体外循环中胃粘膜TNF-α mRNA的表达及细胞定位
作者：徐鹏 易定华 陈萍 王辉山 侯晓彬
单位：徐鹏(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；陈萍(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；王辉山(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；侯晓彬(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：体外循环；消化；肿瘤坏死因子-α；内毒素；基因表达；反转录PCR；兔
第四军医大学学报000537 摘 要： 目的 探讨体外循环(CPB)过程中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在家兔胃粘膜中的表达及细胞定位. 方法 采用家兔CPB模型，运用反转录PCR及ELISA的方法，结合血浆中TNF-α、内毒素浓度的变化，探讨了TNF-α mRNA的表达及细胞定位的规律. 结果 ①CPB过程中TNF-α mRNA在胃肠道的相对表达量较对照组明显增高. ②CPB过程中胃肠道组织中的TNF-α呈不同程度的增高，而且胃肠道组织中TNF-α浓度高于血浆中的浓度. ③CPB过程中血浆内毒素浓度较对照组明显增高(P<0.01)，其增高程度与胃肠道组织中TNF-α的释放及基因表达相一致. 结论 CPB中，组织及血浆中内毒素和TNF-α明显增高，胃窦部粘膜TNF-α mRNA的相对表达量增高可能是CPB手术后发生胃肠道并发症的重要原因.
, 百拇医药
中图号：Q654.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0636-03
Expression and localization of TNF-α mRNA in gastric mucosa of CPB rabbit
XU Peng, YI Ding-Hua, CHEN Ping, WANG Hui-Shan, HOU Xiao-Bin
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract： AIM To elucidate the kinetics of expression and release of the tumor necrosis factor-α in the gastric mucosal, mechanism of the production, and the role in complications of the open heart operations. METHODS Using CPB in rabbit, together with RT-PCR and ELISA etc, the expression of TNF-α mRNA, and the release of TNF-α in the gastroin-testine, the relationships with organ damage and with exdotoxin translocation in tissues were investigated systematically. RESULTS ①The expression of TNF-α mRNA in the gastrointestinal trunk could be successively increased during CPB. ② TNF-α level in gastrointestine was elevated but in different degrees during CPB. Levels and duration of TNF-α in tissues were greater than those in plasma. ③Endotoxin levels in plasma were markedly increased during CPB, which was parallel to the gene expression and release of TNF-α in the gastrointestinal trunk. CONCLUSION The release of TNF-α in tissue and plasma is related to endotoxin translocation in tissue during CPB. It might play an important role in complications of the open heart operations.
, http://www.100md.com
Keywords： cardiopulmonary bypass; gastrointestine; TNF-α; endotoxin; gene expression; RT-PCR; rabbit
0 引言
细胞因子在体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)中的损伤作用[1,2]虽已为人们所共识，但关于重要器官内细胞因子表达、释放、产生机制及其与器官功能损害关系等均尚不清楚. 消化道并发症是心脏手术后死亡率较高的并发症，为此我们以兔CPB为模型，较系统地探讨了CPB中胃肠道组织内肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)及内毒素(endotoxin)的释放、胃肠粘膜TNF-α mRNA表达等变化，并结合胃肠道粘膜功能损害内毒素移位等情况，试图探讨体外循环中TNF-α对胃肠道功能的影响，并为临床进一步防治心脏手术后胃肠道并发症提供实验依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 兔CPB模型的建立: 取幼兔24只(本校实验动物中心提供)，雌雄不拘，随机分为CPB组和对照组，每组12只. 实验兔术前禁食水6 h，戊巴比妥钠麻醉(35 mg.kg-1， ip)，切开气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，股动脉插管测压，胸骨正中切口开胸，3 mg.kg-1肝素化后，分别于右颈总动脉，右心房和左心房插入动脉泵管，腔静脉引流管和左心房引流管，连接小型CPB机. 采用CPB温度为28～32℃. 中度血液稀释(HCT：0.20～0.24),中流量为(70～110) mL.kg-1.min-1，平均动脉压维持在8～12 kPa. 总转流时间为180 min，其中主动脉阻断60 min，辅助循环时间120 min. 手术对照组动物单纯麻醉开胸180 min后留取组织标本.
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1.2 方法 分别在30，60，90，120及180 min经门静脉采血5 mL，缓慢加入抗凝的塑料管中，轻轻混匀，置入冰水浴中，4℃，3500 r.min-1 低温离心15 min. 分装血清，液氮中保存待测. 按上述时间点，活杀动物，取胃、空肠、回肠组织. 取胃，生理盐水冲洗胃内容物，钝刀刮取粘膜(部分固定，制作光镜及电镜标本)，置冻存管中液氮保存，检测组织TNF-α、内毒素水平及组织内mRNA表达. 血浆和组织中TNF-α的测定采用ELISA方法，血浆中内毒素含量的测定采用双抗体夹心法，组织标本称重后按1∶10加入无热原生理盐水，冰水浴中匀浆，匀浆液100℃水浴10 min后离心取上清，按基质偶氮鲎试剂显色测定法测定组织内毒素含量(北京304医院试剂盒). 异硫氰酸胍法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定组织内TNF-α mRNA纯度及含量，并进行RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳以鉴定其完整性. 参照Luster等[3]的方法合成TNF-α PCR引物. PCR反应体系为50 μL，20 mmol. L-1 Tris.HCl (pH 8.4)， 25 mmol.L-1 MgCl2， 200 μmol.L-1 dNTP, 100 nmol.L-1引物, 10.5 μL cDNA, 50 nmoL.s-1 Taq DNA聚合酶. 经94℃ 40 s, 54℃ 40 s, 72℃ 60 s, 35个循环后,72℃延伸10 min,扩增产物行电泳照相分析.
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2 结果
2.1 CPB兔血清及组织中TNF-α的变化 兔CPB中TNF-α的改变随CPB时间的改变，释放量增高，尤其是开放升主动脉阻断钳过程中，其释放量达到高峰，与对照组相比有显著差异(P<0.01, Fig 1, 2).
图1 体外循环中小肠组织内毒素的变化
Fig 1 Changes of endotoxin concentration in intestinal mucosa during CPB
aP<0.05 vs control group. CON： control group.
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图2 体外循环中血清内毒素的变化
Fig 2 Changes of serum endotoxin concentration during CPB
bP<0.01 vs control group. CON： control group.
2.2 CPB兔血清及组织中内毒素的变化 随CPB时间延长，血清及组织中内毒素释放较对照组明显增高，血清内毒素的释放，在60 min时间点达到高峰，并持续180 min (Fig 3, 4).
图3 体外循环中小肠组织TNF-α的变化
Fig 3 Changes of TNF-α in intestinal mucosa during CPB
, 百拇医药
bP<0.01 vs control group. CON： control group.
图4 体外循环中血清TNF-α的变化
Fig 4 Changes of serum TNF-α during CPB
bP<0.01 vs control group. CON： control group.
2.3 胃窦部粘膜中TNF-α mRNA的表达 CPB组胃窦部粘膜中TNF-α mRNA的相对表达量(0.76±0.09) mg.L-1较对照组明显增高[(0.42±0.08) mg.L-1, Fig 5].
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3 讨论
体外循环术后危重患者多脏器功能衰竭的发展往往归结于胃肠道的病理学改变[4]. 胃肠道缺血可损害胃肠道粘膜屏障的完整性并引起胃肠道菌群移位及内毒素吸收增加. 在正常情况下，即使胃肠道有大量的革兰阴性细菌，在循环血液中却很难检测到内毒素浓度，这是由于宿主健全的防御机制反应，即胃肠道粘膜屏障的完整性和肝脏网状内皮系统清除内毒素的功能. CPB开放阻断钳5 min后内毒素浓度明显升高，随后保持较高水平，麻醉诱导期间及CPB开始后，内毒素浓度升高的原因，可能由于输液引起的致热原物质及CPB过程内毒素的污染如体外循环管道、冷灌液等. 这类环境因素引起内毒素释放远低于来源于革兰阴性杆菌细胞壁的释放，因为患者均在术前置于良好的休养环境，而且术中的血培养结果是阴性. 开放升主动脉阻断钳后，内毒素释放升高的原因是CPB阻断期间非搏动血流所致的内脏血管床的低流量灌注，这种低流量的灌注使机体全身处于“控制性休克”状态，不充分的胃肠道灌注导致胃肠道粘膜屏障和粘膜血管床的损伤，并释放更多的血管活性物质，如儿茶酚胺类及血管加压素，这些物质加重血管收缩和胃肠道的通透性，促进了细菌由胃肠道转移至淋巴结，这样导致了大量的内毒素进入了门静脉系统. 在正常条件下，血液中内毒素由肝脏的Kuffer细胞所清除，然而在CPB过程中Kuffer细胞功能被大量的网织内皮细胞碎片及聚集的蛋白质所抑制，导致大量的内毒素得以进入全身循环. CPB初期，内毒素浓度较低证明这种清除功能仍在起作用，开放主动脉钳后，尽管心脏被重新跳动，这样增加了内脏血流可使更多的内毒素进入门静脉系统，这可解释开放升主动脉钳后，内毒素浓度仍较高的原因.
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我们的实验结果发现，CPB中血清TNF-α浓度较对照组明显升高，且与CPB的时间成正比，特别是在开放升主动脉阻断钳后，其TNF-α的释放量同内毒素释放量一样达到最高峰. Casey等[1]的研究表明内毒素是诱发TNF-α分泌的最强烈的刺激物，TNF-α是CPB中诱发炎症介质的主要因素，在感染性休克，恶液质及多脏器功能衰竭的病理生理改变中起着非常重要的作用. 而Wan等[5]和Loick等[6]的研究则进一步指出，尽管CPB中血清TNF-α升高，但是作为一种定位广泛的单核因子，在CPB过程中究竟是由哪种器官内的单核细胞或巨噬细胞产生，目前仍无明确定论. 我们的实验结果显示了CPB中TNF-α在胃窦部粘膜中呈现高表达,从而支持了胃肠道是全身多脏器功能衰竭始动器官的论述.
图5 体外循环中TNF-α mRNA表达的变化
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Fig 5 TNF-α mRNA comparative expression quantity in gastric mucosa during CPB
aP<0.05 vs control group. CON： control group.
作者简介：徐 鹏(1964-)， 男(汉族)， 黑龙江省哈尔滨市人. 博士， 主治医师， 讲师. Tel.(029)3375312 Email. pengxus@yahoo.com
参考文献:
[1] Casey LC. Role of cytokines in the pathogenesis of cardiopulmonary-induce multisystem organ failure [J]. Ann Thorac Surg, 1993;56(Suppl):92-96.
, 百拇医药
[2] Butler J, Rocker GM, Westaly S. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass [J]. Ann Thorac Surg,1993;55(2):552-559.
[3] Luster MI， Germolec DC， Yoshida T et al. Edotoxin-induce cytokine gene expression andexcretion in the liver [J]. Hepatology,1994;19(2):480-483.
[4] Cremer S, Martin M, Redl H et al. Systemic inflammatory response syndrome after cardiac operation [J]. Ann Thorac Surg,1996;61(6):1714-1720.
, 百拇医药
[5] Wan S, Leclerc JL, Vincent JL et al. Cytokine response to cardiopulmonary bypass: Lessens learned from cardic transplantation [J]. Ann Thorac Surg,1997;63(1):269-276.
[6] Loick HM, Mollhoff T, Berendes E et al. Influence of enoximone on systemic and splanchnic oxygen utilization and endotoxin release following cardiopulmonary bypass [J]. Intens Care Med, 1997;23(3):267-275.
收稿日期：1999-05-12； 修回日期：1999-12-31, 百拇医药
单位：徐鹏(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；陈萍(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；王辉山(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；侯晓彬(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：体外循环；消化；肿瘤坏死因子-α；内毒素；基因表达；反转录PCR；兔
第四军医大学学报000537 摘 要： 目的 探讨体外循环(CPB)过程中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在家兔胃粘膜中的表达及细胞定位. 方法 采用家兔CPB模型，运用反转录PCR及ELISA的方法，结合血浆中TNF-α、内毒素浓度的变化，探讨了TNF-α mRNA的表达及细胞定位的规律. 结果 ①CPB过程中TNF-α mRNA在胃肠道的相对表达量较对照组明显增高. ②CPB过程中胃肠道组织中的TNF-α呈不同程度的增高，而且胃肠道组织中TNF-α浓度高于血浆中的浓度. ③CPB过程中血浆内毒素浓度较对照组明显增高(P<0.01)，其增高程度与胃肠道组织中TNF-α的释放及基因表达相一致. 结论 CPB中，组织及血浆中内毒素和TNF-α明显增高，胃窦部粘膜TNF-α mRNA的相对表达量增高可能是CPB手术后发生胃肠道并发症的重要原因.
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中图号：Q654.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0636-03
Expression and localization of TNF-α mRNA in gastric mucosa of CPB rabbit
XU Peng, YI Ding-Hua, CHEN Ping, WANG Hui-Shan, HOU Xiao-Bin
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract： AIM To elucidate the kinetics of expression and release of the tumor necrosis factor-α in the gastric mucosal, mechanism of the production, and the role in complications of the open heart operations. METHODS Using CPB in rabbit, together with RT-PCR and ELISA etc, the expression of TNF-α mRNA, and the release of TNF-α in the gastroin-testine, the relationships with organ damage and with exdotoxin translocation in tissues were investigated systematically. RESULTS ①The expression of TNF-α mRNA in the gastrointestinal trunk could be successively increased during CPB. ② TNF-α level in gastrointestine was elevated but in different degrees during CPB. Levels and duration of TNF-α in tissues were greater than those in plasma. ③Endotoxin levels in plasma were markedly increased during CPB, which was parallel to the gene expression and release of TNF-α in the gastrointestinal trunk. CONCLUSION The release of TNF-α in tissue and plasma is related to endotoxin translocation in tissue during CPB. It might play an important role in complications of the open heart operations.
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Keywords： cardiopulmonary bypass; gastrointestine; TNF-α; endotoxin; gene expression; RT-PCR; rabbit
0 引言
细胞因子在体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)中的损伤作用[1,2]虽已为人们所共识，但关于重要器官内细胞因子表达、释放、产生机制及其与器官功能损害关系等均尚不清楚. 消化道并发症是心脏手术后死亡率较高的并发症，为此我们以兔CPB为模型，较系统地探讨了CPB中胃肠道组织内肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)及内毒素(endotoxin)的释放、胃肠粘膜TNF-α mRNA表达等变化，并结合胃肠道粘膜功能损害内毒素移位等情况，试图探讨体外循环中TNF-α对胃肠道功能的影响，并为临床进一步防治心脏手术后胃肠道并发症提供实验依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 兔CPB模型的建立: 取幼兔24只(本校实验动物中心提供)，雌雄不拘，随机分为CPB组和对照组，每组12只. 实验兔术前禁食水6 h，戊巴比妥钠麻醉(35 mg.kg-1， ip)，切开气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，股动脉插管测压，胸骨正中切口开胸，3 mg.kg-1肝素化后，分别于右颈总动脉，右心房和左心房插入动脉泵管，腔静脉引流管和左心房引流管，连接小型CPB机. 采用CPB温度为28～32℃. 中度血液稀释(HCT：0.20～0.24),中流量为(70～110) mL.kg-1.min-1，平均动脉压维持在8～12 kPa. 总转流时间为180 min，其中主动脉阻断60 min，辅助循环时间120 min. 手术对照组动物单纯麻醉开胸180 min后留取组织标本.
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1.2 方法 分别在30，60，90，120及180 min经门静脉采血5 mL，缓慢加入抗凝的塑料管中，轻轻混匀，置入冰水浴中，4℃，3500 r.min-1 低温离心15 min. 分装血清，液氮中保存待测. 按上述时间点，活杀动物，取胃、空肠、回肠组织. 取胃，生理盐水冲洗胃内容物，钝刀刮取粘膜(部分固定，制作光镜及电镜标本)，置冻存管中液氮保存，检测组织TNF-α、内毒素水平及组织内mRNA表达. 血浆和组织中TNF-α的测定采用ELISA方法，血浆中内毒素含量的测定采用双抗体夹心法，组织标本称重后按1∶10加入无热原生理盐水，冰水浴中匀浆，匀浆液100℃水浴10 min后离心取上清，按基质偶氮鲎试剂显色测定法测定组织内毒素含量(北京304医院试剂盒). 异硫氰酸胍法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定组织内TNF-α mRNA纯度及含量，并进行RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳以鉴定其完整性. 参照Luster等[3]的方法合成TNF-α PCR引物. PCR反应体系为50 μL，20 mmol. L-1 Tris.HCl (pH 8.4)， 25 mmol.L-1 MgCl2， 200 μmol.L-1 dNTP, 100 nmol.L-1引物, 10.5 μL cDNA, 50 nmoL.s-1 Taq DNA聚合酶. 经94℃ 40 s, 54℃ 40 s, 72℃ 60 s, 35个循环后,72℃延伸10 min,扩增产物行电泳照相分析.
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2 结果
2.1 CPB兔血清及组织中TNF-α的变化 兔CPB中TNF-α的改变随CPB时间的改变，释放量增高，尤其是开放升主动脉阻断钳过程中，其释放量达到高峰，与对照组相比有显著差异(P<0.01, Fig 1, 2).
图1 体外循环中小肠组织内毒素的变化
Fig 1 Changes of endotoxin concentration in intestinal mucosa during CPB
aP<0.05 vs control group. CON： control group.
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图2 体外循环中血清内毒素的变化
Fig 2 Changes of serum endotoxin concentration during CPB
bP<0.01 vs control group. CON： control group.
2.2 CPB兔血清及组织中内毒素的变化 随CPB时间延长，血清及组织中内毒素释放较对照组明显增高，血清内毒素的释放，在60 min时间点达到高峰，并持续180 min (Fig 3, 4).
图3 体外循环中小肠组织TNF-α的变化
Fig 3 Changes of TNF-α in intestinal mucosa during CPB
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bP<0.01 vs control group. CON： control group.
图4 体外循环中血清TNF-α的变化
Fig 4 Changes of serum TNF-α during CPB
bP<0.01 vs control group. CON： control group.
2.3 胃窦部粘膜中TNF-α mRNA的表达 CPB组胃窦部粘膜中TNF-α mRNA的相对表达量(0.76±0.09) mg.L-1较对照组明显增高[(0.42±0.08) mg.L-1, Fig 5].
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3 讨论
体外循环术后危重患者多脏器功能衰竭的发展往往归结于胃肠道的病理学改变[4]. 胃肠道缺血可损害胃肠道粘膜屏障的完整性并引起胃肠道菌群移位及内毒素吸收增加. 在正常情况下，即使胃肠道有大量的革兰阴性细菌，在循环血液中却很难检测到内毒素浓度，这是由于宿主健全的防御机制反应，即胃肠道粘膜屏障的完整性和肝脏网状内皮系统清除内毒素的功能. CPB开放阻断钳5 min后内毒素浓度明显升高，随后保持较高水平，麻醉诱导期间及CPB开始后，内毒素浓度升高的原因，可能由于输液引起的致热原物质及CPB过程内毒素的污染如体外循环管道、冷灌液等. 这类环境因素引起内毒素释放远低于来源于革兰阴性杆菌细胞壁的释放，因为患者均在术前置于良好的休养环境，而且术中的血培养结果是阴性. 开放升主动脉阻断钳后，内毒素释放升高的原因是CPB阻断期间非搏动血流所致的内脏血管床的低流量灌注，这种低流量的灌注使机体全身处于“控制性休克”状态，不充分的胃肠道灌注导致胃肠道粘膜屏障和粘膜血管床的损伤，并释放更多的血管活性物质，如儿茶酚胺类及血管加压素，这些物质加重血管收缩和胃肠道的通透性，促进了细菌由胃肠道转移至淋巴结，这样导致了大量的内毒素进入了门静脉系统. 在正常条件下，血液中内毒素由肝脏的Kuffer细胞所清除，然而在CPB过程中Kuffer细胞功能被大量的网织内皮细胞碎片及聚集的蛋白质所抑制，导致大量的内毒素得以进入全身循环. CPB初期，内毒素浓度较低证明这种清除功能仍在起作用，开放主动脉钳后，尽管心脏被重新跳动，这样增加了内脏血流可使更多的内毒素进入门静脉系统，这可解释开放升主动脉钳后，内毒素浓度仍较高的原因.
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我们的实验结果发现，CPB中血清TNF-α浓度较对照组明显升高，且与CPB的时间成正比，特别是在开放升主动脉阻断钳后，其TNF-α的释放量同内毒素释放量一样达到最高峰. Casey等[1]的研究表明内毒素是诱发TNF-α分泌的最强烈的刺激物，TNF-α是CPB中诱发炎症介质的主要因素，在感染性休克，恶液质及多脏器功能衰竭的病理生理改变中起着非常重要的作用. 而Wan等[5]和Loick等[6]的研究则进一步指出，尽管CPB中血清TNF-α升高，但是作为一种定位广泛的单核因子，在CPB过程中究竟是由哪种器官内的单核细胞或巨噬细胞产生，目前仍无明确定论. 我们的实验结果显示了CPB中TNF-α在胃窦部粘膜中呈现高表达,从而支持了胃肠道是全身多脏器功能衰竭始动器官的论述.
图5 体外循环中TNF-α mRNA表达的变化
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Fig 5 TNF-α mRNA comparative expression quantity in gastric mucosa during CPB
aP<0.05 vs control group. CON： control group.
作者简介：徐 鹏(1964-)， 男(汉族)， 黑龙江省哈尔滨市人. 博士， 主治医师， 讲师. Tel.(029)3375312 Email. pengxus@yahoo.com
参考文献:
[1] Casey LC. Role of cytokines in the pathogenesis of cardiopulmonary-induce multisystem organ failure [J]. Ann Thorac Surg, 1993;56(Suppl):92-96.
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[2] Butler J, Rocker GM, Westaly S. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass [J]. Ann Thorac Surg,1993;55(2):552-559.
[3] Luster MI， Germolec DC， Yoshida T et al. Edotoxin-induce cytokine gene expression andexcretion in the liver [J]. Hepatology,1994;19(2):480-483.
[4] Cremer S, Martin M, Redl H et al. Systemic inflammatory response syndrome after cardiac operation [J]. Ann Thorac Surg,1996;61(6):1714-1720.
, 百拇医药
[5] Wan S, Leclerc JL, Vincent JL et al. Cytokine response to cardiopulmonary bypass: Lessens learned from cardic transplantation [J]. Ann Thorac Surg,1997;63(1):269-276.
[6] Loick HM, Mollhoff T, Berendes E et al. Influence of enoximone on systemic and splanchnic oxygen utilization and endotoxin release following cardiopulmonary bypass [J]. Intens Care Med, 1997;23(3):267-275.
收稿日期：1999-05-12； 修回日期：1999-12-31, 百拇医药