骨软骨组织中Ⅰ、Ⅱ型胶原基因表达的检测
作者：陈克明 葛宝丰 刘兴炎 王勇 白孟海
单位：陈克明(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；葛宝丰(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；刘兴炎(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；王勇(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；白孟海(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)
关键词：实验室诊断；原位杂交；基因表达；骨
西北国防医学杂志000322 摘要：目的：用原位杂交法研究骨和软骨组织中Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达。方法：以与Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型胶原mRNA特异性互补的寡核苷酸序列为探针，用末端转移酶将地高辛标记于3′-末端，在兔胫骨近端组织切片上进行Northen原位杂交，检测关节软骨、骺板和新生骨小梁区三种胶原基因的表达情况。结果：关节软骨和骺板区均检测到软骨细胞中有ⅡB型胶原基因表达，新生骨小梁区检测到成骨细胞中有Ⅰ型胶原基因表达。结论：本实验方法灵敏度高，结果可靠，是研究与骨病和骨发生发育相关的胶原基因表达的有力工具。
, 百拇医药
中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0216-03
Detection of typeⅠand type Ⅱ collagen mRNA in bone and cartilage by in situ hybridization
CHEN Ke-ming,GE Bao-feng,LIU Xing-yan,et al.
(Institute of Traumatology and Orthopadics,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA，730050)
Abstract:Objective:To investigate gene expression of typeⅠand type Ⅱcollagen in bone and cartilage by in situ hybridization.Methods:Three oligonucleotide probes which were specific seperately for typeⅠ,type ⅡA and type ⅡB collagen mRNA were sythesized with DNA synthesizer,and labelled at 3'-end by DIG-ddUTP. The specimens of normal rabbit trabecula were cut into 5 μm sections and hybridized with the oligonucleotide probes.Results:TypeⅡB collagen mRNA was clearly demonstrated in chondrocytes in articular cartilage and epiphysis,typeⅠ collagen mRNA was localized in osteoblasts lining in surface of newly produced trabecula.Conclusion:With higher sensitivity and reliable result,it might be a good method to further study the relationship between collagen gene expression and bone disease and osteogenesis.
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Key words:Laboratory diagnosis； In situ hybridization； Gene expression； Bone
胶原是骨和软骨组织中最重要的蛋白质大分子之一，胶原代谢和基因表达异常可导致许多骨病的发生。长期以来人们已在骨胶原的分子组成、结构、功能和基因克隆等方面作了大量研究，但目前关于胶原基因在体内的表达，尤其是原位水平的表达研究还较少。本文应用地高辛标记的寡核苷酸探针检测了兔长骨骨骺端软骨和骨组织中Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达情况。
1 材料与方法
1.1 组织切片的制备：3月龄新西兰大白兔用4%多聚甲醛灌注固定致死，截取双侧胫骨近端进行后固定(4℃)，用锯型切片机(Leica sp1600)纵向切成2～3 mm的薄片，置10%EDTA中脱钙1周(4℃)，常规脱水，石蜡包埋，切成5 μm的切片，捞于经多聚赖氨酸溶液处理的切片上。
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1.2 寡核苷酸探针及标记：Ⅰ型胶原探针采用d'Alessio等报道的序列[1]：5′-GATTGTGGGATGTCTTCGTCTT-3′；Ⅱ型胶原探针采用Ryan 和Sandell报道的序列[2]，即ⅡA型：5′-TGCCAGCCTCCTGGACATCCTGGC-3′；ⅡB型：5′-CTCCTGGTTGCCGGACATCCTGGC-3′,均由赛百胜公司用DNA合成仪合成，Cartridge柱纯化。探针采用非放射性同位素法标记，用宝灵曼公司产品DIG-Oligonucleotide 3'End Labelling Kit将地高辛标记于探针的3′-末端。
1.3 原位杂交：切片脱蜡至水后，依次用0.2N盐酸处理20 min，蛋白酶K消化20 min，0.2%甘氨酸终止消化，4%多聚甲醛后固定30 min，乙酰化处理10 min，乙醇逐级脱水干燥。滴加预杂交液(50%去离子甲酰胺，300mMNacl，10 mMTris，lmMEDTA，1×Denhardt's,100 μg.ml-1ssDNA)，于37℃孵育1 h，甩弃预杂交液，滴加含2 ng.ml-1探针的杂交液(杂交液加10%硫酸葡聚糖)，于37℃湿盒内孵育过夜。杂交后切片用下列溶液依次各洗涤30 min：5×SSC，2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，0.25×SSC。免疫显色应用宝灵曼公司的Dig Nucleic Acid Detection Kit，最后于4℃避光条件下显色16～20 h，TE终止反应，甘油-明胶封固剂封片。以下列反应作为阴性对照：与非特异性寡核苷酸探针(Labelling Kit 内含)杂交；与不含探针的杂交液杂交；与未标记探针杂交。结果判定：阳性反应信号为胞浆中出现紫蓝色颗粒。
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2 结果
2.1 骺板区：阳性细胞主要分布于增殖区和肥大区，增殖区细胞呈扁平状，紫蓝色颗粒位于细胞核两侧。肥大区软骨细胞呈圆形，信号颗粒呈环状或放射状包绕于细胞核周围。此区ⅡB型胶原基因表达呈阳性，Ⅰ型、ⅡA型和各项对照试验均为阴性。(图1、2)
图1 骺板增殖区和肥大区软骨细胞中ⅡB型胶原基因表达阳性，胞浆中深染的阳性颗粒位于细胞两端或包绕于胞核周围 400×
图2 骺板区阴性对照试验结果，软骨细胞细胞核染成淡紫蓝色 400×
2.2 关节软骨区：关节软骨基质极易着色，非特异性地形成深紫蓝色背景，对结果有一定影响。在高倍镜下可观察到软骨细胞胞浆中深染的阳性信号颗粒。此区ⅡB胶原基因检测结果呈阳性，以关节表层和中层软骨细胞的表达信号最强(图3)。
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图3 关节软骨细胞中ⅡB型胶原基因表达阳性，阳性信号颗粒
包绕于细胞核周围 400×
2.3 新生骨小梁区：此区Ⅰ型胶原基因表达呈阳性，阳性信号颗粒位于沿骨小梁表面排列的成骨细胞内，成骨细胞胞浆丰富，胞核位于细胞一侧且几乎不着色，而胞浆内密布紫蓝色点状颗粒(图4)。
图4 新生骨小梁表面的成骨细胞中Ⅰ型胶原基因表达阳性，胞浆全部染成深紫蓝色，胞核几不着色 400×
3 讨论
Ⅰ、Ⅱ型胶原分别是骨和软骨的主要胶原类型，Ⅰ型胶原基因的表达与成骨活动关系密切，其mRNA的出现早于碱性磷酸酶和骨钙素，是成骨细胞早期分化的特异性分子标记[3]。Ⅱ型胶原约占软骨胶原总量的90%以上，其基因过度表达可使胶原与蛋白聚糖的比例失调，引发骨性关节炎。Ⅱ型胶原基因在转录过程中由于外显子之间拼接方式的不同而产生两种mRNA，即ⅡA型和ⅡB型，它们分别表达于不同类型软骨细胞中。ⅡB型是关节软骨即透明软骨的特异性胶原类型[4]。
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原位杂交法是由DNA重组技术与免疫组化方法相结合而产生的一种在单细胞水平上检测特定基因表达情况的技术，是研究基因表达及其分布的有力工具，目前正得到日益广泛的应用[5]。由于RNA或CDNA探针常难以得到，而寡核苷酸探针可以用DNA合成仪合成，故可在一般实验室应用。本实验根据文献报道的寡核苷酸序列，通过商品途径进行合成，获得Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型三种寡核苷酸探针，并用无放射性危害的地高辛进行末端标记，结果所显示ⅡA、ⅡB型胶原基因表达与Sandell等人采用放射性同位素法标记相同，Ⅰ型胶原基因表达与Neo等人采用RNA探针检测的结果相同[6]，说明本实验方法能够准确反映骨组织中胶原基因的表达，可用于深入研究与胶原相关的骨病和骨发生发育过程。
作者简介：陈克明(1968—)，男，硕士，主管技师
参考文献：
[1]d'Allessio MM,Bernard V,Benson-Chanda ML, et al.Complete nucleotide sequence of the region encompassing the first twenty-five exons of the human pro-αⅠ(Ⅰ) collagen(col 1A)[J].Gene,1988，67：105-115.
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[2]Ryan MC， Sandell LJ.Differential expression of a cysteine-rich domain in the amino-terminal propeptide of typeⅡ(cartilage) procollagen by alternative splicing of mRNA[J].J Biochem,1990,265:10334-10339.
[3]Atkinson BL,Fantle KS,Benedict JJ,et al.Combination of osteoinductive bone proteins differentiates mensenchymal C3H/10T1/2 cells specifically to the cartilage lineage[J].J Cell Biochem,1997,65(3):325-339.
[4]Sandell LJ,Morris N,Robbins JR,et al.Alternatively spliced typeⅡ procollagen mRNAs define distinct populations of cells during vertebral development:differential expression of the amino-propeptide[J].J Cell Biol,1991,114:1307-1319.
[5]青 春，姚 敏，陆树良，等.大鼠深度烫伤后局部组织中PDGFmRNA表达水平[J].西北国防医学杂志，1999，20(4)：249-251.
[6]Neo M,Voigt CF,Herbst H,et al.Analysis of osteoblast activity at biomaterial-bone interfaces by in situ hybridization[J].J Biolmed Mater Reser,1996,30:485-492.
收稿日期：2000-01-18, http://www.100md.com
单位：陈克明(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；葛宝丰(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；刘兴炎(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；王勇(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)；白孟海(兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050)
关键词：实验室诊断；原位杂交；基因表达；骨
西北国防医学杂志000322 摘要：目的：用原位杂交法研究骨和软骨组织中Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达。方法：以与Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型胶原mRNA特异性互补的寡核苷酸序列为探针，用末端转移酶将地高辛标记于3′-末端，在兔胫骨近端组织切片上进行Northen原位杂交，检测关节软骨、骺板和新生骨小梁区三种胶原基因的表达情况。结果：关节软骨和骺板区均检测到软骨细胞中有ⅡB型胶原基因表达，新生骨小梁区检测到成骨细胞中有Ⅰ型胶原基因表达。结论：本实验方法灵敏度高，结果可靠，是研究与骨病和骨发生发育相关的胶原基因表达的有力工具。
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中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0216-03
Detection of typeⅠand type Ⅱ collagen mRNA in bone and cartilage by in situ hybridization
CHEN Ke-ming,GE Bao-feng,LIU Xing-yan,et al.
(Institute of Traumatology and Orthopadics,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA，730050)
Abstract:Objective:To investigate gene expression of typeⅠand type Ⅱcollagen in bone and cartilage by in situ hybridization.Methods:Three oligonucleotide probes which were specific seperately for typeⅠ,type ⅡA and type ⅡB collagen mRNA were sythesized with DNA synthesizer,and labelled at 3'-end by DIG-ddUTP. The specimens of normal rabbit trabecula were cut into 5 μm sections and hybridized with the oligonucleotide probes.Results:TypeⅡB collagen mRNA was clearly demonstrated in chondrocytes in articular cartilage and epiphysis,typeⅠ collagen mRNA was localized in osteoblasts lining in surface of newly produced trabecula.Conclusion:With higher sensitivity and reliable result,it might be a good method to further study the relationship between collagen gene expression and bone disease and osteogenesis.
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Key words:Laboratory diagnosis； In situ hybridization； Gene expression； Bone
胶原是骨和软骨组织中最重要的蛋白质大分子之一，胶原代谢和基因表达异常可导致许多骨病的发生。长期以来人们已在骨胶原的分子组成、结构、功能和基因克隆等方面作了大量研究，但目前关于胶原基因在体内的表达，尤其是原位水平的表达研究还较少。本文应用地高辛标记的寡核苷酸探针检测了兔长骨骨骺端软骨和骨组织中Ⅰ、Ⅱ型胶原基因的表达情况。
1 材料与方法
1.1 组织切片的制备：3月龄新西兰大白兔用4%多聚甲醛灌注固定致死，截取双侧胫骨近端进行后固定(4℃)，用锯型切片机(Leica sp1600)纵向切成2～3 mm的薄片，置10%EDTA中脱钙1周(4℃)，常规脱水，石蜡包埋，切成5 μm的切片，捞于经多聚赖氨酸溶液处理的切片上。
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1.2 寡核苷酸探针及标记：Ⅰ型胶原探针采用d'Alessio等报道的序列[1]：5′-GATTGTGGGATGTCTTCGTCTT-3′；Ⅱ型胶原探针采用Ryan 和Sandell报道的序列[2]，即ⅡA型：5′-TGCCAGCCTCCTGGACATCCTGGC-3′；ⅡB型：5′-CTCCTGGTTGCCGGACATCCTGGC-3′,均由赛百胜公司用DNA合成仪合成，Cartridge柱纯化。探针采用非放射性同位素法标记，用宝灵曼公司产品DIG-Oligonucleotide 3'End Labelling Kit将地高辛标记于探针的3′-末端。
1.3 原位杂交：切片脱蜡至水后，依次用0.2N盐酸处理20 min，蛋白酶K消化20 min，0.2%甘氨酸终止消化，4%多聚甲醛后固定30 min，乙酰化处理10 min，乙醇逐级脱水干燥。滴加预杂交液(50%去离子甲酰胺，300mMNacl，10 mMTris，lmMEDTA，1×Denhardt's,100 μg.ml-1ssDNA)，于37℃孵育1 h，甩弃预杂交液，滴加含2 ng.ml-1探针的杂交液(杂交液加10%硫酸葡聚糖)，于37℃湿盒内孵育过夜。杂交后切片用下列溶液依次各洗涤30 min：5×SSC，2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，0.25×SSC。免疫显色应用宝灵曼公司的Dig Nucleic Acid Detection Kit，最后于4℃避光条件下显色16～20 h，TE终止反应，甘油-明胶封固剂封片。以下列反应作为阴性对照：与非特异性寡核苷酸探针(Labelling Kit 内含)杂交；与不含探针的杂交液杂交；与未标记探针杂交。结果判定：阳性反应信号为胞浆中出现紫蓝色颗粒。
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2 结果
2.1 骺板区：阳性细胞主要分布于增殖区和肥大区，增殖区细胞呈扁平状，紫蓝色颗粒位于细胞核两侧。肥大区软骨细胞呈圆形，信号颗粒呈环状或放射状包绕于细胞核周围。此区ⅡB型胶原基因表达呈阳性，Ⅰ型、ⅡA型和各项对照试验均为阴性。(图1、2)
图1 骺板增殖区和肥大区软骨细胞中ⅡB型胶原基因表达阳性，胞浆中深染的阳性颗粒位于细胞两端或包绕于胞核周围 400×
图2 骺板区阴性对照试验结果，软骨细胞细胞核染成淡紫蓝色 400×
2.2 关节软骨区：关节软骨基质极易着色，非特异性地形成深紫蓝色背景，对结果有一定影响。在高倍镜下可观察到软骨细胞胞浆中深染的阳性信号颗粒。此区ⅡB胶原基因检测结果呈阳性，以关节表层和中层软骨细胞的表达信号最强(图3)。
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图3 关节软骨细胞中ⅡB型胶原基因表达阳性，阳性信号颗粒
包绕于细胞核周围 400×
2.3 新生骨小梁区：此区Ⅰ型胶原基因表达呈阳性，阳性信号颗粒位于沿骨小梁表面排列的成骨细胞内，成骨细胞胞浆丰富，胞核位于细胞一侧且几乎不着色，而胞浆内密布紫蓝色点状颗粒(图4)。
图4 新生骨小梁表面的成骨细胞中Ⅰ型胶原基因表达阳性，胞浆全部染成深紫蓝色，胞核几不着色 400×
3 讨论
Ⅰ、Ⅱ型胶原分别是骨和软骨的主要胶原类型，Ⅰ型胶原基因的表达与成骨活动关系密切，其mRNA的出现早于碱性磷酸酶和骨钙素，是成骨细胞早期分化的特异性分子标记[3]。Ⅱ型胶原约占软骨胶原总量的90%以上，其基因过度表达可使胶原与蛋白聚糖的比例失调，引发骨性关节炎。Ⅱ型胶原基因在转录过程中由于外显子之间拼接方式的不同而产生两种mRNA，即ⅡA型和ⅡB型，它们分别表达于不同类型软骨细胞中。ⅡB型是关节软骨即透明软骨的特异性胶原类型[4]。
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原位杂交法是由DNA重组技术与免疫组化方法相结合而产生的一种在单细胞水平上检测特定基因表达情况的技术，是研究基因表达及其分布的有力工具，目前正得到日益广泛的应用[5]。由于RNA或CDNA探针常难以得到，而寡核苷酸探针可以用DNA合成仪合成，故可在一般实验室应用。本实验根据文献报道的寡核苷酸序列，通过商品途径进行合成，获得Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型三种寡核苷酸探针，并用无放射性危害的地高辛进行末端标记，结果所显示ⅡA、ⅡB型胶原基因表达与Sandell等人采用放射性同位素法标记相同，Ⅰ型胶原基因表达与Neo等人采用RNA探针检测的结果相同[6]，说明本实验方法能够准确反映骨组织中胶原基因的表达，可用于深入研究与胶原相关的骨病和骨发生发育过程。
作者简介：陈克明(1968—)，男，硕士，主管技师
参考文献：
[1]d'Allessio MM,Bernard V,Benson-Chanda ML, et al.Complete nucleotide sequence of the region encompassing the first twenty-five exons of the human pro-αⅠ(Ⅰ) collagen(col 1A)[J].Gene,1988，67：105-115.
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[2]Ryan MC， Sandell LJ.Differential expression of a cysteine-rich domain in the amino-terminal propeptide of typeⅡ(cartilage) procollagen by alternative splicing of mRNA[J].J Biochem,1990,265:10334-10339.
[3]Atkinson BL,Fantle KS,Benedict JJ,et al.Combination of osteoinductive bone proteins differentiates mensenchymal C3H/10T1/2 cells specifically to the cartilage lineage[J].J Cell Biochem,1997,65(3):325-339.
[4]Sandell LJ,Morris N,Robbins JR,et al.Alternatively spliced typeⅡ procollagen mRNAs define distinct populations of cells during vertebral development:differential expression of the amino-propeptide[J].J Cell Biol,1991,114:1307-1319.
[5]青 春，姚 敏，陆树良，等.大鼠深度烫伤后局部组织中PDGFmRNA表达水平[J].西北国防医学杂志，1999，20(4)：249-251.
[6]Neo M,Voigt CF,Herbst H,et al.Analysis of osteoblast activity at biomaterial-bone interfaces by in situ hybridization[J].J Biolmed Mater Reser,1996,30:485-492.
收稿日期：2000-01-18, http://www.100md.com