
图1 创面愈合过程中c-fos、bFGF和c-myc蛋白表达
3 讨论
体表烧伤修复的基本病理过程包括皮肤和肉芽组织的再生两方面，二者既相互协同又各具特征。其中细胞的增殖与迁移是创伤愈合过程中最为重要的细胞反应。有研究表明，原癌基因c-fos与c-myc在控制细胞增殖中具有重要作用。许多因素如缺血、缺氧都可以诱导它们一过性表达。bFGF作为一重要的促修复生长因子，近年来有较多报道。但最近的研究发现，损伤诱导的bFGF与原癌基因c-fos、c-myc之间具有某种内在的联系。Chen等利用手术结扎兔膀胱的一侧动脉造成膀胱缺血模型，发现立即早期基因c-fos和c-jun在伤后1 h即有表达，c-myc在伤后6 h即可探测到，而bFGF在缺血2 h即有表达，至缺血8 h到达峰值，升高了3～5倍[3]。Akira等利用Wistar大鼠为模型，结扎其大脑中动脉造成一局灶性缺血模型，观察bFGF mRNA与c-fos、c-jun mRNA的表达，结果发现缺血再灌注1 h后即有c-fos表达，而bFGF mRNA则在再灌注6 h后出现，12 h到达峰值[4]。我们的研究发现，皮肤烧伤后3 h，c-fos表达到达峰值，bFGF在伤后1 d到达峰值，而c-myc在伤后3 d到达峰值。以上结果提示了一个有趣的现象，即c-fos、c-myc、bFGF的表达具有某种时相的内在联系。
, 百拇医药
体外研究证实，c-fos为一反式作用因子，不是直接同DNA结合，而是同其它一些特异序列的转录因子如c-jun结合形成活性蛋白(AP-1)而起作用[5]。AP-1可以识别基因序列中的TRE位点，而许多生长相关基因如bFGF、c-myc等基因的启动子区就含有TRE位点，AR-1可以与之结合，启动这些基因的转录[6]。细胞周期的有序运行是细胞增殖的重要保证，这种有序运行受一系列细胞分裂周期基因(cell division cycle genes，CDC基因)顺序表达的调控。Pledge认为一个静止细胞(G0细胞)进入细胞周期运行，必须经过两个阶段，即“获能”(competence)与“前进”(progression)，在获能因子的作用下，细胞获得进入S期的潜能，而在前进因子的作用下，细胞进入分裂期(S期)。c-myc便为一获能基因，辅助获能因子获得进入有丝分裂期的潜能，在细胞增殖中起了重要作用。根据本实验结果并结合相关报告可以认为，从调控顺序性来讲，首先是创伤激活了c-fos基因，再通过c-fos基因本身或AP-1复合物识别bFGF基因中的TRE位点，由此而激活bFGF，最终导致一系列修复效应。因此，烧伤后创面组织部分原癌基因表达的有序性和受控性并与生长因子相互调控的特点，它们共同作用并调节着创面的愈合过程。
, 百拇医药
基金项目：全军“九五”医学科研规划重点项目(982090)
作者简介：顾小曼(1970-)，女，硕士，实习研究员
参考文献：
[1]付小兵，王德文，主编.创伤修复基础[M].北京：人民军医出版社，1997.117-118.
[2]Yang H,Linda C,Boris WH,et al.Activation of mitogen-activated protein kinases(ERK/JNK) and AP-1 transcription factor in rat carotid arteries after balloon injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17：2808-2816.
, http://www.100md.com [3]Chen Minwei,Ralph B,Robert ML.Genetic and cellular response to unilateral ischemia of the rabbit urinary bladder[J].J Urol，1996，155：732-737.
[4]Akira I,Atsuo M,Kazuo Y.Expression of basic fibroblast growth factor mRNA after transient focal ischemia:comparison with expression of c-fos,c-jun,and hsp 70 mRNA[J].J Neurotrauma，1997，14(4)：201-209.
[5]Martin P,Nobes DC.An early molecular component of the wound healing response in rat embros-induction of c-fos protein in cells at the epidermal wound margin[J].Mech Dev，1992，38：209-216.
[6]Qingbo X,Yusen L,Myriam G,et al.Acute hypertension activates mitogen-activated protein kinases in arterial wall[J].J Clin Invest，1996，97(2)：508-514.
收稿日期：1999-08-08, 百拇医药