伤寒杆菌聚合酶链反应检测方法
作者：苏明权 于文彬 马越云 张建芳 彭道荣 丁振若
单位：苏明权(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；于文彬(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；马越云(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；张建芳(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；彭道荣(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；丁振若(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)
关键词：伤寒杆菌；聚合酶链反应；菌血症
第四军医大学学报000646 摘要:目的 探讨聚合酶链反应快速检出血培养物中的伤寒杆菌，用于伤寒杆菌菌血症的诊断. 方法 根据伤寒杆菌鞭毛抗原基因DNA核苷酸序列设计特异性寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应技术快速检出血培养物中的伤寒杆菌. 结果 对伤寒杆菌和7株非伤寒杆菌,同时进行PCR扩增,结果只有伤寒杆菌出现458 bp的特异性扩增区带，其他7株非伤寒杆菌均未出现458 bp的扩增区带. 有关引物的敏感性,经对倍比稀释的伤寒杆菌菌悬液进行扩增,结果表明,在100个菌细胞时即可扩增出明显的458 bp的区带. 应用所建立的PCR方法,对10份模拟血培养中的伤寒杆菌进行检测,已确定PCR鉴定伤寒杆菌的最佳鉴定时机,在第6小时检测出的阳性结果可达80%，8 h以后的阳性结果就可达100%；对18例发热患者血液用常规细菌增菌培养、分离鉴定与PCR法同时检测，结果分离鉴定法有5例被证实为伤寒杆菌感染；有6例被PCR扩增出特异性区带，在检出时间上PCR法(8 h)明显早于细菌分离鉴定法(48 h). 结论 以伤寒杆菌鞭毛抗原基因DNA核苷酸序列设计特异性寡核苷酸引物，用于血培养物中伤寒杆菌的快速检出，为伤寒的临床早期诊断及时治疗提供诊断依据.
, http://www.100md.com
中图号：R516.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-S0113-03
Rapid detection of typhimurium bacteremia by polymerase chain reaction
SU Ming-Quan YU Wen-Bin MA Yue-Yun ZHANG Jian-Fang PENG Dao-Rong DING Zhen-Ruo
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710033,China)
Abstract：AIM To study clinical feasibility of rapid detection of typhimurium bactermia in blood culture by polymerase chain reaction(PCR). METHODS A pair of oligo nucleotide primers were designed by according to H antigen of typhimurium and a PCR system was established to detect typhimurium. RESULTS The 458 bp special strip was found only in the PCR amplification of typhimurium sample,but not in the other seven non-typhimurium samples. The sensitivity test indicated that it could detect 100 bacterial cells. And in the simulated blood culture samples of typhimurium,the positive rate came to 80% at 6 hours and 100% at 8 hours of culture time of 18 cases tested by breakaway and PCR,5 cases were proved by breakaway to be masculine;6 cases by PCR to be masculine. As for test hours, PCR (8 h) was distinctly earlier than breakaway(48 h). CONCLUSION The PCR system we established can provide early diagnostic proofs for typhimurium bacteremia.
, 百拇医药
Keywords:typhimurium; polymerase chain reaction; bacteremia
0 引言
伤寒是由伤寒杆菌经消化道侵入而引起的急性传染病,遍布于世界各地,以热带、亚热带地区为多见，在我国和其他发展中国家仍是一种常见的传染病. 伤寒杆菌经口腔到消化道侵害小肠粘膜而入血，可造成伤寒杆菌菌血症. 所以，伤寒的早期诊断十分重要. 以往血清学检测血清中的特异性抗体，其敏感性和特异性均不理想. 血液培养虽然是伤寒确诊的金指标，但其阳性率在1～2 wk才达80%～90%[1],而且受患者取血标本的时间,以及是否用药等因素的影响. 结果达不到快速早期诊断和及时治疗的目的. 聚合酶链反应技术的兴起，为伤寒的快速、早期诊断提供了有力的保证. 我们以伤寒杆菌鞭毛抗原基因，设计一对特异性引物，用于检测和鉴定血培养中的伤寒杆菌，为伤寒的早期、快速诊断和治疗提供依据.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 菌株来源 伤寒杆菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌(西京医院检验科细菌室保存菌株).
1.2 引物设计与合成 根据goldkeY数据库中伤寒杆菌基因序列,选取鞭毛抗原特异性基因设计一对特异性引物,扩增片段为:458 bp,由西京医院临床分子生物学研究室合成. 序列为:
TF1 5-′ACTGCTAAAACCACTACT-3′
TF2 5′-TTAACGCAGTAAAGAGAG-3′
1.3 培养物 为来我院就诊的18例发热患者，静脉抽血3～5 mL于肝素抗凝，立即接种于葡萄糖肉汤增菌液中培养.
1.4 血培养物的制备 将伤寒杆菌接种于葡萄糖肉汤增菌液(含3 mL无菌血液)中,分别于37℃ 培养2,4,6,8和10 h,观察其阳性检出率.
, 百拇医药
1.5 伤寒杆菌DNA的提取 伤寒杆菌在血琼脂平板上培养18～24 h的菌落,于TNE缓冲液处理15 min,9700 g,离心10 min,去上清,加50 μL蛋白酶K裂解液,55℃ 60 min,95℃ 10 min,酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次,乙醇沉淀,TE溶解.
1.6 血培养物中伤寒杆菌DNA的提取 取不同培养时间的伤寒杆菌培养物100 μL,9700 g,离心15 min,去上清,用无菌水溶解红细胞,9700 g,离心10 min,去上清,加50 μL蛋白酶K裂解液,55℃ 60 min,95℃ 10 min,酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次,乙醇沉淀,TE溶解备用.
1.7 PCR扩增 反应总体积为25 μL,10×PCR缓冲液2.5 μL,4×dNTP 1.5 μL,引物1.2各0.25 μL,无菌去离子水9.5 μL,模板10 μL,Taq DNA聚合酶1 U*μL-1, 以无菌石蜡油30 μL覆盖,进入PCR循环,循环参数为:95℃ 5 min,94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,32个循环,最后72℃ 延伸5 min.
, 百拇医药
1.8 扩增产物的检测 扩增产物15 μL,以20 mL*L-1琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min,于紫外光下观察结果,出现458 bp扩增带者为阳性,未见458 bp扩增带为阴性.
2 结果
2.1 特异性实验 取伤寒杆菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌. 分别制备PCR模板,同时进行PCR扩增,结果只有伤寒杆菌出现单一的458 bp的特异性扩增区带(Fig 1).
2.2 敏感性实验结果 将伤寒杆菌纯培养物,制备菌悬液,进行倍比系列稀释,结果102菌细胞,即可扩增出阳性区带(Fig 2).
图 1 特异性实验结果
, 百拇医药
Fig 1 Specificity test results
1. PCR marker; 2. S.typhi; 3. S.typhimurium; 4. S.enteritidis; 5. Dxsentery bacteria; 6. E.coli; 7. S.aureus; 8. P.aeruginosa; 9. β-hemolytic streptococcus
图2 敏感性实验结果
Fig 2 Senstivity test results
1. PCR marker; 2. 1×109 CFU.mL-1; 3. 1×108CFU.mL-1; 4. 1×107 CFU.mL-1; 5. 1×106 CFU/mL; 6. 1×105 CFU.mL-1; 7. 1×104 CFU.mL-1; 8. 1×103 CFU.mL-1; 9. 1×102 CFU/mL
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2.3 10份伤寒杆菌血培养物,不同时间检出结果 如Tab 1所示.
表 1 血培养物中不同时间阳性检出率
Tab 1 Positive test ratio of blood cultivate in different time t/h
Positive
Negative
Positive ratio(%)
2
0
10
0
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4
0
10
0
6
8
2
80
8
10
0
100
10
10
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0
100
2.4 临床标本培养物中的检出结果 对18例血培养物检出中，增菌分离鉴定5例，阳性检出率为：27.7%;PCR检出6例，阳性检出率为：33.3%.
3 讨论
伤寒的诊断主要依据病原学的实验室诊断. 由于抗生素的广泛应用，导致血培养时伤寒杆菌的检出率明显降低，常规血清学检测患者血清中的特异性抗体，其特异性和敏感性均存在一定的问题，从而影响检测结果的准确性和可靠性. 为此，寻找和建立特异性强、敏感性高、准确、快速的实验室诊断方法，是早期快速诊断伤寒的唯一途径.
随着分子细菌学研究的进展和分子生物学技术的广泛应用，对伤寒杆菌的基因结构已基本清楚，在沙门菌的鞭毛抗原H1-d中,由1530个硷基核苷酸序列所编码[2.3]. 虽然d抗原也存在于其他非伤寒沙门菌中,并非伤寒杆菌所独有,经研究证实[4]伤寒杆菌有独立的基因区域为1072～1089的高变区. 据此从伤寒杆菌独立的高变基因区域，设计一对具有高度特异的引物序列，用于伤寒杆菌的早期快速诊断.
, http://www.100md.com
PCR检测伤寒杆菌的关键是所设计引物的特异性和敏感性,为确定其特异性,本研究采用伤寒杆菌和7株非伤寒杆菌包括:鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌,同时进行PCR扩增,结果只有伤寒杆菌出现458 bp的特异性扩增区带，其他7株非伤寒杆菌均未出现458 bp的扩增区带. 有关引物的敏感性,经对倍比稀释的伤寒杆菌菌悬液进行扩增,结果表明,在100个菌细胞时即可扩增出明显的458 bp的区带,从理论上讲,当伤寒杆菌感染出现临床症状时,患者血液中的菌数量已远远超100个菌细胞,认为应用1次PCR扩增基本可检出伤寒患者血液中的伤寒杆菌. 杨绍基等[5]报道,应用1次PCR可检出血清中的90%(9/10)的伤寒杆菌,可检出白细胞中100%(3/3)的伤寒杆菌. 因此，采用PCR检测伤寒患者全血白细胞中的伤寒杆菌,引物的敏感性基本达到快速早期诊断的目的,而且比二次扩增或巢式扩增省时省力又降低成本.
在伤寒的临床诊断中，血液培养是诊断伤寒的主要手段，常规分离鉴定，要经过18～24 h的增菌培养,然后转种于固体培养基中再培养18～24 h,最后进行生化和血清学鉴定,需要2～3 d的时间才能做出最终鉴定结果，不利于早期快速的诊断和治疗. 采用PCR技术对疑为伤寒杆菌感染患者血培养物中伤寒杆菌的鉴定无疑是一种最佳的鉴定方法,更加有力于伤寒的早期快速的诊断和治疗. 为探讨伤寒杆菌感染患者在血液培养物中PCR的最佳鉴定时间,应用所建立的PCR方法,对10份模拟血培养中的伤寒杆菌进行检测,已确定PCR鉴定伤寒杆菌的最佳鉴定时机,结果证实在第6小时检测出的阳性结果可达80%，8 h以后的阳性结果就可达100%；对18例发热患者血液用常规细菌增菌培养、分离鉴定与PCR法同时检测，结果分离鉴定法有5例被证实为伤寒杆菌感染；有6例被PCR扩增出特异性区带，在检出时间上PCR法( 8 h)明显早于细菌分离鉴定法(24～48 h)，临床对发热患者在未明诊断者中，首先采用抗生素的进行治疗，影响病原菌的培养分离鉴定阳性率，而PCR法检测的为病原菌的遗传物质DNA，不受任何抗生素治疗的影响，从而达到快速鉴定的目的.
, 百拇医药
作者简介：苏明权(1959-), 男(汉族)，河北省平山县人.主管技师. Tel.(029)3375572 Email.sumq@163.net
参考文献：
[1]王季午. 传染病学[M].上海:上海科学技术出版社,1988.
[2] Frankel G,Neaton SMC,Schoolnik GK et al. Unique sequence in region VI of the flagellin gene of Salmonella typhi [J]. Mol Microbiol，1989;3(10):1379-1383.
[3] Wei L,Joys TM. Covalent structure of three phase flagellarfilament proteins of Salmonella[J]. Mol Biol,1985;186(4):791-803.
, 百拇医药
[4] Song JH,Cho H,Park MY et al. Detection of Salmonella typhi in blood of patients with typhiod fever by polymetase chain reaction[J]. Clin Microbiol,1993;31(6):1439-1443.
[5]杨绍基,文 博,高志良et al. 用聚合酶链反应快速检测血液中的伤寒杆菌[J]. 中山医科大学学报,1995;16(4):68-71.
收稿日期:1999-11-30
修回日期:1999-12-30, 百拇医药
单位：苏明权(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；于文彬(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；马越云(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；张建芳(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；彭道荣(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)；丁振若(第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033)
关键词：伤寒杆菌；聚合酶链反应；菌血症
第四军医大学学报000646 摘要:目的 探讨聚合酶链反应快速检出血培养物中的伤寒杆菌，用于伤寒杆菌菌血症的诊断. 方法 根据伤寒杆菌鞭毛抗原基因DNA核苷酸序列设计特异性寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应技术快速检出血培养物中的伤寒杆菌. 结果 对伤寒杆菌和7株非伤寒杆菌,同时进行PCR扩增,结果只有伤寒杆菌出现458 bp的特异性扩增区带，其他7株非伤寒杆菌均未出现458 bp的扩增区带. 有关引物的敏感性,经对倍比稀释的伤寒杆菌菌悬液进行扩增,结果表明,在100个菌细胞时即可扩增出明显的458 bp的区带. 应用所建立的PCR方法,对10份模拟血培养中的伤寒杆菌进行检测,已确定PCR鉴定伤寒杆菌的最佳鉴定时机,在第6小时检测出的阳性结果可达80%，8 h以后的阳性结果就可达100%；对18例发热患者血液用常规细菌增菌培养、分离鉴定与PCR法同时检测，结果分离鉴定法有5例被证实为伤寒杆菌感染；有6例被PCR扩增出特异性区带，在检出时间上PCR法(8 h)明显早于细菌分离鉴定法(48 h). 结论 以伤寒杆菌鞭毛抗原基因DNA核苷酸序列设计特异性寡核苷酸引物，用于血培养物中伤寒杆菌的快速检出，为伤寒的临床早期诊断及时治疗提供诊断依据.
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中图号：R516.3 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-S0113-03
Rapid detection of typhimurium bacteremia by polymerase chain reaction
SU Ming-Quan YU Wen-Bin MA Yue-Yun ZHANG Jian-Fang PENG Dao-Rong DING Zhen-Ruo
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710033,China)
Abstract：AIM To study clinical feasibility of rapid detection of typhimurium bactermia in blood culture by polymerase chain reaction(PCR). METHODS A pair of oligo nucleotide primers were designed by according to H antigen of typhimurium and a PCR system was established to detect typhimurium. RESULTS The 458 bp special strip was found only in the PCR amplification of typhimurium sample,but not in the other seven non-typhimurium samples. The sensitivity test indicated that it could detect 100 bacterial cells. And in the simulated blood culture samples of typhimurium,the positive rate came to 80% at 6 hours and 100% at 8 hours of culture time of 18 cases tested by breakaway and PCR,5 cases were proved by breakaway to be masculine;6 cases by PCR to be masculine. As for test hours, PCR (8 h) was distinctly earlier than breakaway(48 h). CONCLUSION The PCR system we established can provide early diagnostic proofs for typhimurium bacteremia.
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Keywords:typhimurium; polymerase chain reaction; bacteremia
0 引言
伤寒是由伤寒杆菌经消化道侵入而引起的急性传染病,遍布于世界各地,以热带、亚热带地区为多见，在我国和其他发展中国家仍是一种常见的传染病. 伤寒杆菌经口腔到消化道侵害小肠粘膜而入血，可造成伤寒杆菌菌血症. 所以，伤寒的早期诊断十分重要. 以往血清学检测血清中的特异性抗体，其敏感性和特异性均不理想. 血液培养虽然是伤寒确诊的金指标，但其阳性率在1～2 wk才达80%～90%[1],而且受患者取血标本的时间,以及是否用药等因素的影响. 结果达不到快速早期诊断和及时治疗的目的. 聚合酶链反应技术的兴起，为伤寒的快速、早期诊断提供了有力的保证. 我们以伤寒杆菌鞭毛抗原基因，设计一对特异性引物，用于检测和鉴定血培养中的伤寒杆菌，为伤寒的早期、快速诊断和治疗提供依据.
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1 材料和方法
1.1 菌株来源 伤寒杆菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌(西京医院检验科细菌室保存菌株).
1.2 引物设计与合成 根据goldkeY数据库中伤寒杆菌基因序列,选取鞭毛抗原特异性基因设计一对特异性引物,扩增片段为:458 bp,由西京医院临床分子生物学研究室合成. 序列为:
TF1 5-′ACTGCTAAAACCACTACT-3′
TF2 5′-TTAACGCAGTAAAGAGAG-3′
1.3 培养物 为来我院就诊的18例发热患者，静脉抽血3～5 mL于肝素抗凝，立即接种于葡萄糖肉汤增菌液中培养.
1.4 血培养物的制备 将伤寒杆菌接种于葡萄糖肉汤增菌液(含3 mL无菌血液)中,分别于37℃ 培养2,4,6,8和10 h,观察其阳性检出率.
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1.5 伤寒杆菌DNA的提取 伤寒杆菌在血琼脂平板上培养18～24 h的菌落,于TNE缓冲液处理15 min,9700 g,离心10 min,去上清,加50 μL蛋白酶K裂解液,55℃ 60 min,95℃ 10 min,酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次,乙醇沉淀,TE溶解.
1.6 血培养物中伤寒杆菌DNA的提取 取不同培养时间的伤寒杆菌培养物100 μL,9700 g,离心15 min,去上清,用无菌水溶解红细胞,9700 g,离心10 min,去上清,加50 μL蛋白酶K裂解液,55℃ 60 min,95℃ 10 min,酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次,乙醇沉淀,TE溶解备用.
1.7 PCR扩增 反应总体积为25 μL,10×PCR缓冲液2.5 μL,4×dNTP 1.5 μL,引物1.2各0.25 μL,无菌去离子水9.5 μL,模板10 μL,Taq DNA聚合酶1 U*μL-1, 以无菌石蜡油30 μL覆盖,进入PCR循环,循环参数为:95℃ 5 min,94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 1 min,32个循环,最后72℃ 延伸5 min.
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1.8 扩增产物的检测 扩增产物15 μL,以20 mL*L-1琼脂糖(含EB液)上100 V电泳30 min,于紫外光下观察结果,出现458 bp扩增带者为阳性,未见458 bp扩增带为阴性.
2 结果
2.1 特异性实验 取伤寒杆菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌. 分别制备PCR模板,同时进行PCR扩增,结果只有伤寒杆菌出现单一的458 bp的特异性扩增区带(Fig 1).
2.2 敏感性实验结果 将伤寒杆菌纯培养物,制备菌悬液,进行倍比系列稀释,结果102菌细胞,即可扩增出阳性区带(Fig 2).
图 1 特异性实验结果
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Fig 1 Specificity test results
1. PCR marker; 2. S.typhi; 3. S.typhimurium; 4. S.enteritidis; 5. Dxsentery bacteria; 6. E.coli; 7. S.aureus; 8. P.aeruginosa; 9. β-hemolytic streptococcus
图2 敏感性实验结果
Fig 2 Senstivity test results
1. PCR marker; 2. 1×109 CFU.mL-1; 3. 1×108CFU.mL-1; 4. 1×107 CFU.mL-1; 5. 1×106 CFU/mL; 6. 1×105 CFU.mL-1; 7. 1×104 CFU.mL-1; 8. 1×103 CFU.mL-1; 9. 1×102 CFU/mL
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2.3 10份伤寒杆菌血培养物,不同时间检出结果 如Tab 1所示.
表 1 血培养物中不同时间阳性检出率
Tab 1 Positive test ratio of blood cultivate in different time t/h
Positive
Negative
Positive ratio(%)
2
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2.4 临床标本培养物中的检出结果 对18例血培养物检出中，增菌分离鉴定5例，阳性检出率为：27.7%;PCR检出6例，阳性检出率为：33.3%.
3 讨论
伤寒的诊断主要依据病原学的实验室诊断. 由于抗生素的广泛应用，导致血培养时伤寒杆菌的检出率明显降低，常规血清学检测患者血清中的特异性抗体，其特异性和敏感性均存在一定的问题，从而影响检测结果的准确性和可靠性. 为此，寻找和建立特异性强、敏感性高、准确、快速的实验室诊断方法，是早期快速诊断伤寒的唯一途径.
随着分子细菌学研究的进展和分子生物学技术的广泛应用，对伤寒杆菌的基因结构已基本清楚，在沙门菌的鞭毛抗原H1-d中,由1530个硷基核苷酸序列所编码[2.3]. 虽然d抗原也存在于其他非伤寒沙门菌中,并非伤寒杆菌所独有,经研究证实[4]伤寒杆菌有独立的基因区域为1072～1089的高变区. 据此从伤寒杆菌独立的高变基因区域，设计一对具有高度特异的引物序列，用于伤寒杆菌的早期快速诊断.
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PCR检测伤寒杆菌的关键是所设计引物的特异性和敏感性,为确定其特异性,本研究采用伤寒杆菌和7株非伤寒杆菌包括:鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型链球菌,同时进行PCR扩增,结果只有伤寒杆菌出现458 bp的特异性扩增区带，其他7株非伤寒杆菌均未出现458 bp的扩增区带. 有关引物的敏感性,经对倍比稀释的伤寒杆菌菌悬液进行扩增,结果表明,在100个菌细胞时即可扩增出明显的458 bp的区带,从理论上讲,当伤寒杆菌感染出现临床症状时,患者血液中的菌数量已远远超100个菌细胞,认为应用1次PCR扩增基本可检出伤寒患者血液中的伤寒杆菌. 杨绍基等[5]报道,应用1次PCR可检出血清中的90%(9/10)的伤寒杆菌,可检出白细胞中100%(3/3)的伤寒杆菌. 因此，采用PCR检测伤寒患者全血白细胞中的伤寒杆菌,引物的敏感性基本达到快速早期诊断的目的,而且比二次扩增或巢式扩增省时省力又降低成本.
在伤寒的临床诊断中，血液培养是诊断伤寒的主要手段，常规分离鉴定，要经过18～24 h的增菌培养,然后转种于固体培养基中再培养18～24 h,最后进行生化和血清学鉴定,需要2～3 d的时间才能做出最终鉴定结果，不利于早期快速的诊断和治疗. 采用PCR技术对疑为伤寒杆菌感染患者血培养物中伤寒杆菌的鉴定无疑是一种最佳的鉴定方法,更加有力于伤寒的早期快速的诊断和治疗. 为探讨伤寒杆菌感染患者在血液培养物中PCR的最佳鉴定时间,应用所建立的PCR方法,对10份模拟血培养中的伤寒杆菌进行检测,已确定PCR鉴定伤寒杆菌的最佳鉴定时机,结果证实在第6小时检测出的阳性结果可达80%，8 h以后的阳性结果就可达100%；对18例发热患者血液用常规细菌增菌培养、分离鉴定与PCR法同时检测，结果分离鉴定法有5例被证实为伤寒杆菌感染；有6例被PCR扩增出特异性区带，在检出时间上PCR法( 8 h)明显早于细菌分离鉴定法(24～48 h)，临床对发热患者在未明诊断者中，首先采用抗生素的进行治疗，影响病原菌的培养分离鉴定阳性率，而PCR法检测的为病原菌的遗传物质DNA，不受任何抗生素治疗的影响，从而达到快速鉴定的目的.
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作者简介：苏明权(1959-), 男(汉族)，河北省平山县人.主管技师. Tel.(029)3375572 Email.sumq@163.net
参考文献：
[1]王季午. 传染病学[M].上海:上海科学技术出版社,1988.
[2] Frankel G,Neaton SMC,Schoolnik GK et al. Unique sequence in region VI of the flagellin gene of Salmonella typhi [J]. Mol Microbiol，1989;3(10):1379-1383.
[3] Wei L,Joys TM. Covalent structure of three phase flagellarfilament proteins of Salmonella[J]. Mol Biol,1985;186(4):791-803.
, 百拇医药
[4] Song JH,Cho H,Park MY et al. Detection of Salmonella typhi in blood of patients with typhiod fever by polymetase chain reaction[J]. Clin Microbiol,1993;31(6):1439-1443.
[5]杨绍基,文 博,高志良et al. 用聚合酶链反应快速检测血液中的伤寒杆菌[J]. 中山医科大学学报,1995;16(4):68-71.
收稿日期:1999-11-30
修回日期:1999-12-30, 百拇医药