人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达
作者：刘家云 于文彬 马越云 范金水 丁振若 苏明权 陈云春
单位：刘家云(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；于文彬(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；马越云(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；范金水(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；丁振若(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；
关键词：杀菌/通透性增加蛋白；逆转录PCR；序列分析；基因重组；；真核表达
第四军医大学学报000441 摘 要: 目的 构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的 真核表达载体 并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法 提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转 录反应，经套式PCR扩增出BPI N端基因片段，将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序 列测定，然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI；重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞，免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果 酶切鉴定和序列分析证实重组 质粒含有包括 信号肽在内的BPI活性片段编码序列，转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性 的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功，为下一步BPI功能 的研究奠定了基础.
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中图号：：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-S0041-05
Construction of eucaryotic expression vector of bioactive fragment gene of human bactericidal/permeability-increasing protein and its expression in COS-7 cells
LIU Jia-Yun, YU Wen-Bin, MA Yue-Yun, FAN Jin-Shui,DING Zhen-Ruo, SU Ming- Quan, CHEN Yun-Chun
(Center of Clinical Molecular Biology, Xijing Hospital, Fourth Military M edical University, Xi'an 710033,China)
, 百拇医药
Abstract: AIM To construct the eucaryotic expression ve ctor of the cDNA sequence encoding bioactive N-terminal fragment of human bacte ricidal / permeability-increasing protein (BPI) and to express it in COS-7 cel ls. METHODS Total RN A was extracted from human polymorphonuclear neutrophils (PMN) and subjected to reverse transcription, and then the human BPI cDNA gene was amplified by nested PCR. The PCR product was cloned into pUC19 plasmid and the sequence was confirme d by restriction enzyme digestion and dideoxy-mediated-chain termination. Then the specific BPI encoding region fragment was subcloned into pcDNA3 plasmid to form the pcDNA-BPI eucaryotic expression vector. The recombinant plasmid was tr ansfected into COS-7 cells with liposome transfection reagent for transient exp ression. The expression of BPI was identified by immunofluorescent assay. RESULTS R estriction enzyme digestion and DNA sequence analysis revealed that the encoding sequence of signal peptide and bioactive N-terminal fragment of BPI were not o n ly identical to those of the published human BPI sequence but also were containe d in the recombinant vector. The recombinant vector could express bioactive BPI fragment in COS-7 cells. CONCLUSION The construction of eucar yotic expression ve ctor of bioactive fragment of human bactericidal/permeability-increasing protei n and its expression in COS-7 cells were both successful, which is helpful to f urther study on the role of BPI.
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Keywords:bactericidal/permeability increasing protein (BPI ); reverse transcription polymerase chain reaction; sequence analysis;gene r ecombination；eucaryotic expression
0 引言
1978年Weiss等[1]从健康和慢性粒细胞白血病患者的多型核白细胞(polymorphon uclear neutrophils, PMN)中提取得到一种表观分子量为55 U，等电点为pH 9.8的蛋白质 ，因其对数株大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁 的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素D得以穿过细胞壁而进入菌体，因而 称之为杀菌通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI). B PI是456 个氨基酸组成的阳离子蛋白，对革兰氏阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功 能，尤为 值得注意的是BPI N端活性片段与BPI具有相似的生物学功能，二者均和革兰氏阴性菌脂多糖 (l ipopolysaccharide，LPS)具有较高的亲和力，同后者结合所形成的BPI-LPS复合物能抑制L PS的炎性级联信号向CD14的传导，从而阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应[2] . 此外， 越来越多的研究表明，BPI在抗真菌感染[3]、抗弓形虫感染[4]等方面也 具有重要的意义， 并且在儿科重症脑膜炎血症、部分肝切除、出血性创伤、重症腹膜感染以及囊性纤维化等多 种疾病的治疗方面显示出良好的应用前景[5]. 为了获取大量的BPI重组蛋白，以深入研究BPI的生物学功能，探讨其杀菌和中和内毒素作用 机制，本文从人外周血中提取PMN 总RNA，经RT-PCR获得BPI cDNA，构建了BPI真核表达载 体，并对其在COS-7细胞中的表达产物进行了鉴定.
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及细胞系 E.col i JM109，pUC19为本室保存，pcDNA3含CMV 早期启动子 和新霉素(Neomycin)抗性基因；COS-7细胞系由本校病理学教研室邢金良硕士惠赠 ，其培养基为DMEM完全培养基，含100 mL.L-1小牛血清.
1.1.2 酶及其他试剂 PWO DNA polymerase，T4 DNA ligase购自Boehringer公 司；Reverse Transcription System，BamHⅠ，XbaⅠ，XgaⅠ，IPTG和Wizard ○ R Plus Mini preps DNA Purification System,均购自Promega公司；核酸的凝胶纯化试剂盒NucleoTrap○ R Nucleic Acid Purification Kits and Accessories,购自Clontech公司 ；Pol ymorphprepTM PMN分离液,购自Nycomed Pharmas 公司；RNA提取试剂Trizol Reagent ，脂质体转染试剂Lipofecta mine Reagent，DMEM购自Gibco公司；BPI单克隆抗体为HBT公司产品；荧光抗体羊抗鼠IgG- FITC购自华美公司；小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.
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1.2 方法
1.2.1 质粒提取、酶切、连接及转化 主要方法均参照文献[6]进行.
1.2.2 PCR引物的设计与合成 运用计算机软件辅助分析，根据BPI 主要的活性 片段N端序列 ，设计两套引物采用套式PCR扩增目的基因，其中外引物P1，P2扩增BPI cDNA第7-840 bp， 内引物P3，P4扩增BPI cDNA第25-749 bp，并在引物P3，P4分别引入酶切位点BamHⅠ和 XbaⅠ，引物由上海生工生物工程公司合成. 引物设计见Fig 1.
图 1 BPI N端序列及引物的设计
Fig 1 Sequence of cDNA encoding N-terminal fragment of BPI and prime rs
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□labelled sequence: Primers; underlined sequence: Signal pept ide
1.2.3 PMN提取 收集PMN >80%的临床检验用EDTA抗凝血15 mL，取50 m L离心管加入等量PolymorphprepTM分离液，小心地将全部抗凝血加至分离液层面上 ，室温 下400～450 g离心40 min，轻轻吸出PMN并稀释于等体积的4.5 g.L-1 NaCl溶液 ，PMN细胞悬液再用生理盐水洗涤3次，每次400 g，10 min，记数PMN细胞数.
1.2.4 细胞总RNA的提取 参照Trizol Reagent Kit中的说明书进行;于1.5 mL离心管中加入(5～10)×106 PMN，取1 mL Trizol试剂加于管中反复吹打，待核蛋 白 完全溶解；室温下静置5 min，加0.2 mL三氯甲烷，用力振荡15 s，室温下静置2～3 min，4 ℃，11 000 g离心15 min；吸出上清，加0.5 mL异丙醇，室温下静置10 min，4℃ ，11 000 g离心10 min；弃上清，加1 mL 750 mL.L-1乙醇，4℃，7000 g 离心10 min；弃上清，室 温干燥5～10 min，加20 μL无RNase水溶解，并置55℃水浴10 min，取2 μL用于反转录.
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1.2.5 cDNA第一链合成 在20 μL反应体积中, 含有10 μg RNA, 10×Buffer 2 μL, 10 mmol.L-1 dNTP混合液2 μL, 逆转录酶15 U, 引物P2 1 μL, 于42℃水 浴反应1 h，99℃ 5 min灭活逆转录酶后置-20℃备用.
1.2.6 PCR扩增BPI cDNA片段 首先以反转录产物为模板进行第一轮PCR扩增, 所用引物为P1及P2, 反应体积为50 μL, 反应条件为: 94℃, 2 min; 94℃, 30 s, 55 ℃, 4 5 s, 72℃, 50 s，10×; 94℃, 30 s, 55℃, 45 s, 72℃, 60 s，10×；94℃, 30 s, 55 ℃, 45 s, 72℃, 70 s，10×；94℃, 30 s, 55℃, 45 s, 72℃, 80 s，5×；72℃, 7 min ; 共进行35个循环. 之后以第 一轮PCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增, 所用引物为P3及P4，反应体积为50 μL, 反应 条 件为: 94℃, 2 min；94℃，30 s，60℃，45 s，72℃，60 s，5×；94℃，30 s，65℃，45 s， 72℃, 60 s，10×；94℃；30 s，65℃，45 s，72℃，70 s，10×；94℃，30 s，65℃, 45 s，72℃, 80 s，10×；72℃, 7 min; 共进行35个循环.
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1.2.7 BPI基因克隆 将第2轮PCR产物及pUC19载体分别经BamHⅠ，Xba Ⅰ双酶切，按DNA与载 体3∶1比例于14℃连接过夜. 取上述连接产物2 μL转化感受态细胞JM109, 将转化后的JM10 9涂布于含100 mg.L-1氨苄青霉素及X-gal，IPTG的LB平板上, 37℃培养. 16 h后挑 取白色菌落 ，提取质粒, 经BamHⅠ，XbaⅠ双酶切鉴定.
1.2.8 DNA序列测定、核苷酸序列分析比较 DNA序列测定采用PE公司310型自动 DNA测序仪完成；核苷酸序列分析比较利用网络Entrez Databases及Goldkey软件完成.
1.2.9 真核表达载体的构建 将测序正确的重组pUC19-BPI提取质粒, 双酶切回收BPI片段, 与预先经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切的pcDNA3载体进行连接反应. 以连接反应液转化感 受态JM109, 挑选10个氨苄青霉素抗性的菌落, 小量法提取质粒, 进行酶切鉴定.
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1.2.10 Lipofectamine法转染COS-7细胞 于6孔培养板中加入对数生 长期的COS-7细胞3×105/孔，每孔2 mL DMEM完全培养基，使75%长满. 实验前, 预先配 制Lipofectamine/DNA混合溶液，A液(100 μL无血清DMEM培养基+质粒DNA 2 μg)，B液 (100 μL无血清DMEM培养基+10 μL Lipofectamine)，将A，B两液混合，置室温下孵育30 min，使其形成DNA-Liposome复合物，再加入800 μL不含血清的DMEM配成Lipofectamine/ DNA混合溶液. 轻轻混匀上述混合溶液并滴加到漂洗过的细胞中，37℃，50 mL.L-1 CO2培养6 h，6 h后加入1 mL 含200 mL.L-1 小牛血清的 DMEM培养基，转染20 h后吸弃培养液换为DMEM完全培养基，72 h后收集细胞进 行检测.
, 百拇医药 1.2.11 活细胞免疫荧光法鉴定BPI的表达 转染72 h后，胰蛋白酶消化并收集C OS-7细胞， 用DMEM完全培养基调整细胞为5×106～1×107.mL-1；取40 μL细胞悬液加入预 先有BPI M cAb 10 μL的5 mL离心管，再加50 μL 1∶20稀释的灭活正常兔血清，4℃孵育30 min，洗 涤液洗涤2次 ，2 mL/次，1000 r.min-1离心5 min；弃上清，加50 μL工作浓度的羊抗鼠Ig-FI TC荧光二抗，充 分振荡，4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次，2 mL/次，1000 r.min-1离心5 min；加 固定液100 μL，制片后荧光显微镜下观察.
2 结果
2.1 RNA的完整性及纯度 从人PMN中提取的总RNA经电泳，可见明显的28 ，18和5 s条带，且28 s的亮度大约是18 s的2倍，说明所提取的总RNA基本没有降解， 有较 好的完整性. 对RNA样品进行紫外分光光度分析得出D(260)/D(280)>1.8，表明RNA具有较高 的纯度，符合反转录 要求.
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图 2 BPI基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of BPI gene
1: DNA PCR maker; 2: PCR products of BPI gene; 3: Negative c ontrol
2.2 BPI活性片段基因的扩增 反转录产物经套式PCR扩增，琼脂糖凝胶 电泳可见一条约700 bp的扩增区带(Fig 2), 与预期的结果一致.
2.3 PCR扩增产物的克隆 选择3个重组克隆提取质粒，经双酶切鉴定， 均可切出726 bp的片段(Fig 3), 表明cDNA已克隆于载体中, 命名为pUC-BPI.
2.4 BPI基因片段的序列测定及分析 直接以pUC -BP I为模板进行测序, 得到克隆片段的DNA序列, 经计算机分析, 与已知的包括31aa信号肽序列 在内的人BPI cDNA序列相符，测序结果图略.
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2.5 pcDNA-BPI真核表达载体的构建 测序正确的目的片段基因连接入pcDNA3载体的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点之间. 经筛 选后用双酶切鉴定, 3个重组子均可切出726 bp的片段(Fig 4 )，命名为pcDNA-BPI. 构建策略如Fig 5所示.
图 3 重组质粒pUC19-BPI的酶切鉴定
Fig 3 Identification of recombinant pUC19-BPI plasmid with BamHⅠ and XbaⅠ
1: DNA PCR maker; 2,3,4: Positive clonies; 5:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ
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图 4 重组质粒pcDNA-BPI的酶切鉴定
Fig 4 Identification of recombinant pcDNA-BPI plasmid with BamHⅠ and XbaⅠ
1: DNA PCR maker; 2,3: pcDNA plasmid; 4,5,6: Positive clonies; 7:λDNA/HindⅢ
2.6 BPI在COS-7细胞中的表达 活细 胞免疫荧光染色观察发现，pcDNA3转染的细胞内未见 明显荧光，而经pcDNA-BPI重组质粒转染的COS-7细胞胞质中可见明显荧光，表明pcDNA-B PI片段在COS-7细胞中得到了表达(Fig 6).
3 讨论
PMN为专性吞噬细胞，在宿主防御微生物的侵入中起着重要作用，这类细胞可通过氧依赖和 非氧依赖的机制杀灭来犯细菌，而非氧依赖的杀伤机制则涉及吞噬过程中溶酶体相关的细胞 毒性蛋白和肽释放于吞饮泡. 体内外实验表明，在PMN细胞内诸多抗菌成分中，BPI是 唯一能够直接对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用和中和内毒素作用的抗菌物质[7].
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图 5 真核表达载体pcDNA-BPI的构建
Fig 5 Schematic diagram for construction of eucaryotic expression vector
图 6 转染COS-7细胞中BPI的表达
Fig 6 BPI fragment expression in transfected COS-7 cells
Fluorescence could been seen in the transfected COS-7 cells, whereas untransfected cells could not been observed in the cytoplasm
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为得到BPI基因，以深入研究其结构与功能的关系，Gray等[7]利用寡核苷酸探 针从人肝cDNA 文库中筛选出编码BPI全长的 cDNA克隆，并得到表达. 免疫荧光和放射免疫测定发现BPI为P MN特有的产物，由处于分化阶段的早幼粒细胞合成，贮存于成熟PMN嗜天青颗粒中[8] . 因此我们直接选择PMN细胞为原材料获取BPI cDNA.
用RT-PCR克隆获取目的基因片段是目前最常用的克隆方法，分为一步法和二步法，本实验 采 用二步法进行. 引物包括内外两套，二者扩增片段均包括31aa信号肽序列在内的人BPI cDNA 生物活性N端编码序列，外引物扩增后再用带有酶切位点的内引物进行扩增，保证反应具有 较高的特异性. 实验中首先以oligo(dT)为引物，反转录合成之cDNA第一链为模板进行PCR扩 增，所得产物少且有非特异产物存在，结果不甚理想. 后改用BPI引物P2合成cDNA第一链， 再采用套式PCR进行扩增，适当提高退火温度并延长延伸时间，结果获得726 bp的单一片段.
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pcDNA3为一种真核表达载体，其5′端含CMV早期启动子，复制启始位置带有SV40启动子 ，3′端有polyA尾，能将克隆至其中的目的片段高效表达[9]. COS-7是来源于非 洲绿猴肾成 纤维细胞并经SV40病毒基因转化的细胞系，能组成型地表达SV40 T抗原，使得任何复制启始 位置带有SV40的转染质粒能够以很高的拷贝数进行复制，作为一种真核瞬时表达系统，COS -7是研究蛋白质结构与功能的有利工具，多种载体可用在COS-7细胞中表达外源基因 [6]. 阳 离子脂质体能与DNA形成复合物，该复合物与细胞膜融合，通过细胞内吞作用，使外源DNA转 入 真核细胞内，其优点是转染效率高，低毒性，特异性强，无免疫原性，且方法简单，容易操 作，是转染细胞的重要载体. 因此，选择pcDNA3为真核表达载体，脂质体为转染剂，COS-7 为表达细胞有利于发挥三者的整体优势.
酶切鉴定和序列分析表明，本研究克隆的BPI片段序列正确，重组载体pcDNA-BPI经双酶切 鉴定，切 出了726 bp的DNA片段，说明BPI真核表达载体构建成功；COS-7细胞表达产物能够被抗BPI 单 抗所识别，免疫荧光染色发出荧光，表明所表达的BPI片段具有生物学活性，为下一步BPI功 能的研究奠定了基础.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
作者简介：刘家云(1971-),男(汉族)，云南省宜良人. 硕士生(导师 于文彬教授). Tel.(029)3375572 Email. jiayun98@163.net
苏明权(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；
陈云春(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)
参考文献：
[1] Weiss J, Elsbach P, Olsson I et al. Purification and cha racterization of a p otent bactericidal/permeability-increasing protein from human polymorphonuclear leukocytes[J]. J Biol Chem, 1978; 253(8): 2664-2672.
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[2] Tobias PS, Soldau K, Iovine NM et al. Lipopolysaccharide (LPS) -bin ding proteins BPI and LBP form different types of complexes with LPS[J]. J Biol Chem, 1997; 272(30): 18682-18685.
[3] De Lucca AJ,Walsh TJ. Antifungal peptides:Novel therapeutic compou nds against emerging pathogens[J]. Antimicrob Agents Chemother,1999;43(1): 1-11.
[4] Arnold H, Horwitz, Paul Motchnik et al. Fungicidal pept ides from bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) act synergysticall y with fluconazole on a variety of candida strains[M]. Toronto,ICAAC, 1997:928 -1001
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[5] Elsbach P. The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI ) in antibacterial host defense[J]. J Leukoc Biol, 1998; 64(1): 14-18.
[6] Davis L, Kuehl M, Battey J. Basic methods in molecular b iology (2nd edition)[M]. Norwalk,Connecticut: Appleton & Lange,1993:237-245,61 2-624.
[7] Gray PW, Flaggs G, Leong SR et al. Cloning of the cDNA of a h uman n eutrophil bactericidal protein, structural and functional correlations[J]. J Biol Chem, 1989; 264(16):9505-9509.
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[8] Weiss J, Olsson I. Cellular and subcellular localization of the ba cterici dal/permeability-increasing protein of neutrophils[J]. Blood, 1987; 69(2) : 652-659.
[9] Boshart M, Weber F, Jahn G et al. A very strong enhancer is lo cated upst ream of immediate early gene of human cytomegalovirus[J]. Cell,1985;41(2): 521-530.
收稿日期:1999-11-18; 修回日期:2000-01-25, http://www.100md.com
单位：刘家云(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；于文彬(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；马越云(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；范金水(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；丁振若(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；
关键词：杀菌/通透性增加蛋白；逆转录PCR；序列分析；基因重组；；真核表达
第四军医大学学报000441 摘 要: 目的 构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的 真核表达载体 并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法 提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转 录反应，经套式PCR扩增出BPI N端基因片段，将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序 列测定，然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI；重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞，免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果 酶切鉴定和序列分析证实重组 质粒含有包括 信号肽在内的BPI活性片段编码序列，转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性 的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功，为下一步BPI功能 的研究奠定了基础.
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中图号：：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-S0041-05
Construction of eucaryotic expression vector of bioactive fragment gene of human bactericidal/permeability-increasing protein and its expression in COS-7 cells
LIU Jia-Yun, YU Wen-Bin, MA Yue-Yun, FAN Jin-Shui,DING Zhen-Ruo, SU Ming- Quan, CHEN Yun-Chun
(Center of Clinical Molecular Biology, Xijing Hospital, Fourth Military M edical University, Xi'an 710033,China)
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Abstract: AIM To construct the eucaryotic expression ve ctor of the cDNA sequence encoding bioactive N-terminal fragment of human bacte ricidal / permeability-increasing protein (BPI) and to express it in COS-7 cel ls. METHODS Total RN A was extracted from human polymorphonuclear neutrophils (PMN) and subjected to reverse transcription, and then the human BPI cDNA gene was amplified by nested PCR. The PCR product was cloned into pUC19 plasmid and the sequence was confirme d by restriction enzyme digestion and dideoxy-mediated-chain termination. Then the specific BPI encoding region fragment was subcloned into pcDNA3 plasmid to form the pcDNA-BPI eucaryotic expression vector. The recombinant plasmid was tr ansfected into COS-7 cells with liposome transfection reagent for transient exp ression. The expression of BPI was identified by immunofluorescent assay. RESULTS R estriction enzyme digestion and DNA sequence analysis revealed that the encoding sequence of signal peptide and bioactive N-terminal fragment of BPI were not o n ly identical to those of the published human BPI sequence but also were containe d in the recombinant vector. The recombinant vector could express bioactive BPI fragment in COS-7 cells. CONCLUSION The construction of eucar yotic expression ve ctor of bioactive fragment of human bactericidal/permeability-increasing protei n and its expression in COS-7 cells were both successful, which is helpful to f urther study on the role of BPI.
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Keywords:bactericidal/permeability increasing protein (BPI ); reverse transcription polymerase chain reaction; sequence analysis;gene r ecombination；eucaryotic expression
0 引言
1978年Weiss等[1]从健康和慢性粒细胞白血病患者的多型核白细胞(polymorphon uclear neutrophils, PMN)中提取得到一种表观分子量为55 U，等电点为pH 9.8的蛋白质 ，因其对数株大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁 的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素D得以穿过细胞壁而进入菌体，因而 称之为杀菌通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI). B PI是456 个氨基酸组成的阳离子蛋白，对革兰氏阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功 能，尤为 值得注意的是BPI N端活性片段与BPI具有相似的生物学功能，二者均和革兰氏阴性菌脂多糖 (l ipopolysaccharide，LPS)具有较高的亲和力，同后者结合所形成的BPI-LPS复合物能抑制L PS的炎性级联信号向CD14的传导，从而阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应[2] . 此外， 越来越多的研究表明，BPI在抗真菌感染[3]、抗弓形虫感染[4]等方面也 具有重要的意义， 并且在儿科重症脑膜炎血症、部分肝切除、出血性创伤、重症腹膜感染以及囊性纤维化等多 种疾病的治疗方面显示出良好的应用前景[5]. 为了获取大量的BPI重组蛋白，以深入研究BPI的生物学功能，探讨其杀菌和中和内毒素作用 机制，本文从人外周血中提取PMN 总RNA，经RT-PCR获得BPI cDNA，构建了BPI真核表达载 体，并对其在COS-7细胞中的表达产物进行了鉴定.
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及细胞系 E.col i JM109，pUC19为本室保存，pcDNA3含CMV 早期启动子 和新霉素(Neomycin)抗性基因；COS-7细胞系由本校病理学教研室邢金良硕士惠赠 ，其培养基为DMEM完全培养基，含100 mL.L-1小牛血清.
1.1.2 酶及其他试剂 PWO DNA polymerase，T4 DNA ligase购自Boehringer公 司；Reverse Transcription System，BamHⅠ，XbaⅠ，XgaⅠ，IPTG和Wizard ○ R Plus Mini preps DNA Purification System,均购自Promega公司；核酸的凝胶纯化试剂盒NucleoTrap○ R Nucleic Acid Purification Kits and Accessories,购自Clontech公司 ；Pol ymorphprepTM PMN分离液,购自Nycomed Pharmas 公司；RNA提取试剂Trizol Reagent ，脂质体转染试剂Lipofecta mine Reagent，DMEM购自Gibco公司；BPI单克隆抗体为HBT公司产品；荧光抗体羊抗鼠IgG- FITC购自华美公司；小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.
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1.2 方法
1.2.1 质粒提取、酶切、连接及转化 主要方法均参照文献[6]进行.
1.2.2 PCR引物的设计与合成 运用计算机软件辅助分析，根据BPI 主要的活性 片段N端序列 ，设计两套引物采用套式PCR扩增目的基因，其中外引物P1，P2扩增BPI cDNA第7-840 bp， 内引物P3，P4扩增BPI cDNA第25-749 bp，并在引物P3，P4分别引入酶切位点BamHⅠ和 XbaⅠ，引物由上海生工生物工程公司合成. 引物设计见Fig 1.
图 1 BPI N端序列及引物的设计
Fig 1 Sequence of cDNA encoding N-terminal fragment of BPI and prime rs
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□labelled sequence: Primers; underlined sequence: Signal pept ide
1.2.3 PMN提取 收集PMN >80%的临床检验用EDTA抗凝血15 mL，取50 m L离心管加入等量PolymorphprepTM分离液，小心地将全部抗凝血加至分离液层面上 ，室温 下400～450 g离心40 min，轻轻吸出PMN并稀释于等体积的4.5 g.L-1 NaCl溶液 ，PMN细胞悬液再用生理盐水洗涤3次，每次400 g，10 min，记数PMN细胞数.
1.2.4 细胞总RNA的提取 参照Trizol Reagent Kit中的说明书进行;于1.5 mL离心管中加入(5～10)×106 PMN，取1 mL Trizol试剂加于管中反复吹打，待核蛋 白 完全溶解；室温下静置5 min，加0.2 mL三氯甲烷，用力振荡15 s，室温下静置2～3 min，4 ℃，11 000 g离心15 min；吸出上清，加0.5 mL异丙醇，室温下静置10 min，4℃ ，11 000 g离心10 min；弃上清，加1 mL 750 mL.L-1乙醇，4℃，7000 g 离心10 min；弃上清，室 温干燥5～10 min，加20 μL无RNase水溶解，并置55℃水浴10 min，取2 μL用于反转录.
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1.2.5 cDNA第一链合成 在20 μL反应体积中, 含有10 μg RNA, 10×Buffer 2 μL, 10 mmol.L-1 dNTP混合液2 μL, 逆转录酶15 U, 引物P2 1 μL, 于42℃水 浴反应1 h，99℃ 5 min灭活逆转录酶后置-20℃备用.
1.2.6 PCR扩增BPI cDNA片段 首先以反转录产物为模板进行第一轮PCR扩增, 所用引物为P1及P2, 反应体积为50 μL, 反应条件为: 94℃, 2 min; 94℃, 30 s, 55 ℃, 4 5 s, 72℃, 50 s，10×; 94℃, 30 s, 55℃, 45 s, 72℃, 60 s，10×；94℃, 30 s, 55 ℃, 45 s, 72℃, 70 s，10×；94℃, 30 s, 55℃, 45 s, 72℃, 80 s，5×；72℃, 7 min ; 共进行35个循环. 之后以第 一轮PCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增, 所用引物为P3及P4，反应体积为50 μL, 反应 条 件为: 94℃, 2 min；94℃，30 s，60℃，45 s，72℃，60 s，5×；94℃，30 s，65℃，45 s， 72℃, 60 s，10×；94℃；30 s，65℃，45 s，72℃，70 s，10×；94℃，30 s，65℃, 45 s，72℃, 80 s，10×；72℃, 7 min; 共进行35个循环.
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1.2.7 BPI基因克隆 将第2轮PCR产物及pUC19载体分别经BamHⅠ，Xba Ⅰ双酶切，按DNA与载 体3∶1比例于14℃连接过夜. 取上述连接产物2 μL转化感受态细胞JM109, 将转化后的JM10 9涂布于含100 mg.L-1氨苄青霉素及X-gal，IPTG的LB平板上, 37℃培养. 16 h后挑 取白色菌落 ，提取质粒, 经BamHⅠ，XbaⅠ双酶切鉴定.
1.2.8 DNA序列测定、核苷酸序列分析比较 DNA序列测定采用PE公司310型自动 DNA测序仪完成；核苷酸序列分析比较利用网络Entrez Databases及Goldkey软件完成.
1.2.9 真核表达载体的构建 将测序正确的重组pUC19-BPI提取质粒, 双酶切回收BPI片段, 与预先经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切的pcDNA3载体进行连接反应. 以连接反应液转化感 受态JM109, 挑选10个氨苄青霉素抗性的菌落, 小量法提取质粒, 进行酶切鉴定.
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1.2.10 Lipofectamine法转染COS-7细胞 于6孔培养板中加入对数生 长期的COS-7细胞3×105/孔，每孔2 mL DMEM完全培养基，使75%长满. 实验前, 预先配 制Lipofectamine/DNA混合溶液，A液(100 μL无血清DMEM培养基+质粒DNA 2 μg)，B液 (100 μL无血清DMEM培养基+10 μL Lipofectamine)，将A，B两液混合，置室温下孵育30 min，使其形成DNA-Liposome复合物，再加入800 μL不含血清的DMEM配成Lipofectamine/ DNA混合溶液. 轻轻混匀上述混合溶液并滴加到漂洗过的细胞中，37℃，50 mL.L-1 CO2培养6 h，6 h后加入1 mL 含200 mL.L-1 小牛血清的 DMEM培养基，转染20 h后吸弃培养液换为DMEM完全培养基，72 h后收集细胞进 行检测.
, 百拇医药 1.2.11 活细胞免疫荧光法鉴定BPI的表达 转染72 h后，胰蛋白酶消化并收集C OS-7细胞， 用DMEM完全培养基调整细胞为5×106～1×107.mL-1；取40 μL细胞悬液加入预 先有BPI M cAb 10 μL的5 mL离心管，再加50 μL 1∶20稀释的灭活正常兔血清，4℃孵育30 min，洗 涤液洗涤2次 ，2 mL/次，1000 r.min-1离心5 min；弃上清，加50 μL工作浓度的羊抗鼠Ig-FI TC荧光二抗，充 分振荡，4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次，2 mL/次，1000 r.min-1离心5 min；加 固定液100 μL，制片后荧光显微镜下观察.
2 结果
2.1 RNA的完整性及纯度 从人PMN中提取的总RNA经电泳，可见明显的28 ，18和5 s条带，且28 s的亮度大约是18 s的2倍，说明所提取的总RNA基本没有降解， 有较 好的完整性. 对RNA样品进行紫外分光光度分析得出D(260)/D(280)>1.8，表明RNA具有较高 的纯度，符合反转录 要求.
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图 2 BPI基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of BPI gene
1: DNA PCR maker; 2: PCR products of BPI gene; 3: Negative c ontrol
2.2 BPI活性片段基因的扩增 反转录产物经套式PCR扩增，琼脂糖凝胶 电泳可见一条约700 bp的扩增区带(Fig 2), 与预期的结果一致.
2.3 PCR扩增产物的克隆 选择3个重组克隆提取质粒，经双酶切鉴定， 均可切出726 bp的片段(Fig 3), 表明cDNA已克隆于载体中, 命名为pUC-BPI.
2.4 BPI基因片段的序列测定及分析 直接以pUC -BP I为模板进行测序, 得到克隆片段的DNA序列, 经计算机分析, 与已知的包括31aa信号肽序列 在内的人BPI cDNA序列相符，测序结果图略.
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2.5 pcDNA-BPI真核表达载体的构建 测序正确的目的片段基因连接入pcDNA3载体的BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点之间. 经筛 选后用双酶切鉴定, 3个重组子均可切出726 bp的片段(Fig 4 )，命名为pcDNA-BPI. 构建策略如Fig 5所示.
图 3 重组质粒pUC19-BPI的酶切鉴定
Fig 3 Identification of recombinant pUC19-BPI plasmid with BamHⅠ and XbaⅠ
1: DNA PCR maker; 2,3,4: Positive clonies; 5:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ
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图 4 重组质粒pcDNA-BPI的酶切鉴定
Fig 4 Identification of recombinant pcDNA-BPI plasmid with BamHⅠ and XbaⅠ
1: DNA PCR maker; 2,3: pcDNA plasmid; 4,5,6: Positive clonies; 7:λDNA/HindⅢ
2.6 BPI在COS-7细胞中的表达 活细 胞免疫荧光染色观察发现，pcDNA3转染的细胞内未见 明显荧光，而经pcDNA-BPI重组质粒转染的COS-7细胞胞质中可见明显荧光，表明pcDNA-B PI片段在COS-7细胞中得到了表达(Fig 6).
3 讨论
PMN为专性吞噬细胞，在宿主防御微生物的侵入中起着重要作用，这类细胞可通过氧依赖和 非氧依赖的机制杀灭来犯细菌，而非氧依赖的杀伤机制则涉及吞噬过程中溶酶体相关的细胞 毒性蛋白和肽释放于吞饮泡. 体内外实验表明，在PMN细胞内诸多抗菌成分中，BPI是 唯一能够直接对革兰氏阴性菌发挥杀菌作用和中和内毒素作用的抗菌物质[7].
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图 5 真核表达载体pcDNA-BPI的构建
Fig 5 Schematic diagram for construction of eucaryotic expression vector
图 6 转染COS-7细胞中BPI的表达
Fig 6 BPI fragment expression in transfected COS-7 cells
Fluorescence could been seen in the transfected COS-7 cells, whereas untransfected cells could not been observed in the cytoplasm
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为得到BPI基因，以深入研究其结构与功能的关系，Gray等[7]利用寡核苷酸探 针从人肝cDNA 文库中筛选出编码BPI全长的 cDNA克隆，并得到表达. 免疫荧光和放射免疫测定发现BPI为P MN特有的产物，由处于分化阶段的早幼粒细胞合成，贮存于成熟PMN嗜天青颗粒中[8] . 因此我们直接选择PMN细胞为原材料获取BPI cDNA.
用RT-PCR克隆获取目的基因片段是目前最常用的克隆方法，分为一步法和二步法，本实验 采 用二步法进行. 引物包括内外两套，二者扩增片段均包括31aa信号肽序列在内的人BPI cDNA 生物活性N端编码序列，外引物扩增后再用带有酶切位点的内引物进行扩增，保证反应具有 较高的特异性. 实验中首先以oligo(dT)为引物，反转录合成之cDNA第一链为模板进行PCR扩 增，所得产物少且有非特异产物存在，结果不甚理想. 后改用BPI引物P2合成cDNA第一链， 再采用套式PCR进行扩增，适当提高退火温度并延长延伸时间，结果获得726 bp的单一片段.
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pcDNA3为一种真核表达载体，其5′端含CMV早期启动子，复制启始位置带有SV40启动子 ，3′端有polyA尾，能将克隆至其中的目的片段高效表达[9]. COS-7是来源于非 洲绿猴肾成 纤维细胞并经SV40病毒基因转化的细胞系，能组成型地表达SV40 T抗原，使得任何复制启始 位置带有SV40的转染质粒能够以很高的拷贝数进行复制，作为一种真核瞬时表达系统，COS -7是研究蛋白质结构与功能的有利工具，多种载体可用在COS-7细胞中表达外源基因 [6]. 阳 离子脂质体能与DNA形成复合物，该复合物与细胞膜融合，通过细胞内吞作用，使外源DNA转 入 真核细胞内，其优点是转染效率高，低毒性，特异性强，无免疫原性，且方法简单，容易操 作，是转染细胞的重要载体. 因此，选择pcDNA3为真核表达载体，脂质体为转染剂，COS-7 为表达细胞有利于发挥三者的整体优势.
酶切鉴定和序列分析表明，本研究克隆的BPI片段序列正确，重组载体pcDNA-BPI经双酶切 鉴定，切 出了726 bp的DNA片段，说明BPI真核表达载体构建成功；COS-7细胞表达产物能够被抗BPI 单 抗所识别，免疫荧光染色发出荧光，表明所表达的BPI片段具有生物学活性，为下一步BPI功 能的研究奠定了基础.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
作者简介：刘家云(1971-),男(汉族)，云南省宜良人. 硕士生(导师 于文彬教授). Tel.(029)3375572 Email. jiayun98@163.net
苏明权(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)；
陈云春(第四军医大学西京医院临床分子生物学研究中心，陕西 西安 710033)
参考文献：
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[2] Tobias PS, Soldau K, Iovine NM et al. Lipopolysaccharide (LPS) -bin ding proteins BPI and LBP form different types of complexes with LPS[J]. J Biol Chem, 1997; 272(30): 18682-18685.
[3] De Lucca AJ,Walsh TJ. Antifungal peptides:Novel therapeutic compou nds against emerging pathogens[J]. Antimicrob Agents Chemother,1999;43(1): 1-11.
[4] Arnold H, Horwitz, Paul Motchnik et al. Fungicidal pept ides from bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) act synergysticall y with fluconazole on a variety of candida strains[M]. Toronto,ICAAC, 1997:928 -1001
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[8] Weiss J, Olsson I. Cellular and subcellular localization of the ba cterici dal/permeability-increasing protein of neutrophils[J]. Blood, 1987; 69(2) : 652-659.
[9] Boshart M, Weber F, Jahn G et al. A very strong enhancer is lo cated upst ream of immediate early gene of human cytomegalovirus[J]. Cell,1985;41(2): 521-530.
收稿日期:1999-11-18; 修回日期:2000-01-25, http://www.100md.com