1α，25-(OH)2维生素D3联合转化生长因子β1体外对U937细胞作用及其机理
作者：古庆利 张翼军
单位：古庆利(第三军医大学西南医院血液科，重庆 400038)张翼军(第三军医大学西南医院血液科，重庆 400038)
关键词：白血病；1α；25-(OH)2维生素D3；转化生长因子β1；U937；增殖；分化
西北国防医学杂志000105 摘 要：目的：探讨1α，25-(OH)2VitD3和/或TGF-β1在体外对U937细胞的作用。方法：应用流式细胞技术、免疫细胞化学、图像分析及原位杂交(ISH)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等方法观察不同剂量VitD3下U937细胞周期、细胞增殖及分化情况及TGF-β1mRNA和TGF-β1的表达。结果：在VitD3联合TGF-β1作用下，U937细胞增殖明显受抑，细胞阻滞于G0/G1期，与两者单独作用相比，相差显著(P<0.05)。两者联和作用时CD14阳性表达增强，强于两者单独作用时(P<0.01)。同时在VitD3作用下U937细胞显示TGF-β1mRNA和TGF-β1表达增强，与VitD3的剂量成正比。结论：VitD3有体外抗U937细胞增殖和促其分化成熟作用，联合TGF-β1后其抑制作用明显增强，并使细胞周期阻滞于G0/G1期。一定剂量范围的VitD3能促进U937细胞自分泌TGF-β1，并下调C-myc mRNA表达，这可能是VitD3联合TGF-β1诱导U937细胞分化的一个途径。
, http://www.100md.com
分类号：R 733.7 文献标识码：A
文章编号：1007-8622(2000)01-0015-03
Study on the effect of 1α，25-(OH)2 Dihydroxyvitamin and TGF-β1 on leukemic cells line U937
GU Qing-li,ZHANG Yi-jun.
(Department of Hematology,Southwest Hospital,The 3rd Military Medical University,400038)
Abstract：Objective：To observe the effect of VitD3 and/or TGF-β1 on acute promonocytic leukemia cell line U937.Methods：The cell cycle,proliferation and differentiation were studied by typanblue dye exclusion,light microscope,immunocytochemistry (ICC),flow cytometry(FCM)and image analyser.The expressions of TGF-β1 mRNA and TGF-β1 were studied by in situ hybridization(ISH)and enzyme linked immunosorbent assays(ELISA).Results：VitD3 combined with TGF-β1 could obviously inhibit the proliferation of U937 cells and interfer the growth in G0/G1 phase.These effects were significant than those using VitD3 or TGF-β1 alone (P<0.05).VitD3 combined with TGF-β1 could develop the expression of CD14 and down regulate expression of C-myc mRNA.They were also significant than those using VitD3 or TGF-β1 alone by image analysis (P<0.01).The expressions of TGF-β1 mRNA and TGF-β1 of U937 cell were developed with the development of the dose of VitD3(25,250,2 500 ng.ml-1).Conclusion：VitD3 could inhibit the proliferation and induce the differentiation of U937 cells.VitD3 combined with TGF-β1 had significant effects of inhibition on U937 cell and interfer U937 cell in G0/G1 phase.Definite dose of VitD3 could induce U937 cells to autocrine TGF-β1 and down regulate expression of C-myc mRNA.
, 百拇医药
Key words：Leukemia; 1α，25(OH)2 Dihydroxyvitamin; TGF-β1； U937； Proliferation; Differentiation ▲
急性白血病是由于各种病因致造血干/祖细胞阻滞于细胞分化不同阶段的结果。不同诱导分化剂可将不同类型的白血病细胞向相应系列的正常成熟造血细胞分化。有研究表明，某些诱导分化剂可能通过TGF-β1自分泌或旁分泌的途径或两者的协同效应对肿瘤细胞的增殖和分化起作用。本实验用1α，25(OH)2维生素D3(VitD3)联合转化生长因子β1(TGF-β1)对急性单核细胞白血病细胞株U937细胞的体外作用和机理进行初步研究，为临床上诱导分化剂及TGF-β1的应用提供理论和实验依据。
1 材料和方法
1.1 U937细胞培养和活细胞活力检测：U937细胞(上海细胞生物所)用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37℃，5%CO2条件下培养，以0.4%台盼蓝拒染实验确定细胞活力。细胞活力(%)＝活细胞数/总细胞数×100%。
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1.2 VitD3和/或TGF-β1对U937细胞抑制作用的观察：实验分6组，O组：空白对照，培养4 d；T组：加1 ng.ml-1 TGF-β1(北京中山公司)培养4 d；V组：加250 ng.ml-1VitD3(美国Abbott实验室)培养4 d；TV组：先加1ng.ml-1TGF-β1培养1 d，洗去TGF-β1后，再加250ng.ml-1 VitD3培养3 d；VT组：先加250 ng.ml-1 VitD3培养1 d，洗去VitD3后再加入1 ng.ml-1 TGF-β1培养3 d；V+T组：加入250 ng.ml-1 VitD3和1 ng.ml-1 TGF-β1共同培养4 d。每隔24 h各组计数活细胞数，并计算生长抑制率。生长抑制率(%)＝(对照组-实验组)/对照组活细胞数×100%。
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1.3 U937细胞流式细胞学观察：24、48、72、96 h各组样本常规固定、染色后用流式细胞仪进行细胞周期分析[1]。
1.4 免疫细胞化学检测CD14的表达：在第96 h时取各组细胞悬液，常规离心、漂洗、涂片、固定后，SP试剂盒免疫细胞化学染色，鼠抗人CD14抗体1∶100稀释，以0.01 mol.L-1PBS代替第一抗体作为阴性对照[2]。
1.5 ISH法测定TGF-β1 mRNA和C-myc mRNA表达：cDNA探针来自第三军医大学蒲晓允博士，测TGF-β1 mRNA实验分5组，依次加入0、2.5、25、250、2 500 ng.ml-1 VitD3,在12、24、48、72 h时检测。第96小时测c-myc mRNA表达分组同方法1.2[3，4]。
, 百拇医药
1.6 ELISA实验检测TGF-β1表达：实验分组同ISH法，取1 ml细胞离心6 000 r.min-1 ，15 min，吸200 μl上清液，-20℃冻存备用。用TGF-β1ELISA试剂盒(深圳晶美公司)检测[5]。
1.7 图像分析：将免疫细胞化学和原位杂交检测结果用图像分析仪进行分析。
1.8 统计学处理：应用t检验。
2 结果
2.1 VitD3和/或TGF-β1对U937细胞增殖的抑制作用：见图1。VT组和V+T组生长曲线明显低于对照组，而T组与对照组相似，V组和TV组则在前两者之间。
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图1 U937细胞生长曲线
2.2 细胞周期分析：V+T组和VT组主要使U937细胞阻于G0/G1期，96 h两组G0/G1期细胞分别为95.07%、94.63%，与同一时相对照组65.53%和T组63.87相比，相差非常显著(P<0.01)，且V+T组和VT组随时间推移，G0/G1期细胞逐渐增多。而V组和TV组分别为62.83%、61.77%，与对照组相比，相差不显著(P>0.05)。
2.3 细胞形态学观察：光镜下可发现V+T组、TV组和V组出现细胞分化特征，部分细胞体积变小，细胞核变小，核仁消失，核/浆比值变小。
2.4 CD14的表达：CD14在O组、T组、VT组几乎无表达或弱表达，而在V+T组、V组和TV组均有强表达，其灰度值分别是39.83±0.55，40.60±0.61。与对照组56.16±0.62相比，差异均非常明显(P<0.01)。V+T组和TV组之间灰度值无显著差别(P>0.05)，但V组中CD14的表达低于V+T组或TV组，有显著差异(P<0.05)，见表1。
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表1 96 h后各组U937细胞CD14、C-myc mRNA表达的变化 检测指标
组别
O
T
V
TV
VT
V+T
CD14
56.10±0.60
55.30±0.62
46.07±0.61
, 百拇医药
40.60±0.86
54.07±0.25
39.5±0.55
C-myc
25.83±0.32
28.90±0.78
40.40±0.46
45.67±0.61
29.30±0.80
46.93±0.37
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注：与对照组相比P<0.01；与V组相比P<0.01
2.5 各组药物作用96 h后C-myc mRNA的表达：C-myc mRNA在对照组细胞中有高表达，V+T组、TV组和V组显示C-myc mRNA表达明显下调(P<0.01)，VT组与T组C-myc mRNA表达与对照组相比无明显差异(P>0.05)，见表1。
2.6 VitD3作用下TGF-β1的表达：在对照组U937细胞中TGF-β1 mRNA基本无表达，在12～72 h间，2.5 ng.ml-1和25 ng.ml-1组无或有很弱的TGF-β1mRNA表达，而250 ng.ml-1组和 2 500 ng.ml-1组则均在12 h时就开始有TGF-β1mRNA表达上升，而后随时间的推移两组TGF-β1 mRNA表达也逐渐增强，72 h时两组的灰度值分别是22.30±1.22和21.00±0.70与对照组43.73±1.36相比有非常显著的差异(P<0.01)，另外，在相同时间2 500 ng.ml-1组明显比250 ng.ml-1组的TGF-β1表达强(P<0.01)。
, 百拇医药
2.7 VitD3作用下TGF-β1的表达(见图2)：由图可见25、250、2 500 ng.ml-1组最早在作用后第24 h才有TGF-β1表达升高，并随时间的推移逐渐升高，呈时间依赖性，而此3组不仅与24 h后同一时间对照组的TGF-β1表达有非常显著差异(P<0.01)，且相互之间比较也有显著差异，呈剂量依赖性；2.5 ng.ml-1组在12～72 h中与对照组相比无明显差异。
图2 VitD3对 TGF-β1表达的影响
3 讨论
随着对细胞因子研究的深入，人们发现许多诱导分化剂能与细胞因子协同发挥更大的生物学效应。转化生长因子β1(TGF-β1)作为正常造血负调节的核心因子，不仅作用于造血祖细胞和成熟的造血细胞，还对许多白血病细胞有程度不同的抑制效应，而TGF-β1的表达与发挥生物学效应受到许多因子包括其自身受体的调节，Sporn等[6]认为TGF-β1与类固醇受体家族、维甲酸类癌基因和抑癌基因构成统一的细胞调节网络，共同发挥功能。本实验发现TGF-β1联合VitD3可使U937细胞增殖受到明显的抑制，抑制作用远高于两者单独运用，说明两者联用有明显的协同效应。VitD3联合TGF-β1组和先VitD3后TGF-β1组都是通过阻滞U937细胞于G0/G1期这一途径来抑制增殖的，且随时间推移G0/G1期细胞呈进行性上升趋势，说明两者的抑制增殖效应还存在时间依赖性。VitD3组抑制增殖作用较弱，均未引起G0/G1期细胞增多，可能VitD3对U937细胞的抗增殖是通过其它的途径。
, 百拇医药
通过VitD3和/或TGF-β1作用U937细胞后CD14表达变化的观察可发现，VitD3联合TGF-β1组，先TGF-β1后VitD3组和VitD3组均能明显提高细胞CD14的表达，并下调C-myc mRNA表达，促进细胞分化。其中先TGF-β1后VitD3组的促分化作用与VitD3联合TGF-β1组相近，都高于VitD3组，相反，先VitD3后TGF-β1组和TGF-β1组则无明显促分化能力。这些结果表明TGF-β1本身对U937细胞无诱导分化能力，仅能提高U937细胞对VitD3促分化作用的敏感性。TGF-β1可能是通过刺激U937细胞VitD3核受体的表达促进其诱导分化的。另外，本实验首次证实了在一定剂量范围内VitD3能使U937细胞TGF-β1表达升高，具有转录和转录后调节功能，并存在时间和剂量依赖性。由于由类固醇受体家族诱导的TGF-β1都是以活性形式分泌的，结合前述TGF-β1能提高VitD3促U937细胞分化的敏感性，可以认为VitD3通过促进TGF-β1表达增高而在局部形成一个正反馈放大效应来促进诱导分化U937细胞。本实验结果为临床上应用诱导分化剂和细胞因子联合治疗白血病提供了一定的实验依据。■
, 百拇医药
作者简介：古庆利(1968—)，男，硕士
参考文献：
[1]左连富，主编.流式细胞术样品制备技术[M].北京：华夏出版社，1991.14-19.
[2]蔡文琴，王伯云，主编.实用免疫细胞化学及核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版，1994.
[3]苏慧慈，编著.原位杂交[M].北京：中国科学技术出版社，1993.
[4]宋玉华，林永敏.应用非放射性标记探针原位杂交研究人白血病细胞基因表达[J].中华血液学杂志，1993，14(2)：74-77.
[5]Danielour D.Improved sandwich enzyme-linked immunosorbent assays for transforming growth factor-β[J].J Immunol Method 1993,158：17-20.
[6]Sporn MR,Robart AB.Transforming growth factor-β：Recent progress and new challenges[J].J Cell Biol 1992,119(5)：1017-1021.
收稿日期：1999-11-02, 百拇医药
单位：古庆利(第三军医大学西南医院血液科，重庆 400038)张翼军(第三军医大学西南医院血液科，重庆 400038)
关键词：白血病；1α；25-(OH)2维生素D3；转化生长因子β1；U937；增殖；分化
西北国防医学杂志000105 摘 要：目的：探讨1α，25-(OH)2VitD3和/或TGF-β1在体外对U937细胞的作用。方法：应用流式细胞技术、免疫细胞化学、图像分析及原位杂交(ISH)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等方法观察不同剂量VitD3下U937细胞周期、细胞增殖及分化情况及TGF-β1mRNA和TGF-β1的表达。结果：在VitD3联合TGF-β1作用下，U937细胞增殖明显受抑，细胞阻滞于G0/G1期，与两者单独作用相比，相差显著(P<0.05)。两者联和作用时CD14阳性表达增强，强于两者单独作用时(P<0.01)。同时在VitD3作用下U937细胞显示TGF-β1mRNA和TGF-β1表达增强，与VitD3的剂量成正比。结论：VitD3有体外抗U937细胞增殖和促其分化成熟作用，联合TGF-β1后其抑制作用明显增强，并使细胞周期阻滞于G0/G1期。一定剂量范围的VitD3能促进U937细胞自分泌TGF-β1，并下调C-myc mRNA表达，这可能是VitD3联合TGF-β1诱导U937细胞分化的一个途径。
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分类号：R 733.7 文献标识码：A
文章编号：1007-8622(2000)01-0015-03
Study on the effect of 1α，25-(OH)2 Dihydroxyvitamin and TGF-β1 on leukemic cells line U937
GU Qing-li,ZHANG Yi-jun.
(Department of Hematology,Southwest Hospital,The 3rd Military Medical University,400038)
Abstract：Objective：To observe the effect of VitD3 and/or TGF-β1 on acute promonocytic leukemia cell line U937.Methods：The cell cycle,proliferation and differentiation were studied by typanblue dye exclusion,light microscope,immunocytochemistry (ICC),flow cytometry(FCM)and image analyser.The expressions of TGF-β1 mRNA and TGF-β1 were studied by in situ hybridization(ISH)and enzyme linked immunosorbent assays(ELISA).Results：VitD3 combined with TGF-β1 could obviously inhibit the proliferation of U937 cells and interfer the growth in G0/G1 phase.These effects were significant than those using VitD3 or TGF-β1 alone (P<0.05).VitD3 combined with TGF-β1 could develop the expression of CD14 and down regulate expression of C-myc mRNA.They were also significant than those using VitD3 or TGF-β1 alone by image analysis (P<0.01).The expressions of TGF-β1 mRNA and TGF-β1 of U937 cell were developed with the development of the dose of VitD3(25,250,2 500 ng.ml-1).Conclusion：VitD3 could inhibit the proliferation and induce the differentiation of U937 cells.VitD3 combined with TGF-β1 had significant effects of inhibition on U937 cell and interfer U937 cell in G0/G1 phase.Definite dose of VitD3 could induce U937 cells to autocrine TGF-β1 and down regulate expression of C-myc mRNA.
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Key words：Leukemia; 1α，25(OH)2 Dihydroxyvitamin; TGF-β1； U937； Proliferation; Differentiation ▲
急性白血病是由于各种病因致造血干/祖细胞阻滞于细胞分化不同阶段的结果。不同诱导分化剂可将不同类型的白血病细胞向相应系列的正常成熟造血细胞分化。有研究表明，某些诱导分化剂可能通过TGF-β1自分泌或旁分泌的途径或两者的协同效应对肿瘤细胞的增殖和分化起作用。本实验用1α，25(OH)2维生素D3(VitD3)联合转化生长因子β1(TGF-β1)对急性单核细胞白血病细胞株U937细胞的体外作用和机理进行初步研究，为临床上诱导分化剂及TGF-β1的应用提供理论和实验依据。
1 材料和方法
1.1 U937细胞培养和活细胞活力检测：U937细胞(上海细胞生物所)用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37℃，5%CO2条件下培养，以0.4%台盼蓝拒染实验确定细胞活力。细胞活力(%)＝活细胞数/总细胞数×100%。
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1.2 VitD3和/或TGF-β1对U937细胞抑制作用的观察：实验分6组，O组：空白对照，培养4 d；T组：加1 ng.ml-1 TGF-β1(北京中山公司)培养4 d；V组：加250 ng.ml-1VitD3(美国Abbott实验室)培养4 d；TV组：先加1ng.ml-1TGF-β1培养1 d，洗去TGF-β1后，再加250ng.ml-1 VitD3培养3 d；VT组：先加250 ng.ml-1 VitD3培养1 d，洗去VitD3后再加入1 ng.ml-1 TGF-β1培养3 d；V+T组：加入250 ng.ml-1 VitD3和1 ng.ml-1 TGF-β1共同培养4 d。每隔24 h各组计数活细胞数，并计算生长抑制率。生长抑制率(%)＝(对照组-实验组)/对照组活细胞数×100%。
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1.3 U937细胞流式细胞学观察：24、48、72、96 h各组样本常规固定、染色后用流式细胞仪进行细胞周期分析[1]。
1.4 免疫细胞化学检测CD14的表达：在第96 h时取各组细胞悬液，常规离心、漂洗、涂片、固定后，SP试剂盒免疫细胞化学染色，鼠抗人CD14抗体1∶100稀释，以0.01 mol.L-1PBS代替第一抗体作为阴性对照[2]。
1.5 ISH法测定TGF-β1 mRNA和C-myc mRNA表达：cDNA探针来自第三军医大学蒲晓允博士，测TGF-β1 mRNA实验分5组，依次加入0、2.5、25、250、2 500 ng.ml-1 VitD3,在12、24、48、72 h时检测。第96小时测c-myc mRNA表达分组同方法1.2[3，4]。
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1.6 ELISA实验检测TGF-β1表达：实验分组同ISH法，取1 ml细胞离心6 000 r.min-1 ，15 min，吸200 μl上清液，-20℃冻存备用。用TGF-β1ELISA试剂盒(深圳晶美公司)检测[5]。
1.7 图像分析：将免疫细胞化学和原位杂交检测结果用图像分析仪进行分析。
1.8 统计学处理：应用t检验。
2 结果
2.1 VitD3和/或TGF-β1对U937细胞增殖的抑制作用：见图1。VT组和V+T组生长曲线明显低于对照组，而T组与对照组相似，V组和TV组则在前两者之间。
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图1 U937细胞生长曲线
2.2 细胞周期分析：V+T组和VT组主要使U937细胞阻于G0/G1期，96 h两组G0/G1期细胞分别为95.07%、94.63%，与同一时相对照组65.53%和T组63.87相比，相差非常显著(P<0.01)，且V+T组和VT组随时间推移，G0/G1期细胞逐渐增多。而V组和TV组分别为62.83%、61.77%，与对照组相比，相差不显著(P>0.05)。
2.3 细胞形态学观察：光镜下可发现V+T组、TV组和V组出现细胞分化特征，部分细胞体积变小，细胞核变小，核仁消失，核/浆比值变小。
2.4 CD14的表达：CD14在O组、T组、VT组几乎无表达或弱表达，而在V+T组、V组和TV组均有强表达，其灰度值分别是39.83±0.55，40.60±0.61。与对照组56.16±0.62相比，差异均非常明显(P<0.01)。V+T组和TV组之间灰度值无显著差别(P>0.05)，但V组中CD14的表达低于V+T组或TV组，有显著差异(P<0.05)，见表1。
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表1 96 h后各组U937细胞CD14、C-myc mRNA表达的变化 检测指标
组别
O
T
V
TV
VT
V+T
CD14
56.10±0.60
55.30±0.62
46.07±0.61
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40.60±0.86
54.07±0.25
39.5±0.55
C-myc
25.83±0.32
28.90±0.78
40.40±0.46
45.67±0.61
29.30±0.80
46.93±0.37
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注：与对照组相比P<0.01；与V组相比P<0.01
2.5 各组药物作用96 h后C-myc mRNA的表达：C-myc mRNA在对照组细胞中有高表达，V+T组、TV组和V组显示C-myc mRNA表达明显下调(P<0.01)，VT组与T组C-myc mRNA表达与对照组相比无明显差异(P>0.05)，见表1。
2.6 VitD3作用下TGF-β1的表达：在对照组U937细胞中TGF-β1 mRNA基本无表达，在12～72 h间，2.5 ng.ml-1和25 ng.ml-1组无或有很弱的TGF-β1mRNA表达，而250 ng.ml-1组和 2 500 ng.ml-1组则均在12 h时就开始有TGF-β1mRNA表达上升，而后随时间的推移两组TGF-β1 mRNA表达也逐渐增强，72 h时两组的灰度值分别是22.30±1.22和21.00±0.70与对照组43.73±1.36相比有非常显著的差异(P<0.01)，另外，在相同时间2 500 ng.ml-1组明显比250 ng.ml-1组的TGF-β1表达强(P<0.01)。
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2.7 VitD3作用下TGF-β1的表达(见图2)：由图可见25、250、2 500 ng.ml-1组最早在作用后第24 h才有TGF-β1表达升高，并随时间的推移逐渐升高，呈时间依赖性，而此3组不仅与24 h后同一时间对照组的TGF-β1表达有非常显著差异(P<0.01)，且相互之间比较也有显著差异，呈剂量依赖性；2.5 ng.ml-1组在12～72 h中与对照组相比无明显差异。
图2 VitD3对 TGF-β1表达的影响
3 讨论
随着对细胞因子研究的深入，人们发现许多诱导分化剂能与细胞因子协同发挥更大的生物学效应。转化生长因子β1(TGF-β1)作为正常造血负调节的核心因子，不仅作用于造血祖细胞和成熟的造血细胞，还对许多白血病细胞有程度不同的抑制效应，而TGF-β1的表达与发挥生物学效应受到许多因子包括其自身受体的调节，Sporn等[6]认为TGF-β1与类固醇受体家族、维甲酸类癌基因和抑癌基因构成统一的细胞调节网络，共同发挥功能。本实验发现TGF-β1联合VitD3可使U937细胞增殖受到明显的抑制，抑制作用远高于两者单独运用，说明两者联用有明显的协同效应。VitD3联合TGF-β1组和先VitD3后TGF-β1组都是通过阻滞U937细胞于G0/G1期这一途径来抑制增殖的，且随时间推移G0/G1期细胞呈进行性上升趋势，说明两者的抑制增殖效应还存在时间依赖性。VitD3组抑制增殖作用较弱，均未引起G0/G1期细胞增多，可能VitD3对U937细胞的抗增殖是通过其它的途径。
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通过VitD3和/或TGF-β1作用U937细胞后CD14表达变化的观察可发现，VitD3联合TGF-β1组，先TGF-β1后VitD3组和VitD3组均能明显提高细胞CD14的表达，并下调C-myc mRNA表达，促进细胞分化。其中先TGF-β1后VitD3组的促分化作用与VitD3联合TGF-β1组相近，都高于VitD3组，相反，先VitD3后TGF-β1组和TGF-β1组则无明显促分化能力。这些结果表明TGF-β1本身对U937细胞无诱导分化能力，仅能提高U937细胞对VitD3促分化作用的敏感性。TGF-β1可能是通过刺激U937细胞VitD3核受体的表达促进其诱导分化的。另外，本实验首次证实了在一定剂量范围内VitD3能使U937细胞TGF-β1表达升高，具有转录和转录后调节功能，并存在时间和剂量依赖性。由于由类固醇受体家族诱导的TGF-β1都是以活性形式分泌的，结合前述TGF-β1能提高VitD3促U937细胞分化的敏感性，可以认为VitD3通过促进TGF-β1表达增高而在局部形成一个正反馈放大效应来促进诱导分化U937细胞。本实验结果为临床上应用诱导分化剂和细胞因子联合治疗白血病提供了一定的实验依据。■
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作者简介：古庆利(1968—)，男，硕士
参考文献：
[1]左连富，主编.流式细胞术样品制备技术[M].北京：华夏出版社，1991.14-19.
[2]蔡文琴，王伯云，主编.实用免疫细胞化学及核酸分子杂交技术[M].成都：四川科学技术出版，1994.
[3]苏慧慈，编著.原位杂交[M].北京：中国科学技术出版社，1993.
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收稿日期：1999-11-02, 百拇医药