儿童恶性实体瘤组织中人细小病毒B19－DNA的检测
作者：蒙育林 叶江枫 何晋 张国成
单位：蒙育林(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)；叶江枫(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)；何晋(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)；张国成(第四军医大学 西京医院，陕西 西安 710032)
关键词：实验室诊断；人细小病毒B19；实体瘤；P CR
西北国防医学杂志000434
中图分类号：R 446 文献标识码 ：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0314-01
人细小病毒B19(human parvovirus B19，HPV-B19)是细小病毒家族成员之一。1975年C ossar t首先在健康献血员血清中发现了HPV-B19，1981年Pattison和Sergeant分别证实了镰状细 胞 病合并一过性再生障碍危象与HPV-B19感染的关系，此后有关该病毒与人类疾病关系的报道 日 渐增多。我们用巢式多聚酶链反应(PCR)技术对46例儿童恶性实体瘤组织作了B19-DNA检测 ，探讨HPVB19感染与儿童恶性实体瘤的关系。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料：实体瘤标本取 自第四军医大学西京医院和西安市儿童医院病理科1994～1998 年病理档案的石蜡包埋组织。恶性实体瘤组46例(肾母细胞瘤17例、神经母细胞瘤14例、髓 母细胞瘤11例、恶性淋巴瘤4例等)，男30例，女16例；年龄2～13岁。取同期非肿瘤小儿手 术切除组织26例作对照。
1.2 试剂
1.2.1 病毒来源：HPV-B19质粒来自沙 特皇家医院研究中心(KFSH Research Center),经提纯后含量为70 mg.L-1。
1.2.2 引物：按文献[1]方法 合成，第一对引物IS对应于B19-DNA碱基位置 为2905-2924，2A对应于4016-3997，循环后产物为1 112 bp，引物碱基顺序为IS：5′-C T TTAGGTATAGCCAACTGG-3′；2A：5′-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3′；第二对引物3S对应于B 19-DNA碱基位置为3187-3206，4A对应于3290-3271，产物为104 bp，引物碱基顺序为3 S：5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′；4A：5′-CCTTATAATGGTGCTCTGGG-3′。
, 百拇医药
1.2.3 其它试剂：Tag DNA聚合酶，4× dNPTs，10×PCR buffer和琼脂糖(美国Perkin E lmer Cetus公司)，蛋白酶K(美国Merck公司)，PGEM Marker，(华美生物工程公司)。
1.3 标本处理及DNA提取
1.3.1 石蜡包埋块切成10 μm厚组 织片，经正辛烷脱蜡，无水乙醇脱脂，SDS及蛋白 酶K裂解消化，酚、氯仿异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，750 ml.L-1酒精冲洗沉淀片 ，晾干后用pH 8.0 TE(10 mmol.L-1，Tris，HCl，1 mmol.L-1 EDTA)溶解 ，-20℃保存待检。
1.4 巢式PCR扩增B19-DNA方法同[1]：50 μl反应体系中双蒸水36 μl，10× PCR buffer5 μl，10 mmol.L-14×dNTPs 1 μl，Tag酶1 U，外引物1 S，2A各 300 ng，模板5 μl(阳性对照1 μl，阴性对照以双蒸水作模板)，混匀后用石蜡油30 μl覆 盖。PCR循环条件为：93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个周期后72℃充分延伸10 min，取第一次扩增产物5 μl为模板， 以内引物3S，4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第二次PCR循环。
, http://www.100md.com
1.5 结果观察：取第二次 PCR循环产物10 μl与2 μl溴酚蓝混合，加样于含溴化乙锭(EB )的20 g.L-1琼脂糖凝胶电泳30 min，紫外分析仪上观察，104 bp处出现金黄色电 泳带者为阳性。
1.6 统计学方法：χ2 检验。
2 结果
小儿恶性实体瘤组HPV-B19 DNA阳性率19.6%(9/46)，其中肾母细胞瘤23.5%(4/17)、神 经母细胞瘤14.3%(2/14)、髓母细胞瘤18.2%(2/11)、恶性淋巴瘤25%(1/4)，非肿瘤组 HPV-B19 DNA全部阴性，恶性肿瘤组HPV-B19 DNA阳性率显著高于非肿瘤组(P<0.05) ，4种肿瘤组织均可检出HPV-B19 DNA。
3 讨论
, 百拇医药
病毒感染是肿瘤发生发展的一个可能病因，HPV-B19感染是否与儿童恶性肿瘤的发生相关， 至今尚未明了，Gray A[2]用PCR法检测了39例成人睾丸肿瘤组织，HPV-B19-DNA 阳 性率高达85%(33/39)。作者认为HPV B19在成人睾丸肿瘤形成过程中起重要作用或对肿瘤 细胞有亲嗜性。我们用巢式PCR技术对46例儿童恶性实体瘤组织作了B19-DNA检测，发现HPV -B19 阳性率为19.6%，显著高于非肿瘤组，证实儿童恶性实体瘤组织存在HPV-B19感染，提示HP V-B19对肿瘤细胞有亲嗜性，HPV-B19感染可能与肿瘤的形成相关。然而现已知有些细小病 毒(如腺相关病毒、鼠的细小病毒)[3，4]有抗肿瘤作用，而HPV B19是否有抗肿瘤 作用有待进一步研究。
作者简介：蒙育林(1966-)，男，硕士，主治医师
参考文献：
, 百拇医药 [1]Musiani M,Azzi A,Zerbini M,et al.Nested polymerase chain reac tion assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiencyvi rus patients[J].J MED Virol,1993,40(2):157-160.
[2]Gray A,Guillou L,Zufferey J,et al.Persistence of parvovirus B 19 DNA in testis of patients with testicular germ cell tumours[J].J Gen Virol ,1998,79:573-579.
[3]Hermonat PL.Down-regulation of the human c-fos and c-myc proto -oncogene promoters by adeno-associated virus Rep78[J].Cancer Lett,1994,81( 2):129-136.
[4]Anouia F,Wattiez R,Mousset S,et al.The cytotoxcity of parvovi rus minute virus of mice nonstructural protein NS1 is related to changes in the syntheis and phosphorylation of cell proteins[J].J Virol,1997,71(6):4671-467 8.
收稿日期：1999-11-16 修回：1999-12-20, http://www.100md.com
单位：蒙育林(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)；叶江枫(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)；何晋(兰州军区乌鲁木齐总医院，新疆 乌鲁木齐 830000)；张国成(第四军医大学 西京医院，陕西 西安 710032)
关键词：实验室诊断；人细小病毒B19；实体瘤；P CR
西北国防医学杂志000434
中图分类号：R 446 文献标识码 ：A 文章编号：1007-8622(2000)04-0314-01
人细小病毒B19(human parvovirus B19，HPV-B19)是细小病毒家族成员之一。1975年C ossar t首先在健康献血员血清中发现了HPV-B19，1981年Pattison和Sergeant分别证实了镰状细 胞 病合并一过性再生障碍危象与HPV-B19感染的关系，此后有关该病毒与人类疾病关系的报道 日 渐增多。我们用巢式多聚酶链反应(PCR)技术对46例儿童恶性实体瘤组织作了B19-DNA检测 ，探讨HPVB19感染与儿童恶性实体瘤的关系。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料：实体瘤标本取 自第四军医大学西京医院和西安市儿童医院病理科1994～1998 年病理档案的石蜡包埋组织。恶性实体瘤组46例(肾母细胞瘤17例、神经母细胞瘤14例、髓 母细胞瘤11例、恶性淋巴瘤4例等)，男30例，女16例；年龄2～13岁。取同期非肿瘤小儿手 术切除组织26例作对照。
1.2 试剂
1.2.1 病毒来源：HPV-B19质粒来自沙 特皇家医院研究中心(KFSH Research Center),经提纯后含量为70 mg.L-1。
1.2.2 引物：按文献[1]方法 合成，第一对引物IS对应于B19-DNA碱基位置 为2905-2924，2A对应于4016-3997，循环后产物为1 112 bp，引物碱基顺序为IS：5′-C T TTAGGTATAGCCAACTGG-3′；2A：5′-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3′；第二对引物3S对应于B 19-DNA碱基位置为3187-3206，4A对应于3290-3271，产物为104 bp，引物碱基顺序为3 S：5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′；4A：5′-CCTTATAATGGTGCTCTGGG-3′。
, 百拇医药
1.2.3 其它试剂：Tag DNA聚合酶，4× dNPTs，10×PCR buffer和琼脂糖(美国Perkin E lmer Cetus公司)，蛋白酶K(美国Merck公司)，PGEM Marker，(华美生物工程公司)。
1.3 标本处理及DNA提取
1.3.1 石蜡包埋块切成10 μm厚组 织片，经正辛烷脱蜡，无水乙醇脱脂，SDS及蛋白 酶K裂解消化，酚、氯仿异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，750 ml.L-1酒精冲洗沉淀片 ，晾干后用pH 8.0 TE(10 mmol.L-1，Tris，HCl，1 mmol.L-1 EDTA)溶解 ，-20℃保存待检。
1.4 巢式PCR扩增B19-DNA方法同[1]：50 μl反应体系中双蒸水36 μl，10× PCR buffer5 μl，10 mmol.L-14×dNTPs 1 μl，Tag酶1 U，外引物1 S，2A各 300 ng，模板5 μl(阳性对照1 μl，阴性对照以双蒸水作模板)，混匀后用石蜡油30 μl覆 盖。PCR循环条件为：93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个周期后72℃充分延伸10 min，取第一次扩增产物5 μl为模板， 以内引物3S，4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第二次PCR循环。
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1.5 结果观察：取第二次 PCR循环产物10 μl与2 μl溴酚蓝混合，加样于含溴化乙锭(EB )的20 g.L-1琼脂糖凝胶电泳30 min，紫外分析仪上观察，104 bp处出现金黄色电 泳带者为阳性。
1.6 统计学方法：χ2 检验。
2 结果
小儿恶性实体瘤组HPV-B19 DNA阳性率19.6%(9/46)，其中肾母细胞瘤23.5%(4/17)、神 经母细胞瘤14.3%(2/14)、髓母细胞瘤18.2%(2/11)、恶性淋巴瘤25%(1/4)，非肿瘤组 HPV-B19 DNA全部阴性，恶性肿瘤组HPV-B19 DNA阳性率显著高于非肿瘤组(P<0.05) ，4种肿瘤组织均可检出HPV-B19 DNA。
3 讨论
, 百拇医药
病毒感染是肿瘤发生发展的一个可能病因，HPV-B19感染是否与儿童恶性肿瘤的发生相关， 至今尚未明了，Gray A[2]用PCR法检测了39例成人睾丸肿瘤组织，HPV-B19-DNA 阳 性率高达85%(33/39)。作者认为HPV B19在成人睾丸肿瘤形成过程中起重要作用或对肿瘤 细胞有亲嗜性。我们用巢式PCR技术对46例儿童恶性实体瘤组织作了B19-DNA检测，发现HPV -B19 阳性率为19.6%，显著高于非肿瘤组，证实儿童恶性实体瘤组织存在HPV-B19感染，提示HP V-B19对肿瘤细胞有亲嗜性，HPV-B19感染可能与肿瘤的形成相关。然而现已知有些细小病 毒(如腺相关病毒、鼠的细小病毒)[3，4]有抗肿瘤作用，而HPV B19是否有抗肿瘤 作用有待进一步研究。
作者简介：蒙育林(1966-)，男，硕士，主治医师
参考文献：
, 百拇医药 [1]Musiani M,Azzi A,Zerbini M,et al.Nested polymerase chain reac tion assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiencyvi rus patients[J].J MED Virol,1993,40(2):157-160.
[2]Gray A,Guillou L,Zufferey J,et al.Persistence of parvovirus B 19 DNA in testis of patients with testicular germ cell tumours[J].J Gen Virol ,1998,79:573-579.
[3]Hermonat PL.Down-regulation of the human c-fos and c-myc proto -oncogene promoters by adeno-associated virus Rep78[J].Cancer Lett,1994,81( 2):129-136.
[4]Anouia F,Wattiez R,Mousset S,et al.The cytotoxcity of parvovi rus minute virus of mice nonstructural protein NS1 is related to changes in the syntheis and phosphorylation of cell proteins[J].J Virol,1997,71(6):4671-467 8.
收稿日期：1999-11-16 修回：1999-12-20, http://www.100md.com