人心肌MyBPC cDNA的克隆及表达载体的构建和鉴定
作者：李志立 贾国良 杜日映
单位：李志立(第四军医大学唐都医院心血管内 科，陕西 西安710038)；杜日映(第四军医大学唐都医院心血管内 科，陕西 西安710038)；贾国良(第四军医大学西京医院心血管内科)
关键词：肌凝蛋白结合C；基因；DNA探针；序列分析
第四军医大学学报000418 摘 要:目的 为探讨突变MyBPC基因致肥厚型心肌病致病机制,首先需要分离所需 研究基因、 构建表达载体. 方法 用32PdCTP标记的MyBPC cDNA片段为探针,自人心 肌cDNA文库筛选克隆 正常MyBPC cDNA; 重叠PCR法制备5种不同突变MyBPC cDNA片段,酶切后分别重组入PMW172和C MV载体并进行序列分析. 结果 获得含有全表达序列(33-3858)的Pbluescript 质粒；酶切鉴 定载体构建成功；序列测定证实目标突变存在. 结论 为表达MyBPC蛋白,比较 与肌凝蛋白的结合功能奠定了基础.
, 百拇医药
中图号:Q75 文献标识吗:A
文章编号：1000-2790(2000)04-0449-03
Cloning of wild-type and mutant myosin-binding protein C gene in human heart m uscle and constructing of the expressed vectors
LI Zhi-Li DU Ri-Ying
(Department of Cardiovasology, Tangdu Hospital,Xi'an 710038,China)
JIA Guo-Liang
(Department of Cardiovasology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University)
, 百拇医药
Abstract: AIM To investigate the mechanism of mutations in myosin-binding pr otein C (MyBPC) gene causing hypertrophic cardiomyopathy, the desired genes were separated and the expressed vectors were constructed. METHODS The wild-type MyBPC cDNA clone was obtained from the human heart muscle library screened by 32PdCTP radiolabeled oligo probes. Five different mutant cDNA fragments were made by the overlapping PCR method and were subcloned into PMW172 and CMV vectors by cuting them with adequate restriction enzymes respectively. RESULTS The full-length expressed sequences (33-3858) were obtained and th e expressed ve ct ors were successfully constructed. The target mutations were identified by sequencing. CONCLUSION This study provides a basis for the purificatio n of MyBPC proteins and the comparison of their myosin-binding abilities.
, http://www.100md.com
Keywords:myosin-binding protein C；genes；nucleic acid probes；sequence analysis
0 引言
家族性肥厚型心肌病(FHCM)系常染色体显性遗传性疾病. 近年经过对FHCM家系进行连 锁 遗传分析研究,发现肌凝蛋白结合C(MyBPC)基因突变[1,2]可导致该病.为比较正常 及突变MyB PC与肌凝蛋白的结合功能, 研究致病机制,作者首先自人心脏cDNA文库中克隆出正常MyBPC c DNA, 制备5种不同突变MyBPC cDNA, 并构建了表达载体.
1 材料和方法
1.1 人心肌MyBPC cDNA克隆
1.1.1 主要材料 人心肌cDNA文库：包装载体Lamda ZAP II, 制备文库心脏 组织取自死于 意外事故的22岁男性左室游离壁,死者生前健康. 克隆位点为EcoRI, 插入cDNA平均约1. 0 kb. 购自Stratagene公司.
, http://www.100md.com
1.1.2 DNA探针制备 以cDNA文库为模板, 841F,985R为引物, 用α-32PdCTP,随机引物法[3]标记探针, 标记的PCR产物经Sephadex G-50 纯化后作DNA探针.
1.1.3 人心肌正常MyBPC cDNA克隆 按文献[4]进行,以XL1-blue为铺平板细 菌,第一轮筛选 按每LB琼脂板(82 mm)≤104的高密度铺板,将DNA原位转移至尼龙膜上,分别与上述探针进 行杂 交. 将阳性克隆，再做低密度铺平板(每平皿≤102噬菌体)进行第二轮筛选. 将阳性克隆 置 于噬菌体缓冲液中4℃保存. 筛选中，预杂交、杂交、杂交后洗膜及在X线光片上放射性自 显影均按常法进行.
1.1.4 全表达序列MyBPC克隆 在获得的阳性克隆中，以不同引物，PCR法验证插入D NA片段的 长度和方向. 选择两个正义(T7→T3)链 DNA片段，进行质粒Pbluescript转化、培养 提取和酶切连接.
, 百拇医药
1.1.5 PMW172和CMV载体的构建和鉴定 PMW172载体:2.58 kb. CMV载体: 5.5 kb. 均 为Stratagene公司产品. 使用NdeI-EcoRI 和NotI-XbaI分别使MyBPC 重 组入PMW172和CMV载体. 转 染DH1Oβ 细胞、提取质粒DNA.
1.2 突变MyBPC表达载体的构建和鉴定
1.2.1 突变MyBPC片段制备 设计含有突变且部分重叠的成对引物，重叠PCR法[ 5]制备含有目标 突变[1,2]的DNA片段,选择相应限制性内切酶(Tab 1)酶切后,将目标突变的片段分 别重组入Pbluescript质粒中正常MyBPC的相应位置. 继之将突变MyBPC重组入CMV,PMW172载 体, 同前转染、培养提取.
表 1 5种不同突变含义及限制性内切酶的位置
, http://www.100md.com
Tab 1 Five different mutations and the restriction enzymes in MyBPC Name
Mutation
The restriction enzymes used
Terminato r
M1
2405 Inserted G(2405InG)
PpuMI(2056～2827)
2525(TGA)
M2
2896 Deleted CT(2896ΔCT)
, http://www.100md.com
StuI-Bsu36I(2729～3039)
317 9(TGA)
M3
3774～3791 Repeated(3774D18)
HindIII-EcoRI(3575～4184) [ ] 3855(TGA)
M4
1383G→C(1383C)
SphI-BclI(1071～1567)
3855(TGA )
M5
, http://www.100md.com
3223～3362 Deleted(3223S140)
Bsu36I-HindIII(3039～35 75)
3473(TAG)
1.2.2 鉴定 双脱氧链终止法[6]测定突变及PMW172载体的序列 ,使用NotI-XbaI 酶切鉴定构建的CMV载体.
2 结果
2.1 人心肌MyBPC cDNA克隆
2.1.1 MyBPC阳性克隆(T7→T3)的长度及起止位置 在获得的8个阳性克隆中, 经使用 T7→1185R和3301F→T3两对引物, PCR法验证有5个为正义链(T7→T3)阳性克隆(T ab 2).
, 百拇医药
表 2 正义克隆长度及在MyBPC cDNA中的位置
Tab 2 Length of the forward colonies and their locations in MyBPC cDNA Name
Length
T7→985R
T7→1185R
3301F→T3
Location
in MyBPC
B
, http://www.100md.com 3500
180
950
875～4184
C
2100
540
515～2475
F
2400
90
965～3225
G
, 百拇医药
2800
1250
1～2660
H
2000
750
505～2365
2.1.2 全表达序列MyBPC克隆 选择SmaI(1513位)分别酶切B和G片段,连接 酶连接、转染繁殖并提纯后获得含有全表达序列的MyBPC Pbluescript质粒.
2.1.3 MyBPC cDNA序列鉴定 用T3为引物测得MyBPC cDNA正义链3′端位置4184位. 4123位为A(Fig 1).
, 百拇医药
2.1.4 酶切鉴定两种表达载体(Fig 2).
图 1 3′ 端MyBPC的序列测定
Fig 1 The sequences of MyBPC cDNA in 3′ terminal(the primer is T3)
A: 3′-GAATTCC(EcoRI).(GTGACTGCACTTA…5′
B: 3′-GGCCAGAAAGGTCTGTCCCC…5′
图 2 两种表达载体的酶切鉴定
, http://www.100md.com
Fig 2 Identification of the two expressed vectors in 20 g.L-1 agarose g el
CMV(NotI-XbaI): 5.5 kb,4.2 kb; PMW172(NdeI-EcoRI):4.2 kb ,2.6 kb;M: molecular mass DNA marker.
2.2 突变MyBPC 表达载体的构建和鉴定
2.2.1 目标突变的序列鉴定(Fig 3) 经测序证实各目标突变存在.
2.2.2 突变MyBPC表达载体鉴定(Fig 4) 经酶切鉴定CMV载体及各突变MyBPC D NA片段正确.
, 百拇医药
图 3 5种突变的序列鉴定
Fig 3 Identification of the five different mutations by sequencing
图 4 各突变CMV载体的酶切鉴定
Fig 4 CMV vectors contained mutant MyBPC cut with NotI and XbaI
M: molecular weight DNA marker; M0-M4: 5.5 kb,4.2 kb;M5: 5.5 kb,4.06 kb.
3 讨论
MyBPC cDNA全序列为4575 bp, 表达序列自33位启动子(ATG)开始, 3858位出现终止子(T GA )结束, 共35个外显子, 编码1273个氨基酸残基[7]. 本实验在克隆的8个DNA片段中 ,G片段和B片段在MyBPC 中位置分别为1～2660和875～4184. 因在MyBPC 1513位和T3侧各有 单一SmaI位点, 故将1513～4184 重组到含有1～1513位质粒中,获得有MyBPC cDNA(1～4184)的Pbluescript质 粒. CMV和PMW172两种表达载体经酶切鉴定构建成功(Fig 1). 需要指出的是, 序列分析正义 链4123位为A, 与文献报道的G不一致[7], 推测为多态性而非突变, 且4123位在MyB PC 非表达序列内.
, 百拇医药
MyBPC基因位于11p11.2, 经相关分析自FHCM家系中发现了不同的MyBPC突变. 为研究致 病 机制,本实验选择颠换(1383G→C)、插入(2405InG)、缺失(2896ΔCT)[1]、重复(33 74D18)和缺失140 bp(3223S140)[2]的突变作为目标突变, 重叠PCR法 制备带有目标突变的DNA片段, 酶切 后插入到正常MyBPC cDNA质粒中相应位置, 继之重组入CMV和PMW172两种载体, 经核苷酸序 列分析证实目标突变存在并未引起新的突变.
成功构建的PMW172载体为表达提纯蛋白,分析正常及突变MyBPC 与肌凝蛋白的结合功能 提供了基础; 同时, CMV载体可用于心肌表达实验,探讨突变MyBPC的致病机制.
作者简介：李志立(1965-)，男(汉族)，河北省赵县人. 博士. 发表论文12篇. Tel.(029) 3577278 Email. lizhili@fmmu.edu.cn
, 百拇医药
参考文献:
[1] Watkins H, Conner D, Thienfelder L et al. Mutations in the cardiac myosin-bin ding protein C gene on chromosome 11 cause familial hypertrophic cardiomyopathy [J]. Nat Genet, 1995; 11(12): 434-437.
[2] Niimura H, Bachinski LL, Watkins H et al. Mutations in genes for cardiac myo sin-binding protein C and late-onset familial hypertrophic cardiomyopathy[J] . N Engl J Med, 1998; 338(18): 1248-1257.
, http://www.100md.com
[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. Molecular cloning a laborator y 2nd ed[M]. New York, USA. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 10.6-10 .17
[4] Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J et al. Molecular cloning a labora tory manual[M]. New York, USA. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982: 312-328.
[5] Ho SN, Hunt HD, Horton RM et al. Site-directed mutagenesis b y overlap ex tension using the polymerase chain reaction[J]. Gene, 1989; 77(6):51-59.
, 百拇医药
[6] Sanger F and Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA b y primed synthesis with DNA polymerase[J]. J Mol Biol, 1975; 94(4):441-445 .
[7] Gautel M, Zuffardi O, Freiburg A et al. Phosphorylation switc hes specific for the cardiac of myosin-binding protein C:A modulator of cardiac contractio n? [J]. EMBO J, 1995; 14(9): 1952-1960.
收稿日期：1999-07-10； 修回日期：2000-01-25, 百拇医药
单位：李志立(第四军医大学唐都医院心血管内 科，陕西 西安710038)；杜日映(第四军医大学唐都医院心血管内 科，陕西 西安710038)；贾国良(第四军医大学西京医院心血管内科)
关键词：肌凝蛋白结合C；基因；DNA探针；序列分析
第四军医大学学报000418 摘 要:目的 为探讨突变MyBPC基因致肥厚型心肌病致病机制,首先需要分离所需 研究基因、 构建表达载体. 方法 用32PdCTP标记的MyBPC cDNA片段为探针,自人心 肌cDNA文库筛选克隆 正常MyBPC cDNA; 重叠PCR法制备5种不同突变MyBPC cDNA片段,酶切后分别重组入PMW172和C MV载体并进行序列分析. 结果 获得含有全表达序列(33-3858)的Pbluescript 质粒；酶切鉴 定载体构建成功；序列测定证实目标突变存在. 结论 为表达MyBPC蛋白,比较 与肌凝蛋白的结合功能奠定了基础.
, 百拇医药
中图号:Q75 文献标识吗:A
文章编号：1000-2790(2000)04-0449-03
Cloning of wild-type and mutant myosin-binding protein C gene in human heart m uscle and constructing of the expressed vectors
LI Zhi-Li DU Ri-Ying
(Department of Cardiovasology, Tangdu Hospital,Xi'an 710038,China)
JIA Guo-Liang
(Department of Cardiovasology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University)
, 百拇医药
Abstract: AIM To investigate the mechanism of mutations in myosin-binding pr otein C (MyBPC) gene causing hypertrophic cardiomyopathy, the desired genes were separated and the expressed vectors were constructed. METHODS The wild-type MyBPC cDNA clone was obtained from the human heart muscle library screened by 32PdCTP radiolabeled oligo probes. Five different mutant cDNA fragments were made by the overlapping PCR method and were subcloned into PMW172 and CMV vectors by cuting them with adequate restriction enzymes respectively. RESULTS The full-length expressed sequences (33-3858) were obtained and th e expressed ve ct ors were successfully constructed. The target mutations were identified by sequencing. CONCLUSION This study provides a basis for the purificatio n of MyBPC proteins and the comparison of their myosin-binding abilities.
, http://www.100md.com
Keywords:myosin-binding protein C；genes；nucleic acid probes；sequence analysis
0 引言
家族性肥厚型心肌病(FHCM)系常染色体显性遗传性疾病. 近年经过对FHCM家系进行连 锁 遗传分析研究,发现肌凝蛋白结合C(MyBPC)基因突变[1,2]可导致该病.为比较正常 及突变MyB PC与肌凝蛋白的结合功能, 研究致病机制,作者首先自人心脏cDNA文库中克隆出正常MyBPC c DNA, 制备5种不同突变MyBPC cDNA, 并构建了表达载体.
1 材料和方法
1.1 人心肌MyBPC cDNA克隆
1.1.1 主要材料 人心肌cDNA文库：包装载体Lamda ZAP II, 制备文库心脏 组织取自死于 意外事故的22岁男性左室游离壁,死者生前健康. 克隆位点为EcoRI, 插入cDNA平均约1. 0 kb. 购自Stratagene公司.
, http://www.100md.com
1.1.2 DNA探针制备 以cDNA文库为模板, 841F,985R为引物, 用α-32PdCTP,随机引物法[3]标记探针, 标记的PCR产物经Sephadex G-50 纯化后作DNA探针.
1.1.3 人心肌正常MyBPC cDNA克隆 按文献[4]进行,以XL1-blue为铺平板细 菌,第一轮筛选 按每LB琼脂板(82 mm)≤104的高密度铺板,将DNA原位转移至尼龙膜上,分别与上述探针进 行杂 交. 将阳性克隆，再做低密度铺平板(每平皿≤102噬菌体)进行第二轮筛选. 将阳性克隆 置 于噬菌体缓冲液中4℃保存. 筛选中，预杂交、杂交、杂交后洗膜及在X线光片上放射性自 显影均按常法进行.
1.1.4 全表达序列MyBPC克隆 在获得的阳性克隆中，以不同引物，PCR法验证插入D NA片段的 长度和方向. 选择两个正义(T7→T3)链 DNA片段，进行质粒Pbluescript转化、培养 提取和酶切连接.
, 百拇医药
1.1.5 PMW172和CMV载体的构建和鉴定 PMW172载体:2.58 kb. CMV载体: 5.5 kb. 均 为Stratagene公司产品. 使用NdeI-EcoRI 和NotI-XbaI分别使MyBPC 重 组入PMW172和CMV载体. 转 染DH1Oβ 细胞、提取质粒DNA.
1.2 突变MyBPC表达载体的构建和鉴定
1.2.1 突变MyBPC片段制备 设计含有突变且部分重叠的成对引物，重叠PCR法[ 5]制备含有目标 突变[1,2]的DNA片段,选择相应限制性内切酶(Tab 1)酶切后,将目标突变的片段分 别重组入Pbluescript质粒中正常MyBPC的相应位置. 继之将突变MyBPC重组入CMV,PMW172载 体, 同前转染、培养提取.
表 1 5种不同突变含义及限制性内切酶的位置
, http://www.100md.com
Tab 1 Five different mutations and the restriction enzymes in MyBPC Name
Mutation
The restriction enzymes used
Terminato r
M1
2405 Inserted G(2405InG)
PpuMI(2056～2827)
2525(TGA)
M2
2896 Deleted CT(2896ΔCT)
, http://www.100md.com
StuI-Bsu36I(2729～3039)
317 9(TGA)
M3
3774～3791 Repeated(3774D18)
HindIII-EcoRI(3575～4184) [ ] 3855(TGA)
M4
1383G→C(1383C)
SphI-BclI(1071～1567)
3855(TGA )
M5
, http://www.100md.com
3223～3362 Deleted(3223S140)
Bsu36I-HindIII(3039～35 75)
3473(TAG)
1.2.2 鉴定 双脱氧链终止法[6]测定突变及PMW172载体的序列 ,使用NotI-XbaI 酶切鉴定构建的CMV载体.
2 结果
2.1 人心肌MyBPC cDNA克隆
2.1.1 MyBPC阳性克隆(T7→T3)的长度及起止位置 在获得的8个阳性克隆中, 经使用 T7→1185R和3301F→T3两对引物, PCR法验证有5个为正义链(T7→T3)阳性克隆(T ab 2).
, 百拇医药
表 2 正义克隆长度及在MyBPC cDNA中的位置
Tab 2 Length of the forward colonies and their locations in MyBPC cDNA Name
Length
T7→985R
T7→1185R
3301F→T3
Location
in MyBPC
B
, http://www.100md.com 3500
180
950
875～4184
C
2100
540
515～2475
F
2400
90
965～3225
G
, 百拇医药
2800
1250
1～2660
H
2000
750
505～2365
2.1.2 全表达序列MyBPC克隆 选择SmaI(1513位)分别酶切B和G片段,连接 酶连接、转染繁殖并提纯后获得含有全表达序列的MyBPC Pbluescript质粒.
2.1.3 MyBPC cDNA序列鉴定 用T3为引物测得MyBPC cDNA正义链3′端位置4184位. 4123位为A(Fig 1).
, 百拇医药
2.1.4 酶切鉴定两种表达载体(Fig 2).
图 1 3′ 端MyBPC的序列测定
Fig 1 The sequences of MyBPC cDNA in 3′ terminal(the primer is T3)
A: 3′-GAATTCC(EcoRI).(GTGACTGCACTTA…5′
B: 3′-GGCCAGAAAGGTCTGTCCCC…5′
图 2 两种表达载体的酶切鉴定
, http://www.100md.com
Fig 2 Identification of the two expressed vectors in 20 g.L-1 agarose g el
CMV(NotI-XbaI): 5.5 kb,4.2 kb; PMW172(NdeI-EcoRI):4.2 kb ,2.6 kb;M: molecular mass DNA marker.
2.2 突变MyBPC 表达载体的构建和鉴定
2.2.1 目标突变的序列鉴定(Fig 3) 经测序证实各目标突变存在.
2.2.2 突变MyBPC表达载体鉴定(Fig 4) 经酶切鉴定CMV载体及各突变MyBPC D NA片段正确.
, 百拇医药
图 3 5种突变的序列鉴定
Fig 3 Identification of the five different mutations by sequencing
图 4 各突变CMV载体的酶切鉴定
Fig 4 CMV vectors contained mutant MyBPC cut with NotI and XbaI
M: molecular weight DNA marker; M0-M4: 5.5 kb,4.2 kb;M5: 5.5 kb,4.06 kb.
3 讨论
MyBPC cDNA全序列为4575 bp, 表达序列自33位启动子(ATG)开始, 3858位出现终止子(T GA )结束, 共35个外显子, 编码1273个氨基酸残基[7]. 本实验在克隆的8个DNA片段中 ,G片段和B片段在MyBPC 中位置分别为1～2660和875～4184. 因在MyBPC 1513位和T3侧各有 单一SmaI位点, 故将1513～4184 重组到含有1～1513位质粒中,获得有MyBPC cDNA(1～4184)的Pbluescript质 粒. CMV和PMW172两种表达载体经酶切鉴定构建成功(Fig 1). 需要指出的是, 序列分析正义 链4123位为A, 与文献报道的G不一致[7], 推测为多态性而非突变, 且4123位在MyB PC 非表达序列内.
, 百拇医药
MyBPC基因位于11p11.2, 经相关分析自FHCM家系中发现了不同的MyBPC突变. 为研究致 病 机制,本实验选择颠换(1383G→C)、插入(2405InG)、缺失(2896ΔCT)[1]、重复(33 74D18)和缺失140 bp(3223S140)[2]的突变作为目标突变, 重叠PCR法 制备带有目标突变的DNA片段, 酶切 后插入到正常MyBPC cDNA质粒中相应位置, 继之重组入CMV和PMW172两种载体, 经核苷酸序 列分析证实目标突变存在并未引起新的突变.
成功构建的PMW172载体为表达提纯蛋白,分析正常及突变MyBPC 与肌凝蛋白的结合功能 提供了基础; 同时, CMV载体可用于心肌表达实验,探讨突变MyBPC的致病机制.
作者简介：李志立(1965-)，男(汉族)，河北省赵县人. 博士. 发表论文12篇. Tel.(029) 3577278 Email. lizhili@fmmu.edu.cn
, 百拇医药
参考文献:
[1] Watkins H, Conner D, Thienfelder L et al. Mutations in the cardiac myosin-bin ding protein C gene on chromosome 11 cause familial hypertrophic cardiomyopathy [J]. Nat Genet, 1995; 11(12): 434-437.
[2] Niimura H, Bachinski LL, Watkins H et al. Mutations in genes for cardiac myo sin-binding protein C and late-onset familial hypertrophic cardiomyopathy[J] . N Engl J Med, 1998; 338(18): 1248-1257.
, http://www.100md.com
[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. Molecular cloning a laborator y 2nd ed[M]. New York, USA. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 10.6-10 .17
[4] Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J et al. Molecular cloning a labora tory manual[M]. New York, USA. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982: 312-328.
[5] Ho SN, Hunt HD, Horton RM et al. Site-directed mutagenesis b y overlap ex tension using the polymerase chain reaction[J]. Gene, 1989; 77(6):51-59.
, 百拇医药
[6] Sanger F and Coulson AR. A rapid method for determining sequences in DNA b y primed synthesis with DNA polymerase[J]. J Mol Biol, 1975; 94(4):441-445 .
[7] Gautel M, Zuffardi O, Freiburg A et al. Phosphorylation switc hes specific for the cardiac of myosin-binding protein C:A modulator of cardiac contractio n? [J]. EMBO J, 1995; 14(9): 1952-1960.
收稿日期：1999-07-10； 修回日期：2000-01-25, 百拇医药