IL-1受体I型在大鼠颈上节神经元中的表达
作者：王曦 王百忍 段小莉 鞠躬
单位：王曦(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)；王百忍(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)；段小莉(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)；鞠躬(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)
关键词：颈上节；IL-1受体I型；免疫组织化学；大鼠
第四军医大学学报000542 摘 要: 目的 在蛋白水平研究IL-1受体I型在大鼠颈上节中的表达. 方法 免疫组织化学ABC方法. 结果 在正常大鼠颈上节中， 有大量IL-1受体I型免疫反应阳性细胞， 多为中、 小型神经节细胞， 也有一些小强荧光细胞(SIF)呈IL-1受体I型阳性. LPS免疫刺激后， 阳性细胞的数量和染色强度无明显变化. 结论 大鼠颈上节神经元存在IL-1受体， 表明周围植物性神经元能对促炎性细胞因子起反应. 本研究为免疫性细胞因子影响植物性神经元的信号活动提供了形态学基础.
, http://www.100md.com
中图号:R322.8 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0075-03
Expression of IL-1 receptor type I on neuronal cells of superior cervical ganglion of rats
WANG Xi, WANG Bai-Ren, DUAN Xiao-Li, JU Gong
(Department of Neuroimmunomodulation, Institute of Neuroscience, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To study the expression of IL-1 receptor at protein level on superior cervical ganglion of normal and LPS-stimulated rats. METHODS Immunohistochemistry (ABC method) was used. RESULTS There were plenty of IL-1 receptor type I immnoreactive cells in the superior cervical ganglion of the normal rats. Most of them were median or small in size. Some of the small intensely fluorescent (SIF) cells were positive as well. Three hours after an administra-tion of LPS (lipopolysaccharide) peritoneally, the number and staining intensity of positive structures were not obviously changed. CONCLUSION There exist IL-1 receptors in the superior cervical ganglion of the rats. This suggests that peripheral vegetative neuron can give response to proinflammatory cytokines through the receptor bearing on their cell membrane. The present results have offered a morphological basis for cytokines signaling sympathetic nervous system.
, 百拇医药
Keywords: superior cervical ganglion; IL-1 receptor type I; immunohistochemistry; rat
0 引言
颈上神经节是最大的交感神经节. 神经肽P物质(SP)是颈上节神经元中所含的神经活性物质之一. 近年来有报道，具有广泛免疫调节作用的促炎性细胞因子在颈上节可以诱导SP的合成. LPS(脂多糖，革兰阴性细菌胞壁成分)作为免疫刺激剂可以诱导神经系统中小胶质细胞及神经元产生白细胞介素-1(IL-1). 也有报道LPS通过IL-1诱导交感节后神经元合成SP，而重组IL-1受体拮抗剂可以抑制LPS诱导P物质的产生[1,2]，提示IL-1是通过其特异性受体而发挥作用的；Hart等[2]在培养的大鼠颈上节中测到了IL-1受体I型mRNA，提示颈上节中有IL-1受体存在. 但是在整体动物颈上节中有无IL-1受体的表达，以及表达的细胞和数量等尚未见报道. 因此，我们在正常和免疫刺激的大鼠用免疫组织化学方法对这个问题进行了研究.
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1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠8只，体质量200 g左右，随机分为2组. 实验组4只，ip LPS (500 μg.kg-1，Sigma公司，LPS质量浓度100 mg.L-1)，3 h后经心脏灌流，先用100 mL生理盐水快速灌流冲洗血液，然后用预冷的40 g.L-1多聚甲醛400 mL灌流. 灌注完毕，在手术显微镜下将双侧颈上节取出，放入200 g.L-1蔗糖溶液，4℃过夜. 组织沉底后，用冰冻切片机连续切片，贴于涂有明胶的载玻片上，片厚10 μm， -20℃保存待用. 对照组4只除ip同体积生理盐水代替LPS外，其余同实验组.
1.2 方法 切片室温晾干后浸入800 mL.L-1甲醇和3 mL.L-1双氧水(用蒸馏水配制)封闭30 min， 再用10 g.L-1牛血清白蛋白、30 mL.L-1羊血清和3 mL.L-1 Triton X-100封闭1 h. ABC方法如下：兔抗大鼠IL-1RI型抗体(1∶4000， Santa Cruz Tec.)孵育切片，室温下36 h， 0.01 mol.L-1 PBS冲洗10 min×3次；生物素化的羊抗兔IgG (1∶500，Sigma公司)孵育切片，室温下4 h，0.01 mol.L-1 PBS冲洗10 min×3次；生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC，1∶500，Sigma公司)孵育切片，室温2 h， 0.01 mol.L-1 PBS冲洗10 min×3次；硫酸镍胺加强DAB蓝色反应呈色. 当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应. 部分切片用中性红复染. 经脱水、透明和封片后，镜检.
, 百拇医药
部分切片用做免疫组化方法对照实验，一抗用牛血清白蛋白稀释液替代. 二抗、ABC复合物同其他免疫组化反应切片，结果未见阳性结构.
2 结果
在正常组大鼠的颈上节中，有大量的免疫反应阳性细胞出现. 结合复染的切片进行观察，有大约10%的节后神经元中有IL-1受体I型样免疫反应产物存在，阳性神经元多为直径15～20 μm的中、小型神经节细胞，散布于神经节各处. 也有一些形态大小似为小强荧光细胞者亦呈IL-1受体I型免疫反应阳性，这些细胞直径约10 μm左右，细胞圆形或多边形，成簇分布，胞质量少，被染成深蓝色(Fig 1， 2). 实验组动物接受LPS刺激后，颈上节中IL-1受体I型样免疫反应阳性神经元的数量和染色强度无明显变化.
图1 LPS刺激的大鼠颈上节中IL-1受体I型免疫反应阳性神经元
, 百拇医药
Fig 1 IL-1 receptor type I-like immunoreactive neurons in superior cervical ganglion of rat stimulated with LPS ×150
图2 图1长箭头所示部分的放大，箭头所指为免疫反应阳性的SIF细胞
Fig 2 The high magnification of a portion of Fig 1. Arrowhead indicates the positive SIF cells ×300
3 讨论
免疫性细胞因子IL-1具有广泛的免疫调节作用，可以促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化，促进B细胞的功能，增强NK细胞的杀伤活性，促进多种免疫分子的表达，刺激骨髓多能干细胞的增殖，刺激单核细胞和巨噬细胞产生白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)等[3]. IL-1还被称为促炎性细胞因子，有致热和介导炎症的作用[3]. 近年来研究发现，IL-1在中枢和外周神经组织中也有表达[4,5]，这些免疫细胞因子对神经递质表达的可塑性及调控、细胞凋亡起着很重要的作用. 神经细胞递质表达的可塑性是指其递质合成的种类和释放能力可受特定的外界因素诱导而产生变化. 在培养的颈上节，IL-1可以诱导P物质的产生，IL-1受体拮抗剂对IL-1诱导P物质的抑制作用呈剂量依赖性增加[1,2]，一方面可以证明IL-1对神经活性物质表达的可塑性及调控的作用，另一方面又提示IL-1的生物学功能是通过其特异性受体来实现的. 目前仅见文献中报道在培养的大鼠颈上节中检测到IL-1受体I型mRNA的表达[2,6]，而在蛋白水平用免疫组织化学方法对整体动物颈上节IL-1受体的存在和表达尚未被证明. 我们用IL-1受体I型特异性抗体以免疫组织化学方法在大鼠对这个问题进行了研究，证实了IL-1受体I型在交感神经节后神经元上的存在.
, 百拇医药
我们的结果显示，IL-1受体I型除表达在中、小型节后神经元，还表达在小强荧光细胞上. 小强荧光细胞是交感神经节内的中间神经元，介于节前神经元和节后神经元之间，并形成突触联系，是交感神经节中的旁神经节细胞，被认为是神经元之间神经递质分泌的调节者[7]. 有研究证明，小强荧光细胞的轴突末梢释放多巴胺，可使节后神经元产生抑制性突触后电位，提示对节前、节后神经元之间的突触传递具有抑制性的调节作用[8].
本研究揭示,IL-1受体在颈上节中的存在表明，周围植物性神经元(节后神经元)能对与免疫、损伤有关的促炎性细胞因子IL-1起反应，从而为免疫性细胞因子影响交感神经元的信号活动提供了形态学基础. 小强荧光细胞有可能作为中间神经元同时接受IL-1的刺激后，对节后神经元起着抑制性的调节作用，从而使反应达到平衡状态. 本研究发现，在对照组颈上节中IL-1受体阳性细胞的数量和实验组相比无明显差别，说明在正常未受免疫刺激的情况下，这些细胞已有IL-1受体表达. 我们认为，这有可能是体内神经系统监视免疫刺激或神经免疫网络中发挥作用的结构基础. 但本实验所使用的免疫刺激物为LPS，如果动物接受其他种类长时程免疫原刺激，也不排除颈上节内IL-1I型受体表达有上调的可能.
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830130)； 全军“九五”重点课题资助项目(96Z044)
作者简介：王 曦(1970-)， 女(汉族)， 山东省青岛市人. 主治医师， 硕士生(导师鞠 躬). Tel.(029)3374489 Email. wbrnim@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Shadiack AM, Carlson CD, Ding M et al. Lipopolysaccharide induces substance P in sympathetic ganglia via ganglionic interleukin-1 production [J]. J Neuroimmunol, 1994; 49(1-2): 51-58.
[2] Hart RP, Liu C, Shadiack AM et al. An mRNA homologous to interleukin-1 receptor type I is expressed in cultured rat sympathetic ganglia [J]. J Neuroimmunol, 1993; 44(1): 49-56.
, 百拇医药
[3] 金伯泉. 细胞和分子免疫学[M]. 西安: 世界图书出版公司, 1995: 102.
[4] Plata-Salaman CR. Immunoregulators in the nervous system [J]. Neurosci Biobehav Rev, 1991; 15(2):185-215.
[5] Rothwell NJ. Functions and mechanisms of interleukin 1 in the brain [J]. Trends Pharmacal Sci, 1991; 12(11):430-436.
[6] Bai Y, Hart RP. Cultured sympathetic neurons express functional interleukin-1 receptors [J]. J Neuroimmunol, 1998; 91(1-2):43-54.
, 百拇医药
[7] Heym C, Klimaschewski L, Borghini N et al. Immunohisto-chemistry of small intensely fluorescent (SIF) cells and of SIF cell-associated nerve fibers in the rat superior cervical ganglion [J]. Microsc Res Tech, 1994; 29(2): 143-150.
[8] Sakai M, Kani K, Yoshida M et al. Dopaminergic cells in the superior cervical ganglion of the rat: Light and electron microscopic study using an antibody against dopamine [J]. Neurosci Lett, 1989; 96(2):157-162.
收稿日期:1999-08-20; 修回日期:2000-03-14, 百拇医药
单位：王曦(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)；王百忍(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)；段小莉(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)；鞠躬(第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室，陕西 西安 710033)
关键词：颈上节；IL-1受体I型；免疫组织化学；大鼠
第四军医大学学报000542 摘 要: 目的 在蛋白水平研究IL-1受体I型在大鼠颈上节中的表达. 方法 免疫组织化学ABC方法. 结果 在正常大鼠颈上节中， 有大量IL-1受体I型免疫反应阳性细胞， 多为中、 小型神经节细胞， 也有一些小强荧光细胞(SIF)呈IL-1受体I型阳性. LPS免疫刺激后， 阳性细胞的数量和染色强度无明显变化. 结论 大鼠颈上节神经元存在IL-1受体， 表明周围植物性神经元能对促炎性细胞因子起反应. 本研究为免疫性细胞因子影响植物性神经元的信号活动提供了形态学基础.
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中图号:R322.8 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0075-03
Expression of IL-1 receptor type I on neuronal cells of superior cervical ganglion of rats
WANG Xi, WANG Bai-Ren, DUAN Xiao-Li, JU Gong
(Department of Neuroimmunomodulation, Institute of Neuroscience, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To study the expression of IL-1 receptor at protein level on superior cervical ganglion of normal and LPS-stimulated rats. METHODS Immunohistochemistry (ABC method) was used. RESULTS There were plenty of IL-1 receptor type I immnoreactive cells in the superior cervical ganglion of the normal rats. Most of them were median or small in size. Some of the small intensely fluorescent (SIF) cells were positive as well. Three hours after an administra-tion of LPS (lipopolysaccharide) peritoneally, the number and staining intensity of positive structures were not obviously changed. CONCLUSION There exist IL-1 receptors in the superior cervical ganglion of the rats. This suggests that peripheral vegetative neuron can give response to proinflammatory cytokines through the receptor bearing on their cell membrane. The present results have offered a morphological basis for cytokines signaling sympathetic nervous system.
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Keywords: superior cervical ganglion; IL-1 receptor type I; immunohistochemistry; rat
0 引言
颈上神经节是最大的交感神经节. 神经肽P物质(SP)是颈上节神经元中所含的神经活性物质之一. 近年来有报道，具有广泛免疫调节作用的促炎性细胞因子在颈上节可以诱导SP的合成. LPS(脂多糖，革兰阴性细菌胞壁成分)作为免疫刺激剂可以诱导神经系统中小胶质细胞及神经元产生白细胞介素-1(IL-1). 也有报道LPS通过IL-1诱导交感节后神经元合成SP，而重组IL-1受体拮抗剂可以抑制LPS诱导P物质的产生[1,2]，提示IL-1是通过其特异性受体而发挥作用的；Hart等[2]在培养的大鼠颈上节中测到了IL-1受体I型mRNA，提示颈上节中有IL-1受体存在. 但是在整体动物颈上节中有无IL-1受体的表达，以及表达的细胞和数量等尚未见报道. 因此，我们在正常和免疫刺激的大鼠用免疫组织化学方法对这个问题进行了研究.
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1 材料和方法
1.1 材料 成年雄性SD大鼠8只，体质量200 g左右，随机分为2组. 实验组4只，ip LPS (500 μg.kg-1，Sigma公司，LPS质量浓度100 mg.L-1)，3 h后经心脏灌流，先用100 mL生理盐水快速灌流冲洗血液，然后用预冷的40 g.L-1多聚甲醛400 mL灌流. 灌注完毕，在手术显微镜下将双侧颈上节取出，放入200 g.L-1蔗糖溶液，4℃过夜. 组织沉底后，用冰冻切片机连续切片，贴于涂有明胶的载玻片上，片厚10 μm， -20℃保存待用. 对照组4只除ip同体积生理盐水代替LPS外，其余同实验组.
1.2 方法 切片室温晾干后浸入800 mL.L-1甲醇和3 mL.L-1双氧水(用蒸馏水配制)封闭30 min， 再用10 g.L-1牛血清白蛋白、30 mL.L-1羊血清和3 mL.L-1 Triton X-100封闭1 h. ABC方法如下：兔抗大鼠IL-1RI型抗体(1∶4000， Santa Cruz Tec.)孵育切片，室温下36 h， 0.01 mol.L-1 PBS冲洗10 min×3次；生物素化的羊抗兔IgG (1∶500，Sigma公司)孵育切片，室温下4 h，0.01 mol.L-1 PBS冲洗10 min×3次；生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC，1∶500，Sigma公司)孵育切片，室温2 h， 0.01 mol.L-1 PBS冲洗10 min×3次；硫酸镍胺加强DAB蓝色反应呈色. 当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应. 部分切片用中性红复染. 经脱水、透明和封片后，镜检.
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部分切片用做免疫组化方法对照实验，一抗用牛血清白蛋白稀释液替代. 二抗、ABC复合物同其他免疫组化反应切片，结果未见阳性结构.
2 结果
在正常组大鼠的颈上节中，有大量的免疫反应阳性细胞出现. 结合复染的切片进行观察，有大约10%的节后神经元中有IL-1受体I型样免疫反应产物存在，阳性神经元多为直径15～20 μm的中、小型神经节细胞，散布于神经节各处. 也有一些形态大小似为小强荧光细胞者亦呈IL-1受体I型免疫反应阳性，这些细胞直径约10 μm左右，细胞圆形或多边形，成簇分布，胞质量少，被染成深蓝色(Fig 1， 2). 实验组动物接受LPS刺激后，颈上节中IL-1受体I型样免疫反应阳性神经元的数量和染色强度无明显变化.
图1 LPS刺激的大鼠颈上节中IL-1受体I型免疫反应阳性神经元
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Fig 1 IL-1 receptor type I-like immunoreactive neurons in superior cervical ganglion of rat stimulated with LPS ×150
图2 图1长箭头所示部分的放大，箭头所指为免疫反应阳性的SIF细胞
Fig 2 The high magnification of a portion of Fig 1. Arrowhead indicates the positive SIF cells ×300
3 讨论
免疫性细胞因子IL-1具有广泛的免疫调节作用，可以促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化，促进B细胞的功能，增强NK细胞的杀伤活性，促进多种免疫分子的表达，刺激骨髓多能干细胞的增殖，刺激单核细胞和巨噬细胞产生白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)等[3]. IL-1还被称为促炎性细胞因子，有致热和介导炎症的作用[3]. 近年来研究发现，IL-1在中枢和外周神经组织中也有表达[4,5]，这些免疫细胞因子对神经递质表达的可塑性及调控、细胞凋亡起着很重要的作用. 神经细胞递质表达的可塑性是指其递质合成的种类和释放能力可受特定的外界因素诱导而产生变化. 在培养的颈上节，IL-1可以诱导P物质的产生，IL-1受体拮抗剂对IL-1诱导P物质的抑制作用呈剂量依赖性增加[1,2]，一方面可以证明IL-1对神经活性物质表达的可塑性及调控的作用，另一方面又提示IL-1的生物学功能是通过其特异性受体来实现的. 目前仅见文献中报道在培养的大鼠颈上节中检测到IL-1受体I型mRNA的表达[2,6]，而在蛋白水平用免疫组织化学方法对整体动物颈上节IL-1受体的存在和表达尚未被证明. 我们用IL-1受体I型特异性抗体以免疫组织化学方法在大鼠对这个问题进行了研究，证实了IL-1受体I型在交感神经节后神经元上的存在.
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我们的结果显示，IL-1受体I型除表达在中、小型节后神经元，还表达在小强荧光细胞上. 小强荧光细胞是交感神经节内的中间神经元，介于节前神经元和节后神经元之间，并形成突触联系，是交感神经节中的旁神经节细胞，被认为是神经元之间神经递质分泌的调节者[7]. 有研究证明，小强荧光细胞的轴突末梢释放多巴胺，可使节后神经元产生抑制性突触后电位，提示对节前、节后神经元之间的突触传递具有抑制性的调节作用[8].
本研究揭示,IL-1受体在颈上节中的存在表明，周围植物性神经元(节后神经元)能对与免疫、损伤有关的促炎性细胞因子IL-1起反应，从而为免疫性细胞因子影响交感神经元的信号活动提供了形态学基础. 小强荧光细胞有可能作为中间神经元同时接受IL-1的刺激后，对节后神经元起着抑制性的调节作用，从而使反应达到平衡状态. 本研究发现，在对照组颈上节中IL-1受体阳性细胞的数量和实验组相比无明显差别，说明在正常未受免疫刺激的情况下，这些细胞已有IL-1受体表达. 我们认为，这有可能是体内神经系统监视免疫刺激或神经免疫网络中发挥作用的结构基础. 但本实验所使用的免疫刺激物为LPS，如果动物接受其他种类长时程免疫原刺激，也不排除颈上节内IL-1I型受体表达有上调的可能.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830130)； 全军“九五”重点课题资助项目(96Z044)
作者简介：王 曦(1970-)， 女(汉族)， 山东省青岛市人. 主治医师， 硕士生(导师鞠 躬). Tel.(029)3374489 Email. wbrnim@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Shadiack AM, Carlson CD, Ding M et al. Lipopolysaccharide induces substance P in sympathetic ganglia via ganglionic interleukin-1 production [J]. J Neuroimmunol, 1994; 49(1-2): 51-58.
[2] Hart RP, Liu C, Shadiack AM et al. An mRNA homologous to interleukin-1 receptor type I is expressed in cultured rat sympathetic ganglia [J]. J Neuroimmunol, 1993; 44(1): 49-56.
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[3] 金伯泉. 细胞和分子免疫学[M]. 西安: 世界图书出版公司, 1995: 102.
[4] Plata-Salaman CR. Immunoregulators in the nervous system [J]. Neurosci Biobehav Rev, 1991; 15(2):185-215.
[5] Rothwell NJ. Functions and mechanisms of interleukin 1 in the brain [J]. Trends Pharmacal Sci, 1991; 12(11):430-436.
[6] Bai Y, Hart RP. Cultured sympathetic neurons express functional interleukin-1 receptors [J]. J Neuroimmunol, 1998; 91(1-2):43-54.
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[7] Heym C, Klimaschewski L, Borghini N et al. Immunohisto-chemistry of small intensely fluorescent (SIF) cells and of SIF cell-associated nerve fibers in the rat superior cervical ganglion [J]. Microsc Res Tech, 1994; 29(2): 143-150.
[8] Sakai M, Kani K, Yoshida M et al. Dopaminergic cells in the superior cervical ganglion of the rat: Light and electron microscopic study using an antibody against dopamine [J]. Neurosci Lett, 1989; 96(2):157-162.
收稿日期:1999-08-20; 修回日期:2000-03-14, 百拇医药