PDGF－AB对成纤维细胞增殖及DNA合成的影响
作者：董茂龙 陈璧 朱雄翔 李永林 汤朝武
单位：第四军医大学西京医院烧伤外科，西安 710033
关键词：PDGF-AB；MTT实验；DNA合成；3H-TdR掺入
西北国防医学杂志990413 摘要：目的：探讨PDGF-AB促进伤口愈合及其在瘢痕增生中的作用机理。方法：取体外培养的人正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞(normal skin fibroblast,NsFb,hypertrophic scar fibroblast,HTsFb)，用MTT和3H-TdR掺入法观察PDGF-AB对两种细胞增殖及DNA合成的影响。结果：PDGF-AB对两种成纤维细胞增殖及DNA合成均有明显刺激作用，且均呈剂量依赖性关系，但作用有差异。结论：PDGF-AB可能通过刺激成纤维细胞增殖及DNA合成促进伤口愈合，但同时在瘢痕增生性疾病中可能起重要促进作用。
, 百拇医药
中图分类号：Q 28 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0274-02
The effect of PDGF-AB on proliferation and DNA synthesis of fibroblasts
DONG Mao-long,CHEN Bi,ZHU Xiong-xiang,et al.
(Department of Burn Surgery,XiJing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an,710032)
Abstract:Purpose To investigate the mechanism by which PDGF-AB promotes wound healing and the effect of PDGF-AB on scar forming.Methods:In vitro cultured human normal skin and hypertrophic scar fibroblasts were applied to measure the effect of PDGF-AB on proliferation and DNA synthesis of fibroblasts by MTT and 3 H-TdR incorporation.Results:There was difference of proliferation and DNA synthesis between human normal skin and hypertrophic scar fibroblasts,PDGF-AB could enhance proliferation and DNA synthesis of two kinds of fibroblasts in dependent dose.Conclusion:PDGF-AB may promote wound healing by stimulating proliferation and DNA synthesis of fibroblasts,and may play important role in scar forming.
, 百拇医药
Key words:PDGF-AB;MTT test;DNA synthesis;3H-TdR incorporation
血小板衍生生长因子(PDGF)是创面愈合过程中重要的生长因子之一，PDGF在创面愈合过程中起重要作用，特别是对一些慢性难愈合性伤口如糖尿病溃疡、慢性静脉性溃疡、褥疮、放射性溃疡等均有明显促进愈合作用[1，2]，但亦有越来越多的实验证明PDGF-AB与瘢痕等增生性疾病有关[3，4]。本实验采用MTT及3H-TdR掺入法研究PDGF-AB对成纤维细胞增殖及DNA合成的刺激作用，探讨其促进伤口愈合的机理及在瘢痕增生中可能的作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂：PDGF-AB购于深圳晶美生物公司。DMEM为GIBCO公司产品，胰蛋白酶为DIBCO公司产品，新生小牛血清为上海产，3H-TdR购于中国原子能研究院。
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1.2 成纤维细胞培养：取术中剩下的人正常皮肤及增生性瘢痕，0.25%洗必泰浸泡5 min消毒，生理盐水漂洗3次，剪成约1 mm3大小，组织块法培养于含10%小牛血清(FCS)的DMEM中，培养条件为37℃，5% CO2，每隔3 d换液一次，约4～6 d长出细胞，3～4周左右长满瓶底，然后用0.125%胰酶+0.1%EDTA消化传代，取第3～6代细胞用于实验。
1.3 MTT试验：取第3～6代生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化、分离、收集细胞、细胞计数、及测定细胞活力，活细胞率达95%以上时，用10%FCS的DMEM调整细胞浓度为3×107/L，按200 μl/孔接种于96孔板，于37℃，50 ml/L CO2孵箱中培养12 h，待细胞贴壁后换成含PDGF-AB的DMEM，NsFb和HTsFb分别设置PDGF-AB 0、1.25、12.5、25、50、100 ng/ml PDGF-AB+2% FCS的DMEM6个浓度组，每组设置3个复孔，每一浓度重复3次，继续培养68 h，加MTT 20μl/孔(5g/L)，继续培养4 h后弃去培养基，加二甲基亚砜100 μl/孔，微型振荡器上振荡15 min，在490 nm波长下用酶联免疫仪测定A值。
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1.4 3H-TdR掺入实验：取第3～6代对数生长期的NsFb和HTsFb，T/E消化，1 500 rpm离心10 min，用含10%FCS的DMEM配制成浓度为2.5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板200 μl/孔，置于37.0℃，50%CO2，孵箱中培养12 h，待细胞贴壁后，吸出原培养液，加入含有不同浓度PDGF-AB+2%FCS的DMEM，NsFb和HTsFb分别设置PDGF-AB 0、1.25、12.5、25、50、100ng/ml6个浓度组，继续培养36 h，每孔加入18.5 KBq(共20 μl)的3H-TdR，每一浓度设置3个复孔，每一浓度重复三次，继续培养12 h吸去培养基，胰酶消化细胞，用ZT-Ⅲ型多孔细胞样品收集器收集细胞于999型纤维膜上，红外线烤干加闪烁液，于Beckman LS-6500液闪计数仪上计数。
1.5 统计学分析：采用第四军医大学统计学教研室开发的SPLM医用统计软件包进行方差分析。
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2 结果
2.1 MTT实验结果：见图1。
图1 PDGF-AB对NsFb和HTsFb增殖的影响
2.2 3H-TdR实验结果：见图2。
图2 PDGF-AB对NsFb和HTsFb DNA合成的影响
从曲线可以看出PDGF-AB对两种成纤维细胞增殖及DNA合成均有明显促进作用，但在同一浓度时，对NsFb促增殖作用较HTsFb强，在100 ng/ml时刺激作用反而有所下降。MTT与3H-TdR实验结果基本一致。
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3 讨论
创面愈合过程包括炎症反应，细胞增殖，分化移行，血管神经再生，以及细胞外基质的合成及重建等一系列过程，成纤维细胞是创面愈合过程中主要细胞成份之一，它通过迁移、分化、分裂、增殖、分泌胶原等细胞外基质成分等途径来实现创面愈合，同时创面愈合过程又受到许多生长因子的调控，血小板衍生生长因子就是一种较强的促愈合因子，它通过多种途径参与创面愈合。
MTT可被活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶还原成难溶性蓝紫色结晶物Formanzan，二甲基亚砜能溶解Formanzan，用酶联免疫仪检测A 490 nm值可以间接反映活细胞的数量。实验设置PDGF-AB 0、1.25、12.5、25、50、100 ng/ml6个浓度组，观察到PDGF-AB对两种Fb都有显著促增殖作用，且都呈现明显剂量依赖性关系，但剂量反应性存在着显著性差异。对NsFb，PDGF-AB浓度为50 ng/ml时，作用最强，而100 ng/ml时促增殖作用反而有所下降，但对HTsFb而言PDGF-AB浓度为100 ng/ml时刺激作用最强，但增殖作用仍较NsFb弱(图1),过低浓度(1.25 ng/ml)PDGF-AB对两种Fb增殖刺激作用均较小(P>0.05)。在相差显微镜下观察，经PDGF-AB作用的HTsFb及NsFb除细胞排列变密、细胞极性稍变乱之外，细胞形态无明显区别。结果和Warren等[5]的实验结果相一致，证实了PDGF-AB对两种细胞的促增殖作用。
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3H-TdR掺入结果表明PDGF-AB能显著增加HTsFb和NsFb DNA的合成，且均呈现剂量依赖性关系，证实PDGF-AB能促进Fb向增殖表型的转化，但对HTsFb和NsFb作用有差异性，对NsFb，PDGF-AB浓度在50 ng/ml左右时对DNA合成刺激作用最强，过高的浓度刺激作用反而下降，这可能与细胞内反馈系统的启动有关，如P53基因及其它抑制基因的启动和表达有关[6]，对HTsFb而言，在PDGF-AB浓度在100 ng/ml时对DNA的刺激作用达到最高峰，结果与MTT实验结果基本一致。国外学者Warrenl Garner研究表明，TGFβ1对正常肺组织来源的Fb比纤维化肺组织来源的Fb DNA合成的促进作用要强得多，作者以为这是因纤维化肺组织来源的Fb已经受到了各种因素的作用，主要表现为合成表型，而增殖分裂能力弱[7]。
血小板衍生生长因子(PDGF)是创面愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程起重要作用，特别是作为间充质细胞(主要是Fb)的主要有丝分裂原起促进细胞增殖作用。本实验证实PDGF-AB对两种成纤维细胞增殖及DNA合成均有明显的促进作用，但其作用有差异，提示PDGF-AB可能通过以上两种途径促进创面愈合，同时在瘢痕增生过程中起重要作用。
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作者简介：董茂龙(1971-)，男，硕士
参考文献：
[1]Thomas FD,Rodney SK.Growth factor and wound healing:platelet-derived growth factor as a model cytokine[J].Annu Rev Med,1991,42(2):567-584.
[2]Martin CR,Linda GP,Arlen T,et al.Platelet-derived growth factor BB for the treatment of chronic pressure ulcers[J].Lancet,1992,339(8784):23-25.
[3]Plemons JM,Dill RE,Rees TD,et al.PDGF-B producing cells and PDGF-B gene expression in normal gingival and cyclosporine A-induced gingival overgrowth[J].J Perio,1996,167(3):264-270.
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[4]Richard M.Terek,William AJ,Richmond et al.The expression of PDGF in Dupuytren contracture[J].J Bone Joint Surg,1995,77(1):1-9.
[5]Warren LG,Soverin K,Jorge LR,et al.Phenotypic differences in cytokine resiveness of hypertrophic scar versus normal dermal fibroblasts[J].Society Invest Dermatol,1993,101(6):875-878.
[6]Harry NA,Theoofanis G,Jainine NG,P53 expression during normal tissue regeneration in response to acute cutaneous injury in swine[J].J Clin Invest,1994,93(5):2206-2214.
[7]Yusuf K,Alexis D,Jean-Clande P,et al.Cytoskeletal protein modulation in pulmonary alveolar myofibroblasts during idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J respir Crit Care Med,1995,152(6-pt1):2163-2169.
收稿日期：1999-06-22, http://www.100md.com
单位：第四军医大学西京医院烧伤外科，西安 710033
关键词：PDGF-AB；MTT实验；DNA合成；3H-TdR掺入
西北国防医学杂志990413 摘要：目的：探讨PDGF-AB促进伤口愈合及其在瘢痕增生中的作用机理。方法：取体外培养的人正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞(normal skin fibroblast,NsFb,hypertrophic scar fibroblast,HTsFb)，用MTT和3H-TdR掺入法观察PDGF-AB对两种细胞增殖及DNA合成的影响。结果：PDGF-AB对两种成纤维细胞增殖及DNA合成均有明显刺激作用，且均呈剂量依赖性关系，但作用有差异。结论：PDGF-AB可能通过刺激成纤维细胞增殖及DNA合成促进伤口愈合，但同时在瘢痕增生性疾病中可能起重要促进作用。
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中图分类号：Q 28 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0274-02
The effect of PDGF-AB on proliferation and DNA synthesis of fibroblasts
DONG Mao-long,CHEN Bi,ZHU Xiong-xiang,et al.
(Department of Burn Surgery,XiJing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an,710032)
Abstract:Purpose To investigate the mechanism by which PDGF-AB promotes wound healing and the effect of PDGF-AB on scar forming.Methods:In vitro cultured human normal skin and hypertrophic scar fibroblasts were applied to measure the effect of PDGF-AB on proliferation and DNA synthesis of fibroblasts by MTT and 3 H-TdR incorporation.Results:There was difference of proliferation and DNA synthesis between human normal skin and hypertrophic scar fibroblasts,PDGF-AB could enhance proliferation and DNA synthesis of two kinds of fibroblasts in dependent dose.Conclusion:PDGF-AB may promote wound healing by stimulating proliferation and DNA synthesis of fibroblasts,and may play important role in scar forming.
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Key words:PDGF-AB;MTT test;DNA synthesis;3H-TdR incorporation
血小板衍生生长因子(PDGF)是创面愈合过程中重要的生长因子之一，PDGF在创面愈合过程中起重要作用，特别是对一些慢性难愈合性伤口如糖尿病溃疡、慢性静脉性溃疡、褥疮、放射性溃疡等均有明显促进愈合作用[1，2]，但亦有越来越多的实验证明PDGF-AB与瘢痕等增生性疾病有关[3，4]。本实验采用MTT及3H-TdR掺入法研究PDGF-AB对成纤维细胞增殖及DNA合成的刺激作用，探讨其促进伤口愈合的机理及在瘢痕增生中可能的作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂：PDGF-AB购于深圳晶美生物公司。DMEM为GIBCO公司产品，胰蛋白酶为DIBCO公司产品，新生小牛血清为上海产，3H-TdR购于中国原子能研究院。
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1.2 成纤维细胞培养：取术中剩下的人正常皮肤及增生性瘢痕，0.25%洗必泰浸泡5 min消毒，生理盐水漂洗3次，剪成约1 mm3大小，组织块法培养于含10%小牛血清(FCS)的DMEM中，培养条件为37℃，5% CO2，每隔3 d换液一次，约4～6 d长出细胞，3～4周左右长满瓶底，然后用0.125%胰酶+0.1%EDTA消化传代，取第3～6代细胞用于实验。
1.3 MTT试验：取第3～6代生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化、分离、收集细胞、细胞计数、及测定细胞活力，活细胞率达95%以上时，用10%FCS的DMEM调整细胞浓度为3×107/L，按200 μl/孔接种于96孔板，于37℃，50 ml/L CO2孵箱中培养12 h，待细胞贴壁后换成含PDGF-AB的DMEM，NsFb和HTsFb分别设置PDGF-AB 0、1.25、12.5、25、50、100 ng/ml PDGF-AB+2% FCS的DMEM6个浓度组，每组设置3个复孔，每一浓度重复3次，继续培养68 h，加MTT 20μl/孔(5g/L)，继续培养4 h后弃去培养基，加二甲基亚砜100 μl/孔，微型振荡器上振荡15 min，在490 nm波长下用酶联免疫仪测定A值。
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1.4 3H-TdR掺入实验：取第3～6代对数生长期的NsFb和HTsFb，T/E消化，1 500 rpm离心10 min，用含10%FCS的DMEM配制成浓度为2.5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板200 μl/孔，置于37.0℃，50%CO2，孵箱中培养12 h，待细胞贴壁后，吸出原培养液，加入含有不同浓度PDGF-AB+2%FCS的DMEM，NsFb和HTsFb分别设置PDGF-AB 0、1.25、12.5、25、50、100ng/ml6个浓度组，继续培养36 h，每孔加入18.5 KBq(共20 μl)的3H-TdR，每一浓度设置3个复孔，每一浓度重复三次，继续培养12 h吸去培养基，胰酶消化细胞，用ZT-Ⅲ型多孔细胞样品收集器收集细胞于999型纤维膜上，红外线烤干加闪烁液，于Beckman LS-6500液闪计数仪上计数。
1.5 统计学分析：采用第四军医大学统计学教研室开发的SPLM医用统计软件包进行方差分析。
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2 结果
2.1 MTT实验结果：见图1。
图1 PDGF-AB对NsFb和HTsFb增殖的影响
2.2 3H-TdR实验结果：见图2。
图2 PDGF-AB对NsFb和HTsFb DNA合成的影响
从曲线可以看出PDGF-AB对两种成纤维细胞增殖及DNA合成均有明显促进作用，但在同一浓度时，对NsFb促增殖作用较HTsFb强，在100 ng/ml时刺激作用反而有所下降。MTT与3H-TdR实验结果基本一致。
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3 讨论
创面愈合过程包括炎症反应，细胞增殖，分化移行，血管神经再生，以及细胞外基质的合成及重建等一系列过程，成纤维细胞是创面愈合过程中主要细胞成份之一，它通过迁移、分化、分裂、增殖、分泌胶原等细胞外基质成分等途径来实现创面愈合，同时创面愈合过程又受到许多生长因子的调控，血小板衍生生长因子就是一种较强的促愈合因子，它通过多种途径参与创面愈合。
MTT可被活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶还原成难溶性蓝紫色结晶物Formanzan，二甲基亚砜能溶解Formanzan，用酶联免疫仪检测A 490 nm值可以间接反映活细胞的数量。实验设置PDGF-AB 0、1.25、12.5、25、50、100 ng/ml6个浓度组，观察到PDGF-AB对两种Fb都有显著促增殖作用，且都呈现明显剂量依赖性关系，但剂量反应性存在着显著性差异。对NsFb，PDGF-AB浓度为50 ng/ml时，作用最强，而100 ng/ml时促增殖作用反而有所下降，但对HTsFb而言PDGF-AB浓度为100 ng/ml时刺激作用最强，但增殖作用仍较NsFb弱(图1),过低浓度(1.25 ng/ml)PDGF-AB对两种Fb增殖刺激作用均较小(P>0.05)。在相差显微镜下观察，经PDGF-AB作用的HTsFb及NsFb除细胞排列变密、细胞极性稍变乱之外，细胞形态无明显区别。结果和Warren等[5]的实验结果相一致，证实了PDGF-AB对两种细胞的促增殖作用。
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3H-TdR掺入结果表明PDGF-AB能显著增加HTsFb和NsFb DNA的合成，且均呈现剂量依赖性关系，证实PDGF-AB能促进Fb向增殖表型的转化，但对HTsFb和NsFb作用有差异性，对NsFb，PDGF-AB浓度在50 ng/ml左右时对DNA合成刺激作用最强，过高的浓度刺激作用反而下降，这可能与细胞内反馈系统的启动有关，如P53基因及其它抑制基因的启动和表达有关[6]，对HTsFb而言，在PDGF-AB浓度在100 ng/ml时对DNA的刺激作用达到最高峰，结果与MTT实验结果基本一致。国外学者Warrenl Garner研究表明，TGFβ1对正常肺组织来源的Fb比纤维化肺组织来源的Fb DNA合成的促进作用要强得多，作者以为这是因纤维化肺组织来源的Fb已经受到了各种因素的作用，主要表现为合成表型，而增殖分裂能力弱[7]。
血小板衍生生长因子(PDGF)是创面愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程起重要作用，特别是作为间充质细胞(主要是Fb)的主要有丝分裂原起促进细胞增殖作用。本实验证实PDGF-AB对两种成纤维细胞增殖及DNA合成均有明显的促进作用，但其作用有差异，提示PDGF-AB可能通过以上两种途径促进创面愈合，同时在瘢痕增生过程中起重要作用。
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作者简介：董茂龙(1971-)，男，硕士
参考文献：
[1]Thomas FD,Rodney SK.Growth factor and wound healing:platelet-derived growth factor as a model cytokine[J].Annu Rev Med,1991,42(2):567-584.
[2]Martin CR,Linda GP,Arlen T,et al.Platelet-derived growth factor BB for the treatment of chronic pressure ulcers[J].Lancet,1992,339(8784):23-25.
[3]Plemons JM,Dill RE,Rees TD,et al.PDGF-B producing cells and PDGF-B gene expression in normal gingival and cyclosporine A-induced gingival overgrowth[J].J Perio,1996,167(3):264-270.
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[4]Richard M.Terek,William AJ,Richmond et al.The expression of PDGF in Dupuytren contracture[J].J Bone Joint Surg,1995,77(1):1-9.
[5]Warren LG,Soverin K,Jorge LR,et al.Phenotypic differences in cytokine resiveness of hypertrophic scar versus normal dermal fibroblasts[J].Society Invest Dermatol,1993,101(6):875-878.
[6]Harry NA,Theoofanis G,Jainine NG,P53 expression during normal tissue regeneration in response to acute cutaneous injury in swine[J].J Clin Invest,1994,93(5):2206-2214.
[7]Yusuf K,Alexis D,Jean-Clande P,et al.Cytoskeletal protein modulation in pulmonary alveolar myofibroblasts during idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J respir Crit Care Med,1995,152(6-pt1):2163-2169.
收稿日期：1999-06-22, http://www.100md.com