介绍一种大鼠脑中γ－氨基丁酸受体的检测方法
作者：彭俊华 张峰 齐心亮 曹波 高宁 卓鉴波
单位：彭俊华 张峰 齐心亮：兰州军区兰州总医院检验科，兰州 730050；曹波 高宁 卓鉴波：第三军医大学环境卫生教研室，重庆 400038
关键词：实验室诊断；GABA受体；神经末梢微囊；3H-GABA
介绍一种大鼠脑中γ 摘要：目的：介绍一种大鼠脑中γ-氨基丁酸受体的快速简便的检测方法。方法：用3H-GABA为配体来检测大鼠脑神经末梢微囊中的GABA受体。检测GABA受体的合适条件是1.0×10-3mol/L的脑膜蛋白在37℃下反应30 min。结果：大鼠脑中存在GABA受体，Kd＝(97.3±5.8)×10-9mol/L，Bmax＝0.1061×10-9mol/g蛋白±0.0103×10-9mol/g蛋白，属低亲和力受体。结论：用3H-GABA可以检测大鼠脑中的GABA受体。
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中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0266-03
Establishment and application of a method using 3H-GABA to detect γ-aminobutyric acid receptor
PENG Jun-hua,ZHANG Feng,QI Xin-liang,et al.
(Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Purpose:to introduce a method for examination of γ-aminobutyric acid (GABA) receptor in rat's brain.Methods:3H-GABA was used as ligand to examine GABA in microsac of rat's brain.The best acting factors were 1.0×10-3mol/L protein of rat's microsac acted for 30 min under 37℃.Results:GABA receptor was found in rat's brain.Kd＝(97.3±5.8)×10-9mol/L,Bmax＝0.1061×10-9mol/g protein±0.0103×10-9mol/g protein.It was a low-affinity class GABA receptor.Conclusion:3H-GABA can be used for examination of GABA receptor in rat's brain.
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Key words:Laboratory diagnosis;GABA receptor;Microsac;3H-GABA
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是1950年发现的中枢抑制性神经递质，通过与GABA受体结合发挥其抑制功能。大脑组织中聚集了许多神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、组胺等[1]。神经末梢微囊中除含有环磷腺苷外，还含有少量的可乐亭、异丙肾上腺素、GABA等神经递质[2]。实验证明，用GABA激动剂作用于大鼠脑神经末梢微囊可增加36Cl流入微囊内[2]，用35S-叔丁基双环偶磷硫代硫酸类化合物作用大鼠神经末梢微囊也可检测GABA[3]。用3H-GABA来检测大鼠神经末梢微囊中的GABA受体，国内外尚少见报道，现将实验结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料和试剂：3H-GABA，中国科学院上海原子能研究所，放射性比强度30×103Ci/mol，放射性浓度1Ci/L；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES，N-2-Hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethane sulfonic acid)，宝灵曼产品；HEPES缓冲液(pH＝7.4)145×10-3mol/L氯化钠，5×10-3mol/L氯化钾，1×10-3mol/L氯化镁，10×10-3mol/L HEPES，10×10-3mol/L D-葡萄糖；膜片闪烁液；牛血清白蛋白，测蛋白试剂；49＃玻璃纤维滤纸，上海红光造纸厂产品。
1.2 主要仪器：液体闪烁计，LKB 1217-RACKBETA，瑞典产品，台式高速低温离心机，1.0 R，德国产品；移液器20 μl、200 μl、1 000 μl，法国产品。
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1.3 实验动物：健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g，第三军医大学动物实验中心提供，实验前所有动物均在实验室饲养1周以上，自由进水进食。
1.4 主要实验方法
1.4.1 大鼠脑神经末梢微囊制备[1，2]：大鼠断头取脑，称重，按1/10(W/V)加冰冷缓冲液，玻璃匀浆器中以3 500 γ/min匀浆1 min。匀浆液离心(900 g、4℃)15 min，倾去上清，沉淀用20 ml缓冲液洗一次，再离心，倾去上清，加入缓冲液10 ml，混匀，分装，液氮保存。
1.4.2 大鼠脑神经末梢微囊蛋白含量测定按Lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。
1.4.3 大鼠脑神经末梢微囊GABA受体结合实验[4，5]：冰冻大鼠脑神经末梢微囊于37℃解冻30 min，混匀。总结合组：取蛋白(终浓度1.0 g/L)于小试管中，加入30×10-9mol/L的3H-GABA，37℃反应30 min，入冰水中止反应，49＃玻璃纤维滤纸抽滤，冰冷缓冲液4 ml冲洗二次，70～80℃(20 min)烤干，加5 ml膜片闪烁液，暗化过夜，用液体闪烁计数仪进行测定。
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非特异性结合组：加入3H-GABA 2 000倍的GABA，37℃反应10 min，再加入30×10-9mol/L的3H-GABA，余同总结合组。特异性结合＝总结合-非特异性结合。
1.5 统计处理：采用微软公司的Excel程序包进行t检验分析处理。
2 结果
2.1 大鼠脑膜GABA受体特异性结合：大鼠脑膜GABA受体的总结合组与非特异性结合组的每分钟计数率分别为681.3±24.9和463.0±17.3，两者间有显著差异(P<0.01)，提示大鼠脑膜中存在有GABA受体的特异性结合位点(n＝9)。
2.2 大鼠脑膜蛋白对受体结合影响：大鼠脑膜蛋白浓度介于(0.2～1.2) g/L，GABA受体结合的每分钟计数率随着脑膜蛋白浓度的增加而趋于饱和，0.8 g/L比0.4 g/L、0.4 g/L比0.2 g/L的每分钟计数率显著增高(P<0.01)。当蛋白浓度位于1.2 g/L时，每分钟计数率最高，与0.8 g/L比较无显著性差异(P>0.05)，当蛋白浓度位于1.6 g/L时，每分钟计数率反而降低(n＝10，见图1)。
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蛋白浓度(mg/ml)
图1 蛋白浓度对GABA受体结合的影响
P<0.01 每相邻两组比较
2.3 反应时间对大鼠脑GABA受体的影响:在30 min内大鼠脑中GABA受体结合的每分种计数率随反应时间的增加显著增加。5 min比2 min、10 min比5 min、30 min比10 min，每分钟计数率均显著增高(P<0.01)。60 min与30 min比较，每分钟计数率显著降低(P<0.01)。60 min与10 min比较，两者间每分钟计数率无显著变化(P>0.05)，表明大鼠脑膜中GABA受体反应在10 min时基本接近饱和(n＝9，见图2)。
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反应时间 (min)
图2 反应时间对GABA受体结合的影响
**P<0.01 每相邻两组比较
2.4 反应温度对大鼠脑GABA受体的影响:大鼠脑中GABA受体在体外反应30 min时，当反应温度介于25℃至41℃时，各组之间的每分钟计数率无显著差异(P>0.05)。
2.5 大鼠脑中GABA受体的饱和性：大鼠脑中GABA受体随着配体用量的增加，每分钟计数率也随着增加，并出现饱和趋势，经用Scatchard作图分析，B/F与B呈线负相关(γ＝-0.9214)，大鼠脑中GABA受体的Kd值为(97.3±5.8)×10-9mol/L，Bmax值为(0.1061±0.0103)×10-9mol/g蛋白(见图3，图4)。
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配体浓度(nmol/L)
◆总结合■非特异性结合
图3 GABA受体的结合曲线
B(*10 pmol/g蛋白)
图4 GABA受体的scatchdrd分析
3 讨论
GABA受体和N-乙酰胆碱受体同属于离子通道型受体超家族I型受体[6]，它们的配体结合部位都在细胞膜外区，属膜外激活。用3H-GABA作配体作用于大脑神经末梢微囊发现，当用过量的GABA作用于膜囊后，再加入3H-GABA，两者结果有显著差异(P<0.01)，表明膜囊上有GABA特异性结合位点。进一步研究发现，该特异性结合具有饱和性，Kd＝(97.3±5.8)×10-9mol/L、Bmax＝(0.1061±0.0103)×10-9mol/g蛋白。与以前用突触膜研究GABA受体相比，其Kd值无显著差异，属低亲和力GABA受体，其Bmax值显著低于突触体中的Bmax值[3]。
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在观察最适反应条件中，发现随脑膜蛋白浓度、反应时间的增加，其GABA受体结合趋于饱和。采用1.2 g/L脑膜蛋白或作用30 min时，其受体结合达最高值。采用1.6 g/L脑膜蛋白或作用60 min，其受体结合反而稍有降低，这可能是温育过程中被标记的配体被组织降解或组织内存在有内源性配体[5]。在25～41℃下作用30 min，GABA受体结合无显著差异，表明作用30 min，受体与配体结合达到饱和，这与前人结果相一致。在0℃时，突触体膜上GABA受体与配体在5 min内结合就可达到平衡。
用3H-GABA检测大鼠神经末梢微囊中的GABA受体，不需过多的特殊仪器，操作简单、省时快速、结果可靠。与突触膜相比，该法敏感性稍差，但在研究GABA受体中仍是一种简单可行的方法。
总之，大鼠脑神经末梢微囊中存在GABA受体。其Kd值为97.3×10-9mol/L、Bmax值为0.1061×10-9mol/g蛋白，属低亲和力GABA受体。
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作者简介：彭俊华(1966-)，男，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Daly JW,McNesl E,Partington C,et al.Accumulations of cycle AMP in adenine-labeled cell-free preparations from guinea pig cerebral cortex:Role of α-adrenergic and Hl-histaminergic receptors[J].J Neurochem,1980,35(2):326-337.
[2]Adron Harris R,Allan Andrea.Function coupling of γ-aminobutyric acid receptors to chloride channels in brain membranes[J].Sci,1985,28:1108-1110.
, 百拇医药
[3]Gant DB,Eldefrswi ME,Eldefrdwi AT.Action of organophosphate on GABAA receptors and voltsge-dependent chloride channels[J].Fundanmental and applied toxicology,1987,9:698-704.
[4]Kurioka Susunma,Hayata Hideo,Matsuda Makoto.Characterization of γ-aminobutyric acid binding site on crude synaptic membrance[J].J Neurochem,1981,37(2):283-288.
[5]周延冲.受体生物药理学[M].北京：人民卫生出版社，1985.1-124.
[6]孙志贤，林汝仙，汲言山.现代生物化学理论与研究技术[M].北京：军事医学出版社，1995.302-312.
收稿日期：1999-05-07, 百拇医药
单位：彭俊华 张峰 齐心亮：兰州军区兰州总医院检验科，兰州 730050；曹波 高宁 卓鉴波：第三军医大学环境卫生教研室，重庆 400038
关键词：实验室诊断；GABA受体；神经末梢微囊；3H-GABA
介绍一种大鼠脑中γ 摘要：目的：介绍一种大鼠脑中γ-氨基丁酸受体的快速简便的检测方法。方法：用3H-GABA为配体来检测大鼠脑神经末梢微囊中的GABA受体。检测GABA受体的合适条件是1.0×10-3mol/L的脑膜蛋白在37℃下反应30 min。结果：大鼠脑中存在GABA受体，Kd＝(97.3±5.8)×10-9mol/L，Bmax＝0.1061×10-9mol/g蛋白±0.0103×10-9mol/g蛋白，属低亲和力受体。结论：用3H-GABA可以检测大鼠脑中的GABA受体。
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中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(1999)04-0266-03
Establishment and application of a method using 3H-GABA to detect γ-aminobutyric acid receptor
PENG Jun-hua,ZHANG Feng,QI Xin-liang,et al.
(Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Purpose:to introduce a method for examination of γ-aminobutyric acid (GABA) receptor in rat's brain.Methods:3H-GABA was used as ligand to examine GABA in microsac of rat's brain.The best acting factors were 1.0×10-3mol/L protein of rat's microsac acted for 30 min under 37℃.Results:GABA receptor was found in rat's brain.Kd＝(97.3±5.8)×10-9mol/L,Bmax＝0.1061×10-9mol/g protein±0.0103×10-9mol/g protein.It was a low-affinity class GABA receptor.Conclusion:3H-GABA can be used for examination of GABA receptor in rat's brain.
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Key words:Laboratory diagnosis;GABA receptor;Microsac;3H-GABA
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是1950年发现的中枢抑制性神经递质，通过与GABA受体结合发挥其抑制功能。大脑组织中聚集了许多神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、组胺等[1]。神经末梢微囊中除含有环磷腺苷外，还含有少量的可乐亭、异丙肾上腺素、GABA等神经递质[2]。实验证明，用GABA激动剂作用于大鼠脑神经末梢微囊可增加36Cl流入微囊内[2]，用35S-叔丁基双环偶磷硫代硫酸类化合物作用大鼠神经末梢微囊也可检测GABA[3]。用3H-GABA来检测大鼠神经末梢微囊中的GABA受体，国内外尚少见报道，现将实验结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料和试剂：3H-GABA，中国科学院上海原子能研究所，放射性比强度30×103Ci/mol，放射性浓度1Ci/L；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES，N-2-Hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethane sulfonic acid)，宝灵曼产品；HEPES缓冲液(pH＝7.4)145×10-3mol/L氯化钠，5×10-3mol/L氯化钾，1×10-3mol/L氯化镁，10×10-3mol/L HEPES，10×10-3mol/L D-葡萄糖；膜片闪烁液；牛血清白蛋白，测蛋白试剂；49＃玻璃纤维滤纸，上海红光造纸厂产品。
1.2 主要仪器：液体闪烁计，LKB 1217-RACKBETA，瑞典产品，台式高速低温离心机，1.0 R，德国产品；移液器20 μl、200 μl、1 000 μl，法国产品。
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1.3 实验动物：健康雄性Wistar大鼠，体重200～250 g，第三军医大学动物实验中心提供，实验前所有动物均在实验室饲养1周以上，自由进水进食。
1.4 主要实验方法
1.4.1 大鼠脑神经末梢微囊制备[1，2]：大鼠断头取脑，称重，按1/10(W/V)加冰冷缓冲液，玻璃匀浆器中以3 500 γ/min匀浆1 min。匀浆液离心(900 g、4℃)15 min，倾去上清，沉淀用20 ml缓冲液洗一次，再离心，倾去上清，加入缓冲液10 ml，混匀，分装，液氮保存。
1.4.2 大鼠脑神经末梢微囊蛋白含量测定按Lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。
1.4.3 大鼠脑神经末梢微囊GABA受体结合实验[4，5]：冰冻大鼠脑神经末梢微囊于37℃解冻30 min，混匀。总结合组：取蛋白(终浓度1.0 g/L)于小试管中，加入30×10-9mol/L的3H-GABA，37℃反应30 min，入冰水中止反应，49＃玻璃纤维滤纸抽滤，冰冷缓冲液4 ml冲洗二次，70～80℃(20 min)烤干，加5 ml膜片闪烁液，暗化过夜，用液体闪烁计数仪进行测定。
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非特异性结合组：加入3H-GABA 2 000倍的GABA，37℃反应10 min，再加入30×10-9mol/L的3H-GABA，余同总结合组。特异性结合＝总结合-非特异性结合。
1.5 统计处理：采用微软公司的Excel程序包进行t检验分析处理。
2 结果
2.1 大鼠脑膜GABA受体特异性结合：大鼠脑膜GABA受体的总结合组与非特异性结合组的每分钟计数率分别为681.3±24.9和463.0±17.3，两者间有显著差异(P<0.01)，提示大鼠脑膜中存在有GABA受体的特异性结合位点(n＝9)。
2.2 大鼠脑膜蛋白对受体结合影响：大鼠脑膜蛋白浓度介于(0.2～1.2) g/L，GABA受体结合的每分钟计数率随着脑膜蛋白浓度的增加而趋于饱和，0.8 g/L比0.4 g/L、0.4 g/L比0.2 g/L的每分钟计数率显著增高(P<0.01)。当蛋白浓度位于1.2 g/L时，每分钟计数率最高，与0.8 g/L比较无显著性差异(P>0.05)，当蛋白浓度位于1.6 g/L时，每分钟计数率反而降低(n＝10，见图1)。
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蛋白浓度(mg/ml)
图1 蛋白浓度对GABA受体结合的影响
P<0.01 每相邻两组比较
2.3 反应时间对大鼠脑GABA受体的影响:在30 min内大鼠脑中GABA受体结合的每分种计数率随反应时间的增加显著增加。5 min比2 min、10 min比5 min、30 min比10 min，每分钟计数率均显著增高(P<0.01)。60 min与30 min比较，每分钟计数率显著降低(P<0.01)。60 min与10 min比较，两者间每分钟计数率无显著变化(P>0.05)，表明大鼠脑膜中GABA受体反应在10 min时基本接近饱和(n＝9，见图2)。
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反应时间 (min)
图2 反应时间对GABA受体结合的影响
**P<0.01 每相邻两组比较
2.4 反应温度对大鼠脑GABA受体的影响:大鼠脑中GABA受体在体外反应30 min时，当反应温度介于25℃至41℃时，各组之间的每分钟计数率无显著差异(P>0.05)。
2.5 大鼠脑中GABA受体的饱和性：大鼠脑中GABA受体随着配体用量的增加，每分钟计数率也随着增加，并出现饱和趋势，经用Scatchard作图分析，B/F与B呈线负相关(γ＝-0.9214)，大鼠脑中GABA受体的Kd值为(97.3±5.8)×10-9mol/L，Bmax值为(0.1061±0.0103)×10-9mol/g蛋白(见图3，图4)。
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配体浓度(nmol/L)
◆总结合■非特异性结合
图3 GABA受体的结合曲线
B(*10 pmol/g蛋白)
图4 GABA受体的scatchdrd分析
3 讨论
GABA受体和N-乙酰胆碱受体同属于离子通道型受体超家族I型受体[6]，它们的配体结合部位都在细胞膜外区，属膜外激活。用3H-GABA作配体作用于大脑神经末梢微囊发现，当用过量的GABA作用于膜囊后，再加入3H-GABA，两者结果有显著差异(P<0.01)，表明膜囊上有GABA特异性结合位点。进一步研究发现，该特异性结合具有饱和性，Kd＝(97.3±5.8)×10-9mol/L、Bmax＝(0.1061±0.0103)×10-9mol/g蛋白。与以前用突触膜研究GABA受体相比，其Kd值无显著差异，属低亲和力GABA受体，其Bmax值显著低于突触体中的Bmax值[3]。
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在观察最适反应条件中，发现随脑膜蛋白浓度、反应时间的增加，其GABA受体结合趋于饱和。采用1.2 g/L脑膜蛋白或作用30 min时，其受体结合达最高值。采用1.6 g/L脑膜蛋白或作用60 min，其受体结合反而稍有降低，这可能是温育过程中被标记的配体被组织降解或组织内存在有内源性配体[5]。在25～41℃下作用30 min，GABA受体结合无显著差异，表明作用30 min，受体与配体结合达到饱和，这与前人结果相一致。在0℃时，突触体膜上GABA受体与配体在5 min内结合就可达到平衡。
用3H-GABA检测大鼠神经末梢微囊中的GABA受体，不需过多的特殊仪器，操作简单、省时快速、结果可靠。与突触膜相比，该法敏感性稍差，但在研究GABA受体中仍是一种简单可行的方法。
总之，大鼠脑神经末梢微囊中存在GABA受体。其Kd值为97.3×10-9mol/L、Bmax值为0.1061×10-9mol/g蛋白，属低亲和力GABA受体。
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作者简介：彭俊华(1966-)，男，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Daly JW,McNesl E,Partington C,et al.Accumulations of cycle AMP in adenine-labeled cell-free preparations from guinea pig cerebral cortex:Role of α-adrenergic and Hl-histaminergic receptors[J].J Neurochem,1980,35(2):326-337.
[2]Adron Harris R,Allan Andrea.Function coupling of γ-aminobutyric acid receptors to chloride channels in brain membranes[J].Sci,1985,28:1108-1110.
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[3]Gant DB,Eldefrswi ME,Eldefrdwi AT.Action of organophosphate on GABAA receptors and voltsge-dependent chloride channels[J].Fundanmental and applied toxicology,1987,9:698-704.
[4]Kurioka Susunma,Hayata Hideo,Matsuda Makoto.Characterization of γ-aminobutyric acid binding site on crude synaptic membrance[J].J Neurochem,1981,37(2):283-288.
[5]周延冲.受体生物药理学[M].北京：人民卫生出版社，1985.1-124.
[6]孙志贤，林汝仙，汲言山.现代生物化学理论与研究技术[M].北京：军事医学出版社，1995.302-312.
收稿日期：1999-05-07, 百拇医药