5-羟色胺及其受体在人肝癌细胞系HCC-9204上的免疫组织化学定位
作者：张冲 高秋菊
单位：张冲(解放军第三医院，陕西 宝鸡 721004)高秋菊(解放军第三医院，陕西 宝鸡 721004)
关键词：肝细胞癌；5-羟色胺；受体；细胞培养
5摘 要：目的：探讨5-羟色胺及其受体与人肝细胞性肝癌之间的关系。方法：应用免疫组织化学SABC法对培养的人肝癌细胞系HCC-9204细胞爬片进行染色。结果：5-羟色胺及其受体在肝癌细胞上皆有表达，其分布范围大体一致，结论：5-羟色胺可能参与人肝细胞性肝癌的增殖，HCC-9204细胞系可以作为研究5-羟色胺与肝癌关系的一种有用材料。
分类号：R 735.7 文献标识码：A
文章编号：1007-8622(2000)01-0042-02
, http://www.100md.com
Immunohistochemical localization of 5-hydroxytryptamine and its receptor in the cultured human hepatocellular carcinoma cell line HCC-9204
ZHANG Chong,GAO Qiu-ju.
(The 3rd Hospital,PLA,721004)
Abstract：Objective：To investigate the relationship among 5-HT,its receptor and human hepatocarcinoma.Methods：20 of cultured HCC-9204 cell line crawling slides were stained by Immunohistochemical SABC method.Results：Both 5-HT and its receptor were expressed in carcinoma cells and the positive localization were similar.the positive substances were located in cytoplasm but the nuclei were negative.The distribution and staining density of 5-HT and its receptor in carcinoma cell had no clear differences.Conclusion：5-HT may be involved in the proliferation of human hepatocellular carcinoma,and HCC-9204 is a useful material for studying the relationship between 5-HT and human hepatocellular carcinoma.
, 百拇医药
Key words：Hepatocellular carcinoma； 5-hydroxytryptamine； Receptor； Cell culture▲
近年研究表明，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)不仅是一种神经递质，还是一种有效的丝裂原，对于多种肿瘤细胞，如结肠癌、小细胞肺癌等都有较强的促增殖作用[1，2]。我们对手术切除的人肝细胞性肝癌标本进行了免疫组织化学染色，发现在肝癌细胞中5-羟色胺及其受体皆有表达[3]。为进一步探讨5-羟色胺及其受体与人肝癌之间的关系，寻找有用的实验材料，我们对人肝细胞性肝癌细胞系HCC-9204进行了免疫组织化学染色。
1 材料与方法
1.1 细胞株与抗体来源：人肝癌HCC-9204细胞株及大鼠肝癌FSK-7902细胞株分别由第四军医大学病理学教研室和组织胚胎学教研室提供；兔抗5-HT抗体及兔抗5-HT抗独特型抗体由第四军医大学组织胚胎学教研室研制，使用效价分别为1∶100和1∶200；SABC试剂盒：武汉博士德(Boster)公司产品。
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1.2 肿瘤细胞的培养：大鼠肝癌FSK-7902细胞及人肝癌HCC-9204细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养，于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长，以0.25%胰酶消化液消化传代。
1.3 人肝细胞性肝癌HCC-9204的免疫组织化学染色
1.3.1 细胞准备与固定：取对数生长的HCC-9204细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先放置4张7 mm×22 mm盖玻片的培养瓶中，置于CO2孵箱中培养2d，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，浸入PBS(0.01 mol.L-1，pH7.4)洗2次，置于95%酒精中固定20 min。
1.3.2 细胞爬片的免疫组化染色：按照文献介绍的方法并加以改进[4]。
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对照实验：用PBS作为空白对照；对大鼠肝癌细胞系FSK-7902用相同方法进行染色；用Olymbus BHS显微镜下观察实验结果并拍照。
2 结果
在染色的20张细胞片中，10张为5-HT染色，10张为5-HTR染色，20张标本皆为阳性，5-HT及5-HT受体免疫反应阳性的细胞呈棕褐色，背景呈淡黄色或不着色，阳性细胞很易辨认。5-HT与5-HTR的免疫反应阳性物质的分布范围大体一致。其中梭形细胞的5-HTR的表达较为强烈。大鼠肝癌细胞系FSK-7902结果与此相同。
3 讨论
本研究应用免疫组织化学SABC法观察到5-HT及其受体在人肝癌细胞系HCC-9204和大鼠肝癌细胞系FSK-7902中皆有表达。二者在肝癌细胞中均定位于胞浆，分布范围大体一致，且在靠近胞膜处有较强的表达。5-HT及其受体在肝癌细胞中的同时表达，提示肝癌细胞可能存在自分泌5-HT的机制。对于受体定位研究的方法有多种，包括放射性配体标记结合法、抗受体抗体免疫组织化学染色法和(AB2)免疫组织化学染色法等。由于本研究应用的兔抗5-HT抗独特型抗体经鉴定是一种β型抗独特型抗体，AB2β抗独特型抗体具有抗原“内影象”(internal image)的作用，与模拟抗原之间有着较高的同源性[5]，主要能与5-HT1和5-HT2受体进行特异性结合，故本研究所定位的5-HT受体主要是5-HT1和5-HT2受体。
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近年来研究表明，5-HT1和5HT2受体属于G-蛋白偶联受体，具有七段跨膜螺旋结构；5-HT具有多种不同的亚型，5-HT与不同的受体亚型结合，可以产生不同的生理效应[6，7]。从目前的文献来看，对于5-HT及其受体与肿瘤关系的研究主要集中在5-HT1与5-HT2受体上，其中5-HT1受体的效应酶为腺苷环化酶，可促使cAMP下降；5HT2受体的效应酶为磷脂酶C，可促使肌醇三磷酸增多[6～8]。JuliusD等[9]将5-HT1C(现称为5HT2C)受体导入成纤维细胞并使其表达，可导致成纤维细胞向恶性转化，说明5-HT可与特定的受体作用，促使正常细胞癌变。5-HT作为一种丝裂原促使多种肿瘤细胞增殖，已被许多实验所证实。Launay-JM等[10]的研究表明，5-HT的丝裂原活性主要与依赖5-HT2受体刺激的磷脂酶C-β或蛋白激酶C有关，蛋白激酶的级联反应可促使转录因子磷酸化使细胞分裂，在小鼠的成纤维细胞上如果有较高的受体密度，则5-HT2C和5-HT2A受体都具有5-HT诱导的有丝分裂原效应。推测在肝癌细胞中可能存在类似的机制。
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我们曾对人肝细胞性肝癌进行免疫组织化学染色，发现在该种细胞上有5-HT及其受体存在，且有着较高的表达。在此基础上，对人肝癌细胞HCC-9204又进行了染色，发现在这种受体上5-HT及其受体有同样高的表达，其分布范围与在人组织原位大体相同。实验表明，5-HT及其受体在人肝癌细胞系HCC-9204上同时存在，提示肝癌细胞可能通过自分泌5-HT的机制来促进增殖。同时，人肝癌细胞系HCC-9204亦可以作为研究5-HT与肝癌关系的一种极为有用的材料。
作者简介：张冲(1967—)，男，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Gould VE,Lee I,Warren WH.Immunohistochemical evaluation of neuroendocrine cells and neoplasms of the lung[J].Pathol Res Pract,1988，183(2)：200-213.
, 百拇医药
[2]Arend JW,Wiggers T,Verstijnen K,et al.The occurrence and clinicopathological significance of serotonin immunoreactive cells in large bowel carcinoma[J].J Patho,1986，149(2)：97-102.
[3]张 冲，张金山，黄威权，等.5-羟色胺及其受体在人肝细胞性肝癌上的免疫组织化学定位[J].第四军医大学学报，1997(增刊)：74-76.
[4]司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司西安分公司出版，1996.186-187.
[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for celluar growth and survial：Application to proliferation and cytotoxicity[J].J Immunol Methods,1983，65(6)：55-63.
, http://www.100md.com
[6]Zifa E,Fillion G.5-Hydroxytryptamine receptor[J].Pharacol Rew,1992,44(3)：401-458.
[7]袁玉民，胡国渊.5-HT3受体的生理学特性和分子生物学[J].生命科学，1996，8(1)：6-9.
[8]林其谁.跨膜信号传导[J].生命科学，1996，8(1)：1-6.
[9]Julius D,Livelli TT,Jessell TM,et al.Ectopic expression of serotonin 1C receptor and trigging of malignant transforming[J].Science,1989,244：1057-1058.
[10]Launay JM,Birraux G,Bondoux D,et al.Ras involvement in singal tranduction by serotonin 5-HT2B receptor[J].J Biol Chem,1996，271(16)：3141.
收稿日期：1999-12-10, 百拇医药
单位：张冲(解放军第三医院，陕西 宝鸡 721004)高秋菊(解放军第三医院，陕西 宝鸡 721004)
关键词：肝细胞癌；5-羟色胺；受体；细胞培养
5摘 要：目的：探讨5-羟色胺及其受体与人肝细胞性肝癌之间的关系。方法：应用免疫组织化学SABC法对培养的人肝癌细胞系HCC-9204细胞爬片进行染色。结果：5-羟色胺及其受体在肝癌细胞上皆有表达，其分布范围大体一致，结论：5-羟色胺可能参与人肝细胞性肝癌的增殖，HCC-9204细胞系可以作为研究5-羟色胺与肝癌关系的一种有用材料。
分类号：R 735.7 文献标识码：A
文章编号：1007-8622(2000)01-0042-02
, http://www.100md.com
Immunohistochemical localization of 5-hydroxytryptamine and its receptor in the cultured human hepatocellular carcinoma cell line HCC-9204
ZHANG Chong,GAO Qiu-ju.
(The 3rd Hospital,PLA,721004)
Abstract：Objective：To investigate the relationship among 5-HT,its receptor and human hepatocarcinoma.Methods：20 of cultured HCC-9204 cell line crawling slides were stained by Immunohistochemical SABC method.Results：Both 5-HT and its receptor were expressed in carcinoma cells and the positive localization were similar.the positive substances were located in cytoplasm but the nuclei were negative.The distribution and staining density of 5-HT and its receptor in carcinoma cell had no clear differences.Conclusion：5-HT may be involved in the proliferation of human hepatocellular carcinoma,and HCC-9204 is a useful material for studying the relationship between 5-HT and human hepatocellular carcinoma.
, 百拇医药
Key words：Hepatocellular carcinoma； 5-hydroxytryptamine； Receptor； Cell culture▲
近年研究表明，5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)不仅是一种神经递质，还是一种有效的丝裂原，对于多种肿瘤细胞，如结肠癌、小细胞肺癌等都有较强的促增殖作用[1，2]。我们对手术切除的人肝细胞性肝癌标本进行了免疫组织化学染色，发现在肝癌细胞中5-羟色胺及其受体皆有表达[3]。为进一步探讨5-羟色胺及其受体与人肝癌之间的关系，寻找有用的实验材料，我们对人肝细胞性肝癌细胞系HCC-9204进行了免疫组织化学染色。
1 材料与方法
1.1 细胞株与抗体来源：人肝癌HCC-9204细胞株及大鼠肝癌FSK-7902细胞株分别由第四军医大学病理学教研室和组织胚胎学教研室提供；兔抗5-HT抗体及兔抗5-HT抗独特型抗体由第四军医大学组织胚胎学教研室研制，使用效价分别为1∶100和1∶200；SABC试剂盒：武汉博士德(Boster)公司产品。
, http://www.100md.com
1.2 肿瘤细胞的培养：大鼠肝癌FSK-7902细胞及人肝癌HCC-9204细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养，于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中贴壁生长，以0.25%胰酶消化液消化传代。
1.3 人肝细胞性肝癌HCC-9204的免疫组织化学染色
1.3.1 细胞准备与固定：取对数生长的HCC-9204细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先放置4张7 mm×22 mm盖玻片的培养瓶中，置于CO2孵箱中培养2d，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，浸入PBS(0.01 mol.L-1，pH7.4)洗2次，置于95%酒精中固定20 min。
1.3.2 细胞爬片的免疫组化染色：按照文献介绍的方法并加以改进[4]。
, 百拇医药
对照实验：用PBS作为空白对照；对大鼠肝癌细胞系FSK-7902用相同方法进行染色；用Olymbus BHS显微镜下观察实验结果并拍照。
2 结果
在染色的20张细胞片中，10张为5-HT染色，10张为5-HTR染色，20张标本皆为阳性，5-HT及5-HT受体免疫反应阳性的细胞呈棕褐色，背景呈淡黄色或不着色，阳性细胞很易辨认。5-HT与5-HTR的免疫反应阳性物质的分布范围大体一致。其中梭形细胞的5-HTR的表达较为强烈。大鼠肝癌细胞系FSK-7902结果与此相同。
3 讨论
本研究应用免疫组织化学SABC法观察到5-HT及其受体在人肝癌细胞系HCC-9204和大鼠肝癌细胞系FSK-7902中皆有表达。二者在肝癌细胞中均定位于胞浆，分布范围大体一致，且在靠近胞膜处有较强的表达。5-HT及其受体在肝癌细胞中的同时表达，提示肝癌细胞可能存在自分泌5-HT的机制。对于受体定位研究的方法有多种，包括放射性配体标记结合法、抗受体抗体免疫组织化学染色法和(AB2)免疫组织化学染色法等。由于本研究应用的兔抗5-HT抗独特型抗体经鉴定是一种β型抗独特型抗体，AB2β抗独特型抗体具有抗原“内影象”(internal image)的作用，与模拟抗原之间有着较高的同源性[5]，主要能与5-HT1和5-HT2受体进行特异性结合，故本研究所定位的5-HT受体主要是5-HT1和5-HT2受体。
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近年来研究表明，5-HT1和5HT2受体属于G-蛋白偶联受体，具有七段跨膜螺旋结构；5-HT具有多种不同的亚型，5-HT与不同的受体亚型结合，可以产生不同的生理效应[6，7]。从目前的文献来看，对于5-HT及其受体与肿瘤关系的研究主要集中在5-HT1与5-HT2受体上，其中5-HT1受体的效应酶为腺苷环化酶，可促使cAMP下降；5HT2受体的效应酶为磷脂酶C，可促使肌醇三磷酸增多[6～8]。JuliusD等[9]将5-HT1C(现称为5HT2C)受体导入成纤维细胞并使其表达，可导致成纤维细胞向恶性转化，说明5-HT可与特定的受体作用，促使正常细胞癌变。5-HT作为一种丝裂原促使多种肿瘤细胞增殖，已被许多实验所证实。Launay-JM等[10]的研究表明，5-HT的丝裂原活性主要与依赖5-HT2受体刺激的磷脂酶C-β或蛋白激酶C有关，蛋白激酶的级联反应可促使转录因子磷酸化使细胞分裂，在小鼠的成纤维细胞上如果有较高的受体密度，则5-HT2C和5-HT2A受体都具有5-HT诱导的有丝分裂原效应。推测在肝癌细胞中可能存在类似的机制。
, http://www.100md.com
我们曾对人肝细胞性肝癌进行免疫组织化学染色，发现在该种细胞上有5-HT及其受体存在，且有着较高的表达。在此基础上，对人肝癌细胞HCC-9204又进行了染色，发现在这种受体上5-HT及其受体有同样高的表达，其分布范围与在人组织原位大体相同。实验表明，5-HT及其受体在人肝癌细胞系HCC-9204上同时存在，提示肝癌细胞可能通过自分泌5-HT的机制来促进增殖。同时，人肝癌细胞系HCC-9204亦可以作为研究5-HT与肝癌关系的一种极为有用的材料。
作者简介：张冲(1967—)，男，硕士，主治医师
参考文献：
[1]Gould VE,Lee I,Warren WH.Immunohistochemical evaluation of neuroendocrine cells and neoplasms of the lung[J].Pathol Res Pract,1988，183(2)：200-213.
, 百拇医药
[2]Arend JW,Wiggers T,Verstijnen K,et al.The occurrence and clinicopathological significance of serotonin immunoreactive cells in large bowel carcinoma[J].J Patho,1986，149(2)：97-102.
[3]张 冲，张金山，黄威权，等.5-羟色胺及其受体在人肝细胞性肝癌上的免疫组织化学定位[J].第四军医大学学报，1997(增刊)：74-76.
[4]司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司西安分公司出版，1996.186-187.
[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for celluar growth and survial：Application to proliferation and cytotoxicity[J].J Immunol Methods,1983，65(6)：55-63.
, http://www.100md.com
[6]Zifa E,Fillion G.5-Hydroxytryptamine receptor[J].Pharacol Rew,1992,44(3)：401-458.
[7]袁玉民，胡国渊.5-HT3受体的生理学特性和分子生物学[J].生命科学，1996，8(1)：6-9.
[8]林其谁.跨膜信号传导[J].生命科学，1996，8(1)：1-6.
[9]Julius D,Livelli TT,Jessell TM,et al.Ectopic expression of serotonin 1C receptor and trigging of malignant transforming[J].Science,1989,244：1057-1058.
[10]Launay JM,Birraux G,Bondoux D,et al.Ras involvement in singal tranduction by serotonin 5-HT2B receptor[J].J Biol Chem,1996，271(16)：3141.
收稿日期：1999-12-10, 百拇医药