微波仪在免疫组织化学中的应用
作者：黄克斌 范智勇 朱峰
单位：黄克斌(解放军第三医院病理科，陕西 宝鸡 721004)；范智勇(解放军第三医院病理科，陕西 宝鸡 721004)；朱峰(解放军第三医院病理科，陕西 宝鸡 721004)
关键词：病理学；微波；免疫组化
西北国防医学杂志000435 中图分类号：R 446.8 文献标识码 ：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0315-01
微波(MW)辅助修复抗原技术在组织病理学的应用日趋广泛。我们将微波技术引入SP法中 ，并应用4种抗体进行常规免疫组化标记，与标准SP法、MW-ABC法对照。结果显示其是一种 快捷而有效的方法，报告如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 组织标本：为本科19 80～1996年活检确诊胶质瘤存档蜡块，标本均经10%福尔马林 固定，常规4 μm连续切片，附贴于涂有多聚-L-赖氨酸的玻片上备用。
1.2 试剂：P16、Rb、EGF R、CyclinD1及SP试剂盒，均为 美国Maxim Biotech公司产品；多聚-L-赖氨酸购自福州迈新生物技术公司。
1.3 微波仪：ID-Ⅱ医用微波仪(上海中达医学应用研究所生产)。
1.4 操作方法：(1)MW-S P法：①组织切片入湿盒，置MW中档(350W)，辐射5 min，92～95℃，脱蜡水化；②0.01 mol .L-1柠檬酸缓冲液冲洗(pH 6.0)，92～95℃，辐射5 min，冷却至40℃后，PBS液(0.01 mol.L-1 pH 7.2～7.4)冲洗2 min×3次；③加A 液1滴，MW辐射3 min，PBS冲洗2 min×3次；④加B液1滴，MW辐射3 min，PBS液冲洗2 min× 3次；⑤滴加一抗，MW辐射2 min，PBS冲洗2 min×3次；⑥滴加二抗，MW辐射2 min，PBS冲 洗2 min×3次；⑦滴加D液，MW辐射2 min，PBS冲洗2 min×3次；⑧常规DAB-H2O2，显 色10 min，苏木素复染，吹干后封片。(2)MW-ABC法和SP法与常规染色同。
, 百拇医药
1.5 对照片设置：阳性对 照片购自迈新公司，PBS置换一抗作为阴性对照。
1.6 统计学处理：采用χ 2检验。
2 结果
P16、Rb和Cyclin D1阳性颗粒定位于胞浆和胞核，EGFR阳性颗粒主要位于胞膜；染色结 果判断参照Barnes半定量法[1]，见表1。
MW-SP法阳性着色强度明显优于MW-ABC法和常规SP法(P<0.01)，阳性颗粒定位性极 佳，多数组织片无显著背景染色。MW-SP法标记时间22 min，而标准SP法则需105 min，见 表2。
三种免疫组化染色法相比，MW-SP法染色敏感性高背 景最好；MW-ABC法敏感性次之，有轻 度背景着色；标准SP法敏感性较差，背景着色较深。
, 百拇医药
表1 MW-SP、MW-ABC、SP法染色结果比较 抗原修复法
P16
Rb
EGFR
Cyclin D1
MW-SP法
-
45
23
17
36
+
9
, 百拇医药
16
19
11
17
27
20
19
9
14
24
14
MW-ABC法
, 百拇医药
-
62
54
49
55
+
15
17
22
19
3
8
6
, 百拇医药
5
0
1
3
1
标准SP法
-
48
28
28
43
+
24
, 百拇医药
20
25
15
6
25
17
13
2
7
10
9
注：MW-SP法与MW-ABC法和标准SP法比较， P<0.01；MW-ABC法与标准SP法比较，P<0.05。表2 MW-SP法与标准SP法染色时间的比较 流程
, 百拇医药
染色时间(min)
MW-SP法
标准SP法
抗原修复
6
15
一抗孵育
2
60
二抗孵育
2
10
SP复合物
, http://www.100md.com
2
10
DAB-H2O2
10
10
3 讨论
甲醛作为常规的组织固定剂，因醛基与蛋白质中的氨基交联使抗原决定簇被掩盖，而影响免 疫组化染色的结果，这种作用随固定时间增长而加重[2]，利用微波可缩短染色时 间，增加染色强度[3]。本组MW-SP法敏感性强，操作时间短，其阳性率与MW-AB C法和标准SP法比较差异性显著(P<0.01)，这可能由于：①利用微波的热效应，直接 碰撞作用及其辅助效应使抗原得到了较充分的修复和暴露；②该法含有链霉菌抗生物素蛋白 (SA蛋白，分子量约为60KD)，其穿透力比ABC复合物大，反应速度快，且SA有四个亚基，都 具有与生物素连接的部位，二者间有极强的亲和力，SA的等电点接近6.5，近中性，几乎不 与组织中的内源性凝集样物质发生非特异结合，因而既可以产生低背景，又可以提高其放大 效果[4]。此法整个标记流程22 min内完成，较标准SP法省时80多min，这对于快速 病理诊断以及冰冻切片中免疫组化标记具有重要意义。在使用该法抗原修复抗体时，修复温 度过高易导致脱片，我们在实验中发现修复温度在92～95℃最宜。另外，微波功率也 不宜过高，过高可致抗体挥发，甚至细胞结构受损，背景着色加深。在实验室工作中要不断 摸索，在实践中掌握合适的MW功率、辐射时间及修复温度。
, http://www.100md.com
作者简介：黄克斌(1972-)，男，技师
参考文献：
[1]Barnes DM,Dublin EM,Fisher CJ,et al.Immunohistochemical det ection of P53 protein in mammry carcinoma:an important new in dependent in dictor of prognosis[J].Hum Pathol,1993,24:469-476.
[2]Ng CS,Cham JK,Lo STH,et al.Critial assesment of four monoclon al antibod ies reactive with B-cells in formalin-fixed paraffin-embedded tissues [J]. Histopathology,1987,11:1243-1247.
[3]纪小龙，曹晓哲，胡南南.微波炉在临床快速病理技术中的应用[J].临 床与实验病理学杂志，1995，11：334-336.
[4]任占平.应用SP免疫组化染色法的体会[J].诊断病理学杂志，1994，1( 3)：176.
收稿日期：1999-09-10 修回：1999-10-20, 百拇医药
单位：黄克斌(解放军第三医院病理科，陕西 宝鸡 721004)；范智勇(解放军第三医院病理科，陕西 宝鸡 721004)；朱峰(解放军第三医院病理科，陕西 宝鸡 721004)
关键词：病理学；微波；免疫组化
西北国防医学杂志000435 中图分类号：R 446.8 文献标识码 ：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0315-01
微波(MW)辅助修复抗原技术在组织病理学的应用日趋广泛。我们将微波技术引入SP法中 ，并应用4种抗体进行常规免疫组化标记，与标准SP法、MW-ABC法对照。结果显示其是一种 快捷而有效的方法，报告如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 组织标本：为本科19 80～1996年活检确诊胶质瘤存档蜡块，标本均经10%福尔马林 固定，常规4 μm连续切片，附贴于涂有多聚-L-赖氨酸的玻片上备用。
1.2 试剂：P16、Rb、EGF R、CyclinD1及SP试剂盒，均为 美国Maxim Biotech公司产品；多聚-L-赖氨酸购自福州迈新生物技术公司。
1.3 微波仪：ID-Ⅱ医用微波仪(上海中达医学应用研究所生产)。
1.4 操作方法：(1)MW-S P法：①组织切片入湿盒，置MW中档(350W)，辐射5 min，92～95℃，脱蜡水化；②0.01 mol .L-1柠檬酸缓冲液冲洗(pH 6.0)，92～95℃，辐射5 min，冷却至40℃后，PBS液(0.01 mol.L-1 pH 7.2～7.4)冲洗2 min×3次；③加A 液1滴，MW辐射3 min，PBS冲洗2 min×3次；④加B液1滴，MW辐射3 min，PBS液冲洗2 min× 3次；⑤滴加一抗，MW辐射2 min，PBS冲洗2 min×3次；⑥滴加二抗，MW辐射2 min，PBS冲 洗2 min×3次；⑦滴加D液，MW辐射2 min，PBS冲洗2 min×3次；⑧常规DAB-H2O2，显 色10 min，苏木素复染，吹干后封片。(2)MW-ABC法和SP法与常规染色同。
, 百拇医药
1.5 对照片设置：阳性对 照片购自迈新公司，PBS置换一抗作为阴性对照。
1.6 统计学处理：采用χ 2检验。
2 结果
P16、Rb和Cyclin D1阳性颗粒定位于胞浆和胞核，EGFR阳性颗粒主要位于胞膜；染色结 果判断参照Barnes半定量法[1]，见表1。
MW-SP法阳性着色强度明显优于MW-ABC法和常规SP法(P<0.01)，阳性颗粒定位性极 佳，多数组织片无显著背景染色。MW-SP法标记时间22 min，而标准SP法则需105 min，见 表2。
三种免疫组化染色法相比，MW-SP法染色敏感性高背 景最好；MW-ABC法敏感性次之，有轻 度背景着色；标准SP法敏感性较差，背景着色较深。
, 百拇医药
表1 MW-SP、MW-ABC、SP法染色结果比较 抗原修复法
P16
Rb
EGFR
Cyclin D1
MW-SP法
-
45
23
17
36
+
9
, 百拇医药
16
19
11
17
27
20
19
9
14
24
14
MW-ABC法
, 百拇医药
-
62
54
49
55
+
15
17
22
19
3
8
6
, 百拇医药
5
0
1
3
1
标准SP法
-
48
28
28
43
+
24
, 百拇医药
20
25
15
6
25
17
13
2
7
10
9
注：MW-SP法与MW-ABC法和标准SP法比较， P<0.01；MW-ABC法与标准SP法比较，P<0.05。表2 MW-SP法与标准SP法染色时间的比较 流程
, 百拇医药
染色时间(min)
MW-SP法
标准SP法
抗原修复
6
15
一抗孵育
2
60
二抗孵育
2
10
SP复合物
, http://www.100md.com
2
10
DAB-H2O2
10
10
3 讨论
甲醛作为常规的组织固定剂，因醛基与蛋白质中的氨基交联使抗原决定簇被掩盖，而影响免 疫组化染色的结果，这种作用随固定时间增长而加重[2]，利用微波可缩短染色时 间，增加染色强度[3]。本组MW-SP法敏感性强，操作时间短，其阳性率与MW-AB C法和标准SP法比较差异性显著(P<0.01)，这可能由于：①利用微波的热效应，直接 碰撞作用及其辅助效应使抗原得到了较充分的修复和暴露；②该法含有链霉菌抗生物素蛋白 (SA蛋白，分子量约为60KD)，其穿透力比ABC复合物大，反应速度快，且SA有四个亚基，都 具有与生物素连接的部位，二者间有极强的亲和力，SA的等电点接近6.5，近中性，几乎不 与组织中的内源性凝集样物质发生非特异结合，因而既可以产生低背景，又可以提高其放大 效果[4]。此法整个标记流程22 min内完成，较标准SP法省时80多min，这对于快速 病理诊断以及冰冻切片中免疫组化标记具有重要意义。在使用该法抗原修复抗体时，修复温 度过高易导致脱片，我们在实验中发现修复温度在92～95℃最宜。另外，微波功率也 不宜过高，过高可致抗体挥发，甚至细胞结构受损，背景着色加深。在实验室工作中要不断 摸索，在实践中掌握合适的MW功率、辐射时间及修复温度。
, http://www.100md.com
作者简介：黄克斌(1972-)，男，技师
参考文献：
[1]Barnes DM,Dublin EM,Fisher CJ,et al.Immunohistochemical det ection of P53 protein in mammry carcinoma:an important new in dependent in dictor of prognosis[J].Hum Pathol,1993,24:469-476.
[2]Ng CS,Cham JK,Lo STH,et al.Critial assesment of four monoclon al antibod ies reactive with B-cells in formalin-fixed paraffin-embedded tissues [J]. Histopathology,1987,11:1243-1247.
[3]纪小龙，曹晓哲，胡南南.微波炉在临床快速病理技术中的应用[J].临 床与实验病理学杂志，1995，11：334-336.
[4]任占平.应用SP免疫组化染色法的体会[J].诊断病理学杂志，1994，1( 3)：176.
收稿日期：1999-09-10 修回：1999-10-20, 百拇医药