端粒酶活性在卵巢肿瘤组织中表达的临床意义
作者：杨秀芝 陈必良 苏明权 辛晓燕 王德堂
单位：杨秀芝(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；陈必良(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；苏明权(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；辛晓燕(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；王德堂(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)
关键词：卵巢肿瘤；端粒酶活性；表达
西北国防医学杂志000415摘要：目的：研究测定端粒酶活性在诊断和预测卵巢肿瘤 方面的意义。方法：应用PCR-TRAP法检测30例卵巢肿瘤 组织(良性组织8例，交界性或低度 恶性肿瘤7例，恶性肿瘤15例)的端粒酶活性。结果：8例 卵巢良性组织中均未测出端粒酶活 性，7例卵巢交界性或低度恶性肿瘤组织中，4例(57%)端粒酶活性阳性表达，15例卵巢恶性 肿 瘤组织中，14例(93.3%)端粒酶活性阳性表达。卵巢上皮性恶性肿瘤组织中，在组织类型、 组 织学分级及肿瘤分期之间无显著性差异。结论：端粒酶活 性的检测不仅有助于卵巢肿瘤的诊断和鉴别诊断，且有助于预测患者的预后。
, 百拇医药
中图分类号：R 737.31 文献标识码 ：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0282-03
Telomerase activity in ovarian tumors tissues and its clinical sig nificance
YANG Xiu-zhi,CHEN Bi-liang,SU Ming-quan,et al.
(Department of Obstetrics and Gynecology,Xijing Hospital,The 4th Military Medi cal University,710033，China)
Abstract:Objective:To evaluate the role of telomeras e activity in the genesis an d development of ovarian tumors and its clinical significance.Meth ods:Telomerase activity in ovarian tumor tissues was determined using PCR-TRAP.These specimen s were abtained from 30 patients with ovarian tumors,including 8 benign,7 border line or low malignant(LMP),and 15 malignant tumors.Results:Telomerase activity w as detected in 4 of 7 LMP tumors(57%)and in 14 of 15 malignant tumors(93.3%)bu t not in 8 benign tumors.There were no significant correlation among the general positive rate of telomerase activity histological substypes,histological gr ades or tumor stages.Conclusion:The detection of tel omerase activity is not only useful in dianosis and differential diagnosis of ovarian tumors,but also helpfu l in predicting prognosis of patient with malignant ovarian tumors.
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Key words:Ovarian neoplasms; Telomerase activity; Expression
无限增殖是癌细胞的重要生物学特性。研究发现端粒酶与细胞分裂及寿命控制有密切关 系，在细胞癌变早期由于端粒酶的活性增强，致使端粒的长度得以维持，细胞染色体形态得 到稳定，从而逃避了因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞获得永生化[1]。端粒 酶活性在人体多数肿瘤组织中均获检出。我们采用端粒重复扩增PCR(PCR-TRAP)方法对我院 30例卵巢肿瘤组织进行端粒酶活性检测，了解端粒酶活性在卵巢肿瘤组织中的表达及在诊断 和预测卵巢肿瘤预后方面的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 组织标本来源：30例卵巢肿瘤组织 均为我院1999-03～09手术切除标本，包括 8例卵巢良性肿瘤，7例交界性肿瘤，15例恶性肿瘤。所有病例均经病理学证实。获取的新鲜 组织标本立即置-20℃冻存。
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1.1.2 端粒酶检测试剂：由Oncor公司提 供。
1.2 方法
1.2.1 端粒酶的提取：手术切除的卵巢肿 瘤组织50 mg，置液氮速冻后用组织研磨器研 成粉末，PBS缓冲液洗涤一次，10 000 g.min-1离心1 min，弃洗液，加入100 μl 预 冷的裂解液(10 mmol.L-1 Tris-HCL pH7.5;1 mmol.L-1 EGTA；1mmol.L -1二巯基乙醇；0.5%CHAPS；10%甘油5)，混合后冰浴裂解30 min，12 000 g.min -14℃离心20 min，上清即为端粒酶提取物，或-20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增：PCR反应总体积为50 μl ，包括10×TRAP反应液5.0 μl，2.5 mmol. L-1 dNTPs mix 1.0 μl，Ts引物1.0 μl，Taq DNA聚合酶2U，端粒酶提取物2.0 μ l，无菌石蜡油30 μl，离心片刻，置30℃反应30 min后，加CX引物1.0 μl，进入PCR循环 ，循环条件为：94℃3 min→94℃30 s→48℃30 s→72℃30 s，35次循环，最后72℃延伸5 m in。
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1.2.3 产物的检测：取PCR扩增产物15 μ l，于10%非变性聚丙烯酰胺凝胶200V电泳9 0 min，将凝胶小心取出置于0.1 μg.ml-1的EB液中染色15 min，再用蒸馏水漂洗 两 次，紫外灯下观察结果并拍照。反应以TSR8阳性模板为阳性对照，含36 bp的内对照(Oncor 公司)，1×CHAPS裂解液代替组织裂解液为空白对照，每一样品均设立端粒酶热失活对照(PC R-TRAP反应前将细胞裂解物于85℃处理15 min，使端粒酶失活)。
1.2.4 统计学处理：采用χ2检验进行 统计学处理。
2 结果
2.1 卵巢肿瘤组织中端粒酶活性的表达：8例卵巢良性肿瘤组织中：包括卵巢粘液性囊 腺瘤2例，卵巢浆液性囊腺瘤2例，卵巢血管平滑肌瘤2例，卵巢子宫内膜异位囊肿2例，端粒 酶活性均呈阴性。在7例交界性或低度恶性卵巢肿瘤组织中，包括2例交界性粘液性囊腺瘤， 2例交界性浆液性囊腺瘤，2例支持细胞瘤，1例粒层细胞卵泡膜细胞瘤，4例端粒酶阳性表达 ，3例端粒酶为阴性。在15例卵巢恶性肿瘤组织中，包括卵巢浆液性囊腺 癌6例，粘液性囊腺癌2例，子宫内膜样癌4例，恶性畸胎瘤1例，转移性癌2例，14例端粒酶 活性阳性表达，1例端粒酶活性为阴性。结果见表1。
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表1 卵巢肿瘤组织中端粒酶活性表达 肿瘤
例数
阳性例数
阴性例数
阳性率(%)
良性
8
0
8
0
交界性
7
4
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3
57.0
恶性
15
14
1
93.3
注：compared to benign:P<0.05
2.2 端粒酶活性与肿瘤组织学的关系：虽然我们的方法是端粒酶活性的定性检测，但发 现卵巢恶性肿瘤的端粒酶活性与肿瘤的组织类型、组织分级、肿瘤分期无明显的相关性。
3 讨论
自1994年Kim[2]建立了高效敏感的以PCR为基础的端粒重复扩增(TRAP)方法以来， 端粒酶引起了人们的广泛关注。近年文献报道，绝大部分肿瘤呈端粒酶酶阳性，而在邻近正 常人体组织细胞或良性肿瘤则为阴性[3]，在恶性肿瘤针吸标本、尿液、肠道冲洗 液中，端粒酶活性的检测也有较高的表达，有助于肿瘤的早期诊断[4]。Hiyama等 [5]对乳腺癌、胃癌病人的研究发现，端粒酶阳性者肿瘤体积大，淋巴结转移率高 ，预后差。端粒酶活性与肿瘤的大小、淋巴结的转移、肿瘤的分级和预后密切相关。提示端 粒酶阳性的肿瘤比阴性的肿瘤有更大的恶性倾向。但本组发现端粒酶活性与肿瘤组织学类型 、分级及分期无明显相关性，其原因目前尚不清楚。在胃癌、乳腺癌、肠癌、甲状腺癌、肺 癌中，随肿瘤的恶性表型的增加，端粒酶活性的检出率和强度也增加[6，7]。19 94年Counter等[8]首次报道晚期卵巢上皮癌腹水细胞端粒酶阳性，此后Zheng等 [9]检测了多种妇科肿瘤，发现恶性妇科肿瘤端粒酶阳性率达95%以上，而在正常对 照组或良性妇科肿瘤中均为阴性，认为端粒酶检测可作为生殖道恶性肿瘤的标记物。Muraka mi[10]等采用TRAP法发现25例恶性卵巢肿瘤中有23例(92%)表达端粒酶活性，6 例交界性肿瘤有1例为端粒酶阳性，10例良性肿瘤中有2例端粒酶阳性，恶性和低分化卵巢肿 瘤活性较其它肿瘤端粒酶恶性高得多。作者发现：8例卵巢良性肿瘤组织，端粒酶活性均呈 阴性。此结果与文献报道[9]不太相符，我们认为可能与所检测标本量的多少有关 。但在7例交界性或低度恶性卵巢肿瘤组织中，4例端粒酶阳性表达，3例端粒酶活性为 阴性。这些结果与文献报道[9，10]基本一致，显示端粒酶活性的改变可以作为恶 性肿瘤的早期分子生物学标志，其活性的测定对卵巢恶性肿瘤的早期诊断和鉴别诊断起重要 作用，对估计患者预后也有重要意义。
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作者简介：杨秀芝(1966-)，女，主治医师
参考文献：
[1]Blackburn EH.Telomerase:no end in sight[J].Cell,1994,7:621-623 .
[2]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of h uman telom erase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266:2011.
[3]Zhang W,Kapusta LR,Slingerland JM,et al.Telomerase activity i n prostate cancer,prostatic intraepthelial neoplasia,and benign prostatic epithelium[J]. Cancer Res,1998,58:619.
, 百拇医药
[4]Yoshida K,Sugino T,Goodison S,et al.Detection of telomerase a ctivity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical im plication[J].Br J Cancer,1997,75:548-553.
[5]Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer[J].Cancer Res,1995,55(15):3258-3262.
[6]Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in r espiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas[J].Cancer Rds ,1997,57:2373-2377.
, http://www.100md.com
[7]张方信，邓芝云，张学庸，等，.大肠癌组织中的端粒酶活性变化[J]. 西北国防医学杂志，1999，20(2)：89-91.
[8]Counter CM,Hirte HW,Bacchettis,et al.Telomerase activity in h uman ovarian carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:2900.
[9]Zheng PS,Iwasaka T,Yamaski F,et al.Telomerase activity in gyn ecologic tumors[J].Gynecol Oncol,1997,64:171.
[10]Murakami J，Nagai N,Ohama K,et al.Telomerase activity in o varian tumors[J].Am cancer Society,1997,6:1085-1091.
收稿日期：2000-01-18 修回：2000-04-01, 百拇医药
单位：杨秀芝(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；陈必良(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；苏明权(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；辛晓燕(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)；王德堂(第四军医大学西京医院，陕西 西安 710033)
关键词：卵巢肿瘤；端粒酶活性；表达
西北国防医学杂志000415摘要：目的：研究测定端粒酶活性在诊断和预测卵巢肿瘤 方面的意义。方法：应用PCR-TRAP法检测30例卵巢肿瘤 组织(良性组织8例，交界性或低度 恶性肿瘤7例，恶性肿瘤15例)的端粒酶活性。结果：8例 卵巢良性组织中均未测出端粒酶活 性，7例卵巢交界性或低度恶性肿瘤组织中，4例(57%)端粒酶活性阳性表达，15例卵巢恶性 肿 瘤组织中，14例(93.3%)端粒酶活性阳性表达。卵巢上皮性恶性肿瘤组织中，在组织类型、 组 织学分级及肿瘤分期之间无显著性差异。结论：端粒酶活 性的检测不仅有助于卵巢肿瘤的诊断和鉴别诊断，且有助于预测患者的预后。
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中图分类号：R 737.31 文献标识码 ：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0282-03
Telomerase activity in ovarian tumors tissues and its clinical sig nificance
YANG Xiu-zhi,CHEN Bi-liang,SU Ming-quan,et al.
(Department of Obstetrics and Gynecology,Xijing Hospital,The 4th Military Medi cal University,710033，China)
Abstract:Objective:To evaluate the role of telomeras e activity in the genesis an d development of ovarian tumors and its clinical significance.Meth ods:Telomerase activity in ovarian tumor tissues was determined using PCR-TRAP.These specimen s were abtained from 30 patients with ovarian tumors,including 8 benign,7 border line or low malignant(LMP),and 15 malignant tumors.Results:Telomerase activity w as detected in 4 of 7 LMP tumors(57%)and in 14 of 15 malignant tumors(93.3%)bu t not in 8 benign tumors.There were no significant correlation among the general positive rate of telomerase activity histological substypes,histological gr ades or tumor stages.Conclusion:The detection of tel omerase activity is not only useful in dianosis and differential diagnosis of ovarian tumors,but also helpfu l in predicting prognosis of patient with malignant ovarian tumors.
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Key words:Ovarian neoplasms; Telomerase activity; Expression
无限增殖是癌细胞的重要生物学特性。研究发现端粒酶与细胞分裂及寿命控制有密切关 系，在细胞癌变早期由于端粒酶的活性增强，致使端粒的长度得以维持，细胞染色体形态得 到稳定，从而逃避了因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞获得永生化[1]。端粒 酶活性在人体多数肿瘤组织中均获检出。我们采用端粒重复扩增PCR(PCR-TRAP)方法对我院 30例卵巢肿瘤组织进行端粒酶活性检测，了解端粒酶活性在卵巢肿瘤组织中的表达及在诊断 和预测卵巢肿瘤预后方面的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 组织标本来源：30例卵巢肿瘤组织 均为我院1999-03～09手术切除标本，包括 8例卵巢良性肿瘤，7例交界性肿瘤，15例恶性肿瘤。所有病例均经病理学证实。获取的新鲜 组织标本立即置-20℃冻存。
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1.1.2 端粒酶检测试剂：由Oncor公司提 供。
1.2 方法
1.2.1 端粒酶的提取：手术切除的卵巢肿 瘤组织50 mg，置液氮速冻后用组织研磨器研 成粉末，PBS缓冲液洗涤一次，10 000 g.min-1离心1 min，弃洗液，加入100 μl 预 冷的裂解液(10 mmol.L-1 Tris-HCL pH7.5;1 mmol.L-1 EGTA；1mmol.L -1二巯基乙醇；0.5%CHAPS；10%甘油5)，混合后冰浴裂解30 min，12 000 g.min -14℃离心20 min，上清即为端粒酶提取物，或-20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增：PCR反应总体积为50 μl ，包括10×TRAP反应液5.0 μl，2.5 mmol. L-1 dNTPs mix 1.0 μl，Ts引物1.0 μl，Taq DNA聚合酶2U，端粒酶提取物2.0 μ l，无菌石蜡油30 μl，离心片刻，置30℃反应30 min后，加CX引物1.0 μl，进入PCR循环 ，循环条件为：94℃3 min→94℃30 s→48℃30 s→72℃30 s，35次循环，最后72℃延伸5 m in。
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1.2.3 产物的检测：取PCR扩增产物15 μ l，于10%非变性聚丙烯酰胺凝胶200V电泳9 0 min，将凝胶小心取出置于0.1 μg.ml-1的EB液中染色15 min，再用蒸馏水漂洗 两 次，紫外灯下观察结果并拍照。反应以TSR8阳性模板为阳性对照，含36 bp的内对照(Oncor 公司)，1×CHAPS裂解液代替组织裂解液为空白对照，每一样品均设立端粒酶热失活对照(PC R-TRAP反应前将细胞裂解物于85℃处理15 min，使端粒酶失活)。
1.2.4 统计学处理：采用χ2检验进行 统计学处理。
2 结果
2.1 卵巢肿瘤组织中端粒酶活性的表达：8例卵巢良性肿瘤组织中：包括卵巢粘液性囊 腺瘤2例，卵巢浆液性囊腺瘤2例，卵巢血管平滑肌瘤2例，卵巢子宫内膜异位囊肿2例，端粒 酶活性均呈阴性。在7例交界性或低度恶性卵巢肿瘤组织中，包括2例交界性粘液性囊腺瘤， 2例交界性浆液性囊腺瘤，2例支持细胞瘤，1例粒层细胞卵泡膜细胞瘤，4例端粒酶阳性表达 ，3例端粒酶为阴性。在15例卵巢恶性肿瘤组织中，包括卵巢浆液性囊腺 癌6例，粘液性囊腺癌2例，子宫内膜样癌4例，恶性畸胎瘤1例，转移性癌2例，14例端粒酶 活性阳性表达，1例端粒酶活性为阴性。结果见表1。
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表1 卵巢肿瘤组织中端粒酶活性表达 肿瘤
例数
阳性例数
阴性例数
阳性率(%)
良性
8
0
8
0
交界性
7
4
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3
57.0
恶性
15
14
1
93.3
注：compared to benign:P<0.05
2.2 端粒酶活性与肿瘤组织学的关系：虽然我们的方法是端粒酶活性的定性检测，但发 现卵巢恶性肿瘤的端粒酶活性与肿瘤的组织类型、组织分级、肿瘤分期无明显的相关性。
3 讨论
自1994年Kim[2]建立了高效敏感的以PCR为基础的端粒重复扩增(TRAP)方法以来， 端粒酶引起了人们的广泛关注。近年文献报道，绝大部分肿瘤呈端粒酶酶阳性，而在邻近正 常人体组织细胞或良性肿瘤则为阴性[3]，在恶性肿瘤针吸标本、尿液、肠道冲洗 液中，端粒酶活性的检测也有较高的表达，有助于肿瘤的早期诊断[4]。Hiyama等 [5]对乳腺癌、胃癌病人的研究发现，端粒酶阳性者肿瘤体积大，淋巴结转移率高 ，预后差。端粒酶活性与肿瘤的大小、淋巴结的转移、肿瘤的分级和预后密切相关。提示端 粒酶阳性的肿瘤比阴性的肿瘤有更大的恶性倾向。但本组发现端粒酶活性与肿瘤组织学类型 、分级及分期无明显相关性，其原因目前尚不清楚。在胃癌、乳腺癌、肠癌、甲状腺癌、肺 癌中，随肿瘤的恶性表型的增加，端粒酶活性的检出率和强度也增加[6，7]。19 94年Counter等[8]首次报道晚期卵巢上皮癌腹水细胞端粒酶阳性，此后Zheng等 [9]检测了多种妇科肿瘤，发现恶性妇科肿瘤端粒酶阳性率达95%以上，而在正常对 照组或良性妇科肿瘤中均为阴性，认为端粒酶检测可作为生殖道恶性肿瘤的标记物。Muraka mi[10]等采用TRAP法发现25例恶性卵巢肿瘤中有23例(92%)表达端粒酶活性，6 例交界性肿瘤有1例为端粒酶阳性，10例良性肿瘤中有2例端粒酶阳性，恶性和低分化卵巢肿 瘤活性较其它肿瘤端粒酶恶性高得多。作者发现：8例卵巢良性肿瘤组织，端粒酶活性均呈 阴性。此结果与文献报道[9]不太相符，我们认为可能与所检测标本量的多少有关 。但在7例交界性或低度恶性卵巢肿瘤组织中，4例端粒酶阳性表达，3例端粒酶活性为 阴性。这些结果与文献报道[9，10]基本一致，显示端粒酶活性的改变可以作为恶 性肿瘤的早期分子生物学标志，其活性的测定对卵巢恶性肿瘤的早期诊断和鉴别诊断起重要 作用，对估计患者预后也有重要意义。
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作者简介：杨秀芝(1966-)，女，主治医师
参考文献：
[1]Blackburn EH.Telomerase:no end in sight[J].Cell,1994,7:621-623 .
[2]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of h uman telom erase activity with immortal cells and cancer[J].Science,1994,266:2011.
[3]Zhang W,Kapusta LR,Slingerland JM,et al.Telomerase activity i n prostate cancer,prostatic intraepthelial neoplasia,and benign prostatic epithelium[J]. Cancer Res,1998,58:619.
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[4]Yoshida K,Sugino T,Goodison S,et al.Detection of telomerase a ctivity in exfoliated cancer cells in colonic luminal washings and its related clinical im plication[J].Br J Cancer,1997,75:548-553.
[5]Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer[J].Cancer Res,1995,55(15):3258-3262.
[6]Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in r espiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinomas[J].Cancer Rds ,1997,57:2373-2377.
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[7]张方信，邓芝云，张学庸，等，.大肠癌组织中的端粒酶活性变化[J]. 西北国防医学杂志，1999，20(2)：89-91.
[8]Counter CM,Hirte HW,Bacchettis,et al.Telomerase activity in h uman ovarian carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:2900.
[9]Zheng PS,Iwasaka T,Yamaski F,et al.Telomerase activity in gyn ecologic tumors[J].Gynecol Oncol,1997,64:171.
[10]Murakami J，Nagai N,Ohama K,et al.Telomerase activity in o varian tumors[J].Am cancer Society,1997,6:1085-1091.
收稿日期：2000-01-18 修回：2000-04-01, 百拇医药