输血传播病毒－DNA聚合酶链方法的建立及应用
作者：程维兴 邢颜超 刘爱中 王冬梅 唐艺 陈红
单位：程维兴(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；邢颜超(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；刘爱中(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；王冬梅(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；唐艺(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)
关键词：实验室诊断；输血传播病毒；聚合酶链反应
西北国防医学杂志000308 摘要：目的：建立输血传播病毒(TTV)-DNA聚合酶链反应方法并应用于新疆地区不同人群TTV感染的检测。方法：根据已报道的TTV基因序列(DDBJ序列号：AB008394)，通过引物设计软件SQNCE和OLIGO在其ORF1区设计一对PCR引物，扩增产生一个315 bp的扩增片段，产物经BgⅠⅡ酶切分别产生一个219 bp和96 bp的酶切片段。结果：用建立的PCR方法在15例维吾尔族转氨酶升高的非甲-非庚型肝炎血清标本中检测到6份TTV-DNA阳性，表明新疆地区存在TTV感染，维吾尔族中有较高的TTV感染率。结论：我们建立的TTV DNA-PCR方法灵敏度高、特异性好，可用于各类人群TTV-DNA的检测。
, 百拇医药
中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0184-03
Establishment and preliminary application of a PCR method for detection of TTV DNA
CHENG Wei-xing,XING Yan-chao,LIU Ai-zhong,et al.
( Department of Transfusion,Urumqi General Hospital ,Lanzhou Command,PLA,830000)
Abstract:Objective:To establish a new PCR for detection of TTV-DNA among various populations and patients with liver diseases in Xin Jiang.Methods:Based on the reported sequence of TTV(access number AB008394 in DDBJ),a set of primers was designed by the software of SQNCE and OLIGO,The amplified product was about 315 bp and the specificity of the method was confirmed by BgⅠⅡto produce two fragments of 219 bp and 96 bp respectively.Results:The PCR method was also successfully applied to clinical samples.TTV DNA was detected in 6 of 15(40%) sera of Uigur whose alanine aminotransferase(ALT) were high but no seriological markers of known hepatitis viruses.Conclusion:The TTV DNA-PCR has high sensitivity and speciticity.It can be used for the detection of TTV DNA in sera of different populations and patients with various liver diseases.The results suggest that TTV exist in Xingjiang and there is a high incidence of TTV in the Uigur
, 百拇医药
Key words:Laboratory diagnosis； Transfusion transmitted virus(TTV)； Polymerase chain reaction(PCR)
肝炎病毒是危害人类健康的重要病原，流行病学资料显示在排除甲、乙、丙、丁及戊型肝炎病毒感染外仍有大约10%～20%的病人转氨酶不明原因升高，肝功能异常，表明还存在可导致人类肝炎的未知病原，通常将这些不明原因的肝炎称之为非甲非戊型肝炎(non A-E hepatitis)。1995年美国研究者先后报道发现了庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)[1，2]，其病毒不是非甲非戊型肝炎的主要致病因素。流行病学研究及临床资料提示存在甲型至庚型肝炎之外的病原因子。1997年日本学者Nishizawa等[3]从一名输血后的肝炎患者体内利用RDA(Representational difference analysis,RDA)技术分离到一种新的DNA病毒，命名为TTV。随后美、英、德等国[4～6]也相继报道TTV病毒感染的存在，国内周育森等[7]也检测到该病毒DNA并进行了全序列测定。但对TTV的研究才刚起步，目前只知该病毒是一种无胞膜的DNA单链环状病毒，它的分类、致病性、流行病学资料均不十分清楚。为此，我们根据已报道的TTV基因序列自行设计PCR引物，建立了输血传播感染病毒(TTV)聚合酶链反应方法并在新疆地区初步开展TTV的分子流行病学调查。
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1 材料和方法
1.1 引物设计与合成：根据已报道的TTV基因序列(基因库DDBJ序列号：AB008394)，在其ORF1区设计一对引物，上游引物SN长度为16 bp 5′-TCAGACACCCAGATG-3′，下游引物ASN长度为17 bp 5′-GTTCACAACCACAGAGT-3′。引物在381-A DNA合成仪(ABI公司)上合成，SEPPAKC18(Waters)柱脱盐和纯化。
1.2 标本来源：15例血清标本中11例为本院门诊病人、4例为献血员；男9例、女6例；年龄15～49岁、平均35岁。排除非甲-庚型肝炎但转氨酶不明原因升高，肝功能不同程度异常的维吾尔族患者。
1.3 血清标本中TTV-DNA的提取：SDS和蛋白酶K裂解，酚-氯仿抽提DNA，所有试剂均购自北京同正公司，血清用量为100～200 μl，在最终30～40 μl溶解液中取26 μl作为PCR模板。
, 百拇医药
1.4 聚合酶链反应(PCR)
1.4.1 材料：TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、4×dNTPs和DNA分子量标准均购自北京同正公司，DNA扩增仪(型号：DTC-3A型)为西安中亚公司产品。微量高速离心机(型号：TG16-W)为解放军基因诊断技术应用研究所产品。
1.4.2 PCR反应体系和循环参数：PCR反应体系为30 μl，反应条件：预变性温度94℃5 min；变性温度94℃1 min；退火温度58℃1 min；延伸温度72℃1 min。经35个循环后再在72℃延伸7 min。
1.5 扩增产物检测
1.5.1 琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色(PCR-EB)：PCR产物15 μl加3 μl载样缓冲液(0.25%酒石黄/40%蔗糖)，在含0.5 mg.L-1EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳。电泳缓冲液为TBE缓冲液。60～80 V，20～30 min后在254 nm紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
1.5.2 PCR产物内切酶酶切分析(PCR-RE)：PCR产物纯化后用BigⅡ(北方同正)酶切。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段。
2 结果
2.1 反应条件的优化：我们对影响PCR扩增最关键的几个因素如Mg2+、4×dNTPs、引物浓度以及退火温度进行了优化。在如下的条件：Mg2+2 mmol.L-1、4×dNTPs2 mmol.L-1、引物各10 μmol.L-1以及退火温度58℃下扩增结果最佳。
2.2 反应的特异性：用已知的TTV-DNA阳性模板扩增产生一个预期大小的阳性扩增带，长度为315 bp，而阴性对照组无特异扩增带。对上述扩增产物用BigⅡ酶切，结果得到预期大小的酶切片段，一片断为219 bp，另一片断96 bp。结果见图1。
, 百拇医药
2.3 反应的敏感性：将上述已知的TTV-DNA阳性模板进行系列稀释后做PCR，结果PCR检测的敏感度为10-3～10-9之间。
2.4 血清标本的TTV-DNA PCR检测：15份维吾尔族血清标本按上述建立的方法做PCR，检出6例TTV-DNA阳性，TTV-DNA检出率为40.0%(6/15)，其中男性TTV-DNA检出率为44.4%(4/9)；女性为33.3%(2/6)，结果见图2。
图1 TTV DNA PCR扩增产物Big Ⅱ酶切电泳结果
M：DNA marker PBR322/HinfI(1632、517、396、344、298、221、220、154、75 bp)
, 百拇医药 1：TTV DNA阳性对照PCR扩增产物电泳结果(315 bp)；2、4：TTV DNA 阴性对照；
3：TTV DNA阳性血清PCR扩增产物Big Ⅱ酶切结果(219 bp、96 bp)
图2 TTV DNA PCR 扩增产物电泳结果
M：DNA marker PBR322/HinfI(1632、517、396、344、298、221、220、154、75 bp)；
1：TTV DNA阳性对照PCR扩增产物电泳结果(315 bp)；2：TTV DNA 阴性对照；
3～8：TTV DNA阳性血清PCR扩增产物电泳结果
, 百拇医药
3 讨论
非甲-非庚型肝炎的病原学研究一直是人们关注的问题。1997年Nishizawa从一名输血后肝炎患者(TT)中检测到一种新的DNA病毒TTV，初步研究显示TTV为单链无胞膜的环状DNA病毒，它与输血后的肝炎有着紧密的联系，又称为输血传播感染病毒，目前暂归为细小病毒科(Parvoviridae)。TTV基因组全长3.7 kb,含两个开放阅读框架(ORF)，其中ORF1位于该基因组的589～2 898位核苷酸，编码770个氨基酸。ORF2位于107～712位核苷酸，编码202个氨基酸。Okamoto[9]对日本的TTV感染调查资料显示TTV分布广泛，在非甲-非戊暴发性肝炎中，47%(9/19)为TTV阳性；非甲-非戊慢性肝病中，TTV阳性率为46%(41/90)，其中慢性肝炎47%(15/32)，肝硬化48%(19/40)，肝癌39%(7/18)；血友病病人TTV阳性率为46%(26/57)，献血员为12%(34/29)。在美国[4]，献血员、不明原因的肝硬化患者以及有输血史的人群中TTV感染率分别为1%(1/100)、15%(5/33)和18%(2/11)。研究还发现TTV不仅可通过血液传播也可通过粪-口途径感染[9]。我们的研究表明在新疆地区也存在TTV病毒的感染，感染率为40%(6/15)，与日本和国内其它地区的TTV感染率接近。临床调查还显示维吾尔族人群中存在较高比例的TTV感染，这是否与当地维吾尔族人饮食习惯有关还待进一步研究确定。由于TTV为单链DNA病毒，目前多采用套式PCR检测，我们建立的TTV-PCR一次扩增就能得到明显的特异扩增片段，这可能与设计的引物扩增效率有关，有报道不同的引物扩增效率相差可达10～100倍[8，10]。今后我们将进一步扩大研究范围和对象，查清新疆不同地区、不同民族之间的TTV感染情况并进行其序列分析以摸清TTV在新疆地区的基因变异，为TTV的流行病学调查提供一些证据。
, 百拇医药
(本课题承蒙本院临床医学研究所刘德祥教授指导，在此致谢)。
作者简介：程维兴(1951—)，男，主治医师
唐艺(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)
陈红(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)
参考文献：
[1]Leary TP,Muerhoff SA,Simos JN, et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A-hepatitis[J].J Med Virol,1996,48:60-68.
, 百拇医药
[2]Linnen J,Wages J Jr,Zhang-Keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissiblagent[J].Science,1996,271:505-508.
[3]Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transamin-ase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,241:92-97.
[4]Charlton M,Adjei P,Poterucha J， et al. TT-virus infection in North American blood donors,patients with fulminant hepatic failure,and cryptogenic cirrhosis[J].Hepatology,1998,Sep 28(3):839-842.
, 百拇医药
[5]Naoumov NV,Petrova EP,Thomas MG.Williams R Presence of a newly described human DNA virus(TTV)in patients with liver disease[J].Lancet,1998 Jul 18;352(9123):195-197.
[6]Tanaka H,Okamoto H,Luengrojanakul P,et al.Infection with an unenveloped DNA virus(TTV)associated with posttransfusion non-A to G hepatitis in hepatitis and healthy blood donors in Thailand [J].J Med Virol,1998,Nov;56(3):234-238.
[7]周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因的克隆及序列测定[J].军事医学科学院院刊，1998，22(2)：81-83.
, 百拇医药
[8]Wands JR.Lieberman HM.Muchmore E,et al.Detection and transmission in chimpanzees of HBV related antigens formerly designated non A,non B hepatitis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79:7552.
[9]Okamoto H,Akahane Y,Ukita M,et al. Fecal excretion of a nonenveloped DNA virus(TTV) associated with posttransfusion non-A-G hepatitis [J].J Med Virol 1998,Oct:56(2):128-132.
[10]姜 泊，张亚历，周殿元，等.主编.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，1996.103-128.
收稿日期：1999-07-28, 百拇医药
单位：程维兴(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；邢颜超(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；刘爱中(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；王冬梅(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)；唐艺(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)
关键词：实验室诊断；输血传播病毒；聚合酶链反应
西北国防医学杂志000308 摘要：目的：建立输血传播病毒(TTV)-DNA聚合酶链反应方法并应用于新疆地区不同人群TTV感染的检测。方法：根据已报道的TTV基因序列(DDBJ序列号：AB008394)，通过引物设计软件SQNCE和OLIGO在其ORF1区设计一对PCR引物，扩增产生一个315 bp的扩增片段，产物经BgⅠⅡ酶切分别产生一个219 bp和96 bp的酶切片段。结果：用建立的PCR方法在15例维吾尔族转氨酶升高的非甲-非庚型肝炎血清标本中检测到6份TTV-DNA阳性，表明新疆地区存在TTV感染，维吾尔族中有较高的TTV感染率。结论：我们建立的TTV DNA-PCR方法灵敏度高、特异性好，可用于各类人群TTV-DNA的检测。
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中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0184-03
Establishment and preliminary application of a PCR method for detection of TTV DNA
CHENG Wei-xing,XING Yan-chao,LIU Ai-zhong,et al.
( Department of Transfusion,Urumqi General Hospital ,Lanzhou Command,PLA,830000)
Abstract:Objective:To establish a new PCR for detection of TTV-DNA among various populations and patients with liver diseases in Xin Jiang.Methods:Based on the reported sequence of TTV(access number AB008394 in DDBJ),a set of primers was designed by the software of SQNCE and OLIGO,The amplified product was about 315 bp and the specificity of the method was confirmed by BgⅠⅡto produce two fragments of 219 bp and 96 bp respectively.Results:The PCR method was also successfully applied to clinical samples.TTV DNA was detected in 6 of 15(40%) sera of Uigur whose alanine aminotransferase(ALT) were high but no seriological markers of known hepatitis viruses.Conclusion:The TTV DNA-PCR has high sensitivity and speciticity.It can be used for the detection of TTV DNA in sera of different populations and patients with various liver diseases.The results suggest that TTV exist in Xingjiang and there is a high incidence of TTV in the Uigur
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Key words:Laboratory diagnosis； Transfusion transmitted virus(TTV)； Polymerase chain reaction(PCR)
肝炎病毒是危害人类健康的重要病原，流行病学资料显示在排除甲、乙、丙、丁及戊型肝炎病毒感染外仍有大约10%～20%的病人转氨酶不明原因升高，肝功能异常，表明还存在可导致人类肝炎的未知病原，通常将这些不明原因的肝炎称之为非甲非戊型肝炎(non A-E hepatitis)。1995年美国研究者先后报道发现了庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)[1，2]，其病毒不是非甲非戊型肝炎的主要致病因素。流行病学研究及临床资料提示存在甲型至庚型肝炎之外的病原因子。1997年日本学者Nishizawa等[3]从一名输血后的肝炎患者体内利用RDA(Representational difference analysis,RDA)技术分离到一种新的DNA病毒，命名为TTV。随后美、英、德等国[4～6]也相继报道TTV病毒感染的存在，国内周育森等[7]也检测到该病毒DNA并进行了全序列测定。但对TTV的研究才刚起步，目前只知该病毒是一种无胞膜的DNA单链环状病毒，它的分类、致病性、流行病学资料均不十分清楚。为此，我们根据已报道的TTV基因序列自行设计PCR引物，建立了输血传播感染病毒(TTV)聚合酶链反应方法并在新疆地区初步开展TTV的分子流行病学调查。
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1 材料和方法
1.1 引物设计与合成：根据已报道的TTV基因序列(基因库DDBJ序列号：AB008394)，在其ORF1区设计一对引物，上游引物SN长度为16 bp 5′-TCAGACACCCAGATG-3′，下游引物ASN长度为17 bp 5′-GTTCACAACCACAGAGT-3′。引物在381-A DNA合成仪(ABI公司)上合成，SEPPAKC18(Waters)柱脱盐和纯化。
1.2 标本来源：15例血清标本中11例为本院门诊病人、4例为献血员；男9例、女6例；年龄15～49岁、平均35岁。排除非甲-庚型肝炎但转氨酶不明原因升高，肝功能不同程度异常的维吾尔族患者。
1.3 血清标本中TTV-DNA的提取：SDS和蛋白酶K裂解，酚-氯仿抽提DNA，所有试剂均购自北京同正公司，血清用量为100～200 μl，在最终30～40 μl溶解液中取26 μl作为PCR模板。
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1.4 聚合酶链反应(PCR)
1.4.1 材料：TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、4×dNTPs和DNA分子量标准均购自北京同正公司，DNA扩增仪(型号：DTC-3A型)为西安中亚公司产品。微量高速离心机(型号：TG16-W)为解放军基因诊断技术应用研究所产品。
1.4.2 PCR反应体系和循环参数：PCR反应体系为30 μl，反应条件：预变性温度94℃5 min；变性温度94℃1 min；退火温度58℃1 min；延伸温度72℃1 min。经35个循环后再在72℃延伸7 min。
1.5 扩增产物检测
1.5.1 琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色(PCR-EB)：PCR产物15 μl加3 μl载样缓冲液(0.25%酒石黄/40%蔗糖)，在含0.5 mg.L-1EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳。电泳缓冲液为TBE缓冲液。60～80 V，20～30 min后在254 nm紫外灯下观察结果。
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1.5.2 PCR产物内切酶酶切分析(PCR-RE)：PCR产物纯化后用BigⅡ(北方同正)酶切。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段。
2 结果
2.1 反应条件的优化：我们对影响PCR扩增最关键的几个因素如Mg2+、4×dNTPs、引物浓度以及退火温度进行了优化。在如下的条件：Mg2+2 mmol.L-1、4×dNTPs2 mmol.L-1、引物各10 μmol.L-1以及退火温度58℃下扩增结果最佳。
2.2 反应的特异性：用已知的TTV-DNA阳性模板扩增产生一个预期大小的阳性扩增带，长度为315 bp，而阴性对照组无特异扩增带。对上述扩增产物用BigⅡ酶切，结果得到预期大小的酶切片段，一片断为219 bp，另一片断96 bp。结果见图1。
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2.3 反应的敏感性：将上述已知的TTV-DNA阳性模板进行系列稀释后做PCR，结果PCR检测的敏感度为10-3～10-9之间。
2.4 血清标本的TTV-DNA PCR检测：15份维吾尔族血清标本按上述建立的方法做PCR，检出6例TTV-DNA阳性，TTV-DNA检出率为40.0%(6/15)，其中男性TTV-DNA检出率为44.4%(4/9)；女性为33.3%(2/6)，结果见图2。
图1 TTV DNA PCR扩增产物Big Ⅱ酶切电泳结果
M：DNA marker PBR322/HinfI(1632、517、396、344、298、221、220、154、75 bp)
, 百拇医药 1：TTV DNA阳性对照PCR扩增产物电泳结果(315 bp)；2、4：TTV DNA 阴性对照；
3：TTV DNA阳性血清PCR扩增产物Big Ⅱ酶切结果(219 bp、96 bp)
图2 TTV DNA PCR 扩增产物电泳结果
M：DNA marker PBR322/HinfI(1632、517、396、344、298、221、220、154、75 bp)；
1：TTV DNA阳性对照PCR扩增产物电泳结果(315 bp)；2：TTV DNA 阴性对照；
3～8：TTV DNA阳性血清PCR扩增产物电泳结果
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3 讨论
非甲-非庚型肝炎的病原学研究一直是人们关注的问题。1997年Nishizawa从一名输血后肝炎患者(TT)中检测到一种新的DNA病毒TTV，初步研究显示TTV为单链无胞膜的环状DNA病毒，它与输血后的肝炎有着紧密的联系，又称为输血传播感染病毒，目前暂归为细小病毒科(Parvoviridae)。TTV基因组全长3.7 kb,含两个开放阅读框架(ORF)，其中ORF1位于该基因组的589～2 898位核苷酸，编码770个氨基酸。ORF2位于107～712位核苷酸，编码202个氨基酸。Okamoto[9]对日本的TTV感染调查资料显示TTV分布广泛，在非甲-非戊暴发性肝炎中，47%(9/19)为TTV阳性；非甲-非戊慢性肝病中，TTV阳性率为46%(41/90)，其中慢性肝炎47%(15/32)，肝硬化48%(19/40)，肝癌39%(7/18)；血友病病人TTV阳性率为46%(26/57)，献血员为12%(34/29)。在美国[4]，献血员、不明原因的肝硬化患者以及有输血史的人群中TTV感染率分别为1%(1/100)、15%(5/33)和18%(2/11)。研究还发现TTV不仅可通过血液传播也可通过粪-口途径感染[9]。我们的研究表明在新疆地区也存在TTV病毒的感染，感染率为40%(6/15)，与日本和国内其它地区的TTV感染率接近。临床调查还显示维吾尔族人群中存在较高比例的TTV感染，这是否与当地维吾尔族人饮食习惯有关还待进一步研究确定。由于TTV为单链DNA病毒，目前多采用套式PCR检测，我们建立的TTV-PCR一次扩增就能得到明显的特异扩增片段，这可能与设计的引物扩增效率有关，有报道不同的引物扩增效率相差可达10～100倍[8，10]。今后我们将进一步扩大研究范围和对象，查清新疆不同地区、不同民族之间的TTV感染情况并进行其序列分析以摸清TTV在新疆地区的基因变异，为TTV的流行病学调查提供一些证据。
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(本课题承蒙本院临床医学研究所刘德祥教授指导，在此致谢)。
作者简介：程维兴(1951—)，男，主治医师
唐艺(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)
陈红(兰州军区乌鲁木齐总医院输血科，新疆 乌鲁木齐 830000)
参考文献：
[1]Leary TP,Muerhoff SA,Simos JN, et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A-hepatitis[J].J Med Virol,1996,48:60-68.
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[2]Linnen J,Wages J Jr,Zhang-Keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissiblagent[J].Science,1996,271:505-508.
[3]Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transamin-ase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,241:92-97.
[4]Charlton M,Adjei P,Poterucha J， et al. TT-virus infection in North American blood donors,patients with fulminant hepatic failure,and cryptogenic cirrhosis[J].Hepatology,1998,Sep 28(3):839-842.
, 百拇医药
[5]Naoumov NV,Petrova EP,Thomas MG.Williams R Presence of a newly described human DNA virus(TTV)in patients with liver disease[J].Lancet,1998 Jul 18;352(9123):195-197.
[6]Tanaka H,Okamoto H,Luengrojanakul P,et al.Infection with an unenveloped DNA virus(TTV)associated with posttransfusion non-A to G hepatitis in hepatitis and healthy blood donors in Thailand [J].J Med Virol,1998,Nov;56(3):234-238.
[7]周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因的克隆及序列测定[J].军事医学科学院院刊，1998，22(2)：81-83.
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[8]Wands JR.Lieberman HM.Muchmore E,et al.Detection and transmission in chimpanzees of HBV related antigens formerly designated non A,non B hepatitis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1982,79:7552.
[9]Okamoto H,Akahane Y,Ukita M,et al. Fecal excretion of a nonenveloped DNA virus(TTV) associated with posttransfusion non-A-G hepatitis [J].J Med Virol 1998,Oct:56(2):128-132.
[10]姜 泊，张亚历，周殿元，等.主编.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社，1996.103-128.
收稿日期：1999-07-28, 百拇医药