庆大霉素引起内耳组织自由基增加的直接证据
作者：陈贤明 王锦玲 姜鸿彦 陈亚东
单位：陈贤明(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科,陕西 西安 710033)；王锦玲(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科,陕西 西安 710033)；姜鸿彦(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科,陕西 西安 710033)；陈亚东(兰州大学分析测试中心)
关键词：庆大霉素；耳蜗；自由基；电子顺磁共振法
第四军医大学学报000633 摘要：目的 探讨庆大霉素体内注射与耳蜗组织自由基含量的关系. 方法 用电子顺磁共振法(electron paramagnetic resonance, EPR)直接检测正常的和注射庆大霉素后豚鼠耳蜗组织羟自由基含量，并比较其含量的变化. 结果 正常情况下豚鼠耳蜗组织存在一定量的羟自由基，其相对值为0.13±0.01,当体内注射庆大霉素后，耳蜗组织羟自由基含量相对值为0.28±0.00,比前者增加110%，两者比较有显著差异(P<0.05). 结论 EPR检测动物耳蜗组织自由基含量是一种直接、有效的方法，庆大霉素体内注射后可引起豚鼠耳蜗组织羟自由基含量显著增加.
, 百拇医药
中图号:R764.43 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0748-03
Direct evidence of gentamycin induced free radicals increase in cochlea
CHEN Xian-Ming WANG Jin-Ling JIANG Hong-Yan
(Department of Otorhinolaryngology, Xijing Hospital,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
CHEN Ya-Dong
, 百拇医药
(Center of Analysis and Test,Lanzhou University
Abstract:AIM To investigate the relationship between gentamycin administration and the content of free radicals in cochlea. METHODS Electron paramagnetic resonance (EPR) was used to provide a direct measure of oxygen radical production-hydroxyl radical in guinea pig's cochlea. RESULTS Normally some amount of free radicals existed in guinea pig's cochlea, it was 0.13±0.01. After animals were、injected with gentamycin, the amount of free radicals increased significantly, it raised by 110%. CONCLUSION EPR is a efficient method to detect free radicals in guinea pig's cochlea qualitatively and quantitatively,injected with gentamycin can result in increment of hydroxyl radical in guinea pig's cochlea.
, 百拇医药
Keywords:gentamycin; cochlea; free radicals; electron paramagnetic resonance
0 引言
氨基甙类抗生素(AmAn)引起的耳聋是临床倍受关注的问题之一，至今没有理想的防治方法. 一些证据表明自由基损伤与AmAn耳毒性有关[1-3]，用去铁胺，羟基苯甲酸、谷胱甘肽等自由基清除剂或抗氧化剂可预防或减轻AmAn引起的耳毒性[4].但也有人认为AmAn耳毒性与自由基损害关系不大，自由基清除剂也不能明显减轻庆大霉素等药物引起的耳聋[5].
AmAn的毒性机制还不明确，上述自由基损害的证据也是间接的，尚无直接证据说明AmAn能增加内耳的自由基产生. 我们采用当前检测自由基最直接、有效的电子顺磁共振法(electron paramagnetic resonance, EPR)检测了正常及注射庆大霉素后豚鼠耳蜗组织自由基的含量.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
选耳廓反射良好的花色豚鼠为实验动物，体质量250～350 g，雌雄皆用. 实验组动物硫酸庆大霉素im(200 mg.kg-1.d-1)3 d后取耳蜗进行EPR测试. 戊巴比妥钠ip(40 mg.kg-1)麻醉后，切除动物耳廓，打开听泡、充分止血，去除镫骨底板并刺破圆窗膜，用微量注射器从圆窗处向蜗内注入DMPO约20 μL(DMPO量浓度为100 mmol.L-1). 5 min后迅速取下听泡，剔除蜗壳，将蜗轴连同膜蜗管取下，加3倍体积Hank液(含DMPO 100 mmol.L-1)在离心管内用玻璃捧将上述组织研碎制成匀浆，组织匀浆静置片刻取上部组织悬液进行EPR分析.
正常对照组实验前不注射庆大霉素，标本制备方法同上. 空白对照组为Hank液，含DMPO100 mmol.L-1，无组织成分. 标准测试液含15 mL.L-1 H2O2, 50 μmol.L-1 FeSO4(pH 7.4)和50 mmol.L-1 DMPO，以此液测出的EPR信号作为参照. DMPO购自Sigma公司，经活性碳处理去杂质，并经滤膜过滤后，置-20℃环境避光贮存备用[6].
, 百拇医药
EPR测试方法：取上述组织悬液约50 μL，注入细玻璃管内，放入EPR测试腔. 仪器为ER200D-SRC型EPR波谱仪(德国Bruker). X-波段，常温下测试，微波频率9.78 GHz，微波功率30 mW、调频100 kHz、调幅1 Gs，扫描时间200 s、扫描次数10次、所得信号经计算机分析处理. 放大倍数10×105.
以EPR波谱第二峰的高度作为自由基含量的相对值，所得结果经t检验.
2 结果
2.1 EPR波谱 在15 mL.L-1 H2O2与50 μmol.L-1 FeSO4的混合液中加入50 mmol.L-1 DMPO,EPR波谱仪检测出现典型的4个峰组成的超精细分裂峰(Fig 1A)，峰强度比为1∶2∶2∶1，超精细分裂常数为aN=aH=14.9 G，正常对照组耳蜗组织悬液的EPR波谱也出现与第一条谱线形状相同的4个峰谱线，只是其峰的高度呈比例的降低. 基线也没有第一条谱线平整(Fig 1B). 实验组EPR峰明显增强，其谱线中除4个主峰外也同样出现一些峰值较低的杂乱波(Fig 1C). 而无组织成分的空白对照液中，未测出有特征性的信号峰(Fig 1D).
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2.2 自由基相对含量 测量标准液波谱的第二峰的高度，并以此为标准(其值定为1)，测其他几组成分峰值的相对高度，以此表示自由基含量的相对值. 结果正常组耳蜗组织悬液自由基相对含量为0.13±0.01(n=6)，实验组耳蜗组织悬液自由基相对含量为0.28±0.00(n=6). 结果经t检验，实验组自由基含量显著高于正常组(P<0.05).
图 1 各组标本EPR波谱
Fig 1 EPR spectra in different specimen
A. Typical spectra of DMPO-OH adduct； B. EPR signals in normal guinea pig's cochlea； C. EPR signals after animals were injected with gentamycin ； D. Cell-free solution.
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3 讨论
AmAn引起耳聋的机制一直不明确，有人发现抗氧化剂可减轻庆大霉素的耳毒性[4]，但尚无直接证据表明庆大霉素可引起耳蜗自由基含量增加. 正常生物细胞代谢过程中不断有少量自由基产生，但难以直接检测. DMPO能与氧族自由基羟基(OH·) 形成较稳定的加合物DMPO-OH，经EPR测试可表现为具有4个峰，强度比为1∶2∶2∶1，超精细分裂常数为aN=aH＝14.9 G的典型谱线，本实验中H2O2与FeSO4体系中加入DMPO所生成的谱线即为这一形状，是因H2O2在Fe2+催化下经Fenton反应生成的OH·被DMPO捕捉的结果.
正常豚鼠耳蜗组织也可测出较弱的上述形状信号峰，可能是因组织细胞在正常情况下产生少量羟基. 当动物注射硫酸庆大霉素后，EPR峰明显增强，说明用药后豚鼠耳蜗组织自由基产生增加.
, 百拇医药
据研究，氨基甙类抗生素在耳蜗毛细胞的积聚部位主要是线粒体[7]，有研究发现，庆大霉素可使动物耳蜗组织细胞线粒体肿胀，嵴减少甚至空化[8]. 线粒体是细胞能量代谢、蛋白合成的主要部位. 线粒体功能障碍，可能影响自由基代谢相关酶的合成和活性，同时电子传递链中也可能有更多电子溢出. 自由基的生成增加和代谢障碍，将使耳蜗毛细胞受损.
但自由基损害在AmAn引起耳聋的过程中所起作用的程度还不很清楚，是自由基直接导致耳蜗毛细胞脂质、蛋白质或核酸的氧化损害，还是自由基水平的升高作为一种启动因子，启动了毛细胞进一步损害的另一病理过程？目前还不清楚，尚需进一步研究.
作者简介:陈贤明(1964-)，男(汉族)，安徽省滁州市人. 博士生(导师王锦玲)，医师. Tel.(029)3375386(H)
参考文献：
, http://www.100md.com
[1] Pierson MG,Moller AR. Prephylaxis of kanamycin-induced ototoxicity by a radiopretectant[J]. Hear Res, 1981;4(1):79-87.
[2] Song BB,Anderson DJ, Schacht J. Protection from gentamycin ototoxicity by iron helators in guinea pig in vivo[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1997;282(1):369-377.
[3] 陈文弦，成诗银，王多宁et al.自由基在卡那霉素内耳中毒中的作用[J]. 第四军医大学学报,1996;17(1):8-10.
[4] Garetz SL,Altschuler RA,Schacht J. Attenuation of gentamycin ototoxicity by lutathione in the guinea pig in vivo[J]. Hear Res,1994;77(1):81-87.
, http://www.100md.com
[5] Book GR, Yates GK, Miller JJ et al. Effects of N-acetylcysteine on kanamycin totoxicity in the guinea pig[J]. Hear Res, 1983;9(2):255-262.
[6] Buettner GR,Oberley LW.Considerations in the spin trapping of supperoxide and ydroxyl radical in aqueous systems using DMPO[J]. Biochem Biophys Res Commun,1978;83(1):69-74.
[7] 丁大连. 卡那霉素在耳蜗毛细胞中的积聚部位[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志， 1997;32(6):348-351.
[8] 陈 阳，王锦玲，黄维国et al. 甲磺酸去铁受抗庆大霉素耳毒性作用及机制研究[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志，1999;32(3):154-156.
收稿日期:1999-09-03
修回日期:1999-12-18, 百拇医药
单位：陈贤明(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科,陕西 西安 710033)；王锦玲(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科,陕西 西安 710033)；姜鸿彦(第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科,陕西 西安 710033)；陈亚东(兰州大学分析测试中心)
关键词：庆大霉素；耳蜗；自由基；电子顺磁共振法
第四军医大学学报000633 摘要：目的 探讨庆大霉素体内注射与耳蜗组织自由基含量的关系. 方法 用电子顺磁共振法(electron paramagnetic resonance, EPR)直接检测正常的和注射庆大霉素后豚鼠耳蜗组织羟自由基含量，并比较其含量的变化. 结果 正常情况下豚鼠耳蜗组织存在一定量的羟自由基，其相对值为0.13±0.01,当体内注射庆大霉素后，耳蜗组织羟自由基含量相对值为0.28±0.00,比前者增加110%，两者比较有显著差异(P<0.05). 结论 EPR检测动物耳蜗组织自由基含量是一种直接、有效的方法，庆大霉素体内注射后可引起豚鼠耳蜗组织羟自由基含量显著增加.
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中图号:R764.43 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0748-03
Direct evidence of gentamycin induced free radicals increase in cochlea
CHEN Xian-Ming WANG Jin-Ling JIANG Hong-Yan
(Department of Otorhinolaryngology, Xijing Hospital,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
CHEN Ya-Dong
, 百拇医药
(Center of Analysis and Test,Lanzhou University
Abstract:AIM To investigate the relationship between gentamycin administration and the content of free radicals in cochlea. METHODS Electron paramagnetic resonance (EPR) was used to provide a direct measure of oxygen radical production-hydroxyl radical in guinea pig's cochlea. RESULTS Normally some amount of free radicals existed in guinea pig's cochlea, it was 0.13±0.01. After animals were、injected with gentamycin, the amount of free radicals increased significantly, it raised by 110%. CONCLUSION EPR is a efficient method to detect free radicals in guinea pig's cochlea qualitatively and quantitatively,injected with gentamycin can result in increment of hydroxyl radical in guinea pig's cochlea.
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Keywords:gentamycin; cochlea; free radicals; electron paramagnetic resonance
0 引言
氨基甙类抗生素(AmAn)引起的耳聋是临床倍受关注的问题之一，至今没有理想的防治方法. 一些证据表明自由基损伤与AmAn耳毒性有关[1-3]，用去铁胺，羟基苯甲酸、谷胱甘肽等自由基清除剂或抗氧化剂可预防或减轻AmAn引起的耳毒性[4].但也有人认为AmAn耳毒性与自由基损害关系不大，自由基清除剂也不能明显减轻庆大霉素等药物引起的耳聋[5].
AmAn的毒性机制还不明确，上述自由基损害的证据也是间接的，尚无直接证据说明AmAn能增加内耳的自由基产生. 我们采用当前检测自由基最直接、有效的电子顺磁共振法(electron paramagnetic resonance, EPR)检测了正常及注射庆大霉素后豚鼠耳蜗组织自由基的含量.
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1 材料和方法
选耳廓反射良好的花色豚鼠为实验动物，体质量250～350 g，雌雄皆用. 实验组动物硫酸庆大霉素im(200 mg.kg-1.d-1)3 d后取耳蜗进行EPR测试. 戊巴比妥钠ip(40 mg.kg-1)麻醉后，切除动物耳廓，打开听泡、充分止血，去除镫骨底板并刺破圆窗膜，用微量注射器从圆窗处向蜗内注入DMPO约20 μL(DMPO量浓度为100 mmol.L-1). 5 min后迅速取下听泡，剔除蜗壳，将蜗轴连同膜蜗管取下，加3倍体积Hank液(含DMPO 100 mmol.L-1)在离心管内用玻璃捧将上述组织研碎制成匀浆，组织匀浆静置片刻取上部组织悬液进行EPR分析.
正常对照组实验前不注射庆大霉素，标本制备方法同上. 空白对照组为Hank液，含DMPO100 mmol.L-1，无组织成分. 标准测试液含15 mL.L-1 H2O2, 50 μmol.L-1 FeSO4(pH 7.4)和50 mmol.L-1 DMPO，以此液测出的EPR信号作为参照. DMPO购自Sigma公司，经活性碳处理去杂质，并经滤膜过滤后，置-20℃环境避光贮存备用[6].
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EPR测试方法：取上述组织悬液约50 μL，注入细玻璃管内，放入EPR测试腔. 仪器为ER200D-SRC型EPR波谱仪(德国Bruker). X-波段，常温下测试，微波频率9.78 GHz，微波功率30 mW、调频100 kHz、调幅1 Gs，扫描时间200 s、扫描次数10次、所得信号经计算机分析处理. 放大倍数10×105.
以EPR波谱第二峰的高度作为自由基含量的相对值，所得结果经t检验.
2 结果
2.1 EPR波谱 在15 mL.L-1 H2O2与50 μmol.L-1 FeSO4的混合液中加入50 mmol.L-1 DMPO,EPR波谱仪检测出现典型的4个峰组成的超精细分裂峰(Fig 1A)，峰强度比为1∶2∶2∶1，超精细分裂常数为aN=aH=14.9 G，正常对照组耳蜗组织悬液的EPR波谱也出现与第一条谱线形状相同的4个峰谱线，只是其峰的高度呈比例的降低. 基线也没有第一条谱线平整(Fig 1B). 实验组EPR峰明显增强，其谱线中除4个主峰外也同样出现一些峰值较低的杂乱波(Fig 1C). 而无组织成分的空白对照液中，未测出有特征性的信号峰(Fig 1D).
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2.2 自由基相对含量 测量标准液波谱的第二峰的高度，并以此为标准(其值定为1)，测其他几组成分峰值的相对高度，以此表示自由基含量的相对值. 结果正常组耳蜗组织悬液自由基相对含量为0.13±0.01(n=6)，实验组耳蜗组织悬液自由基相对含量为0.28±0.00(n=6). 结果经t检验，实验组自由基含量显著高于正常组(P<0.05).
图 1 各组标本EPR波谱
Fig 1 EPR spectra in different specimen
A. Typical spectra of DMPO-OH adduct； B. EPR signals in normal guinea pig's cochlea； C. EPR signals after animals were injected with gentamycin ； D. Cell-free solution.
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3 讨论
AmAn引起耳聋的机制一直不明确，有人发现抗氧化剂可减轻庆大霉素的耳毒性[4]，但尚无直接证据表明庆大霉素可引起耳蜗自由基含量增加. 正常生物细胞代谢过程中不断有少量自由基产生，但难以直接检测. DMPO能与氧族自由基羟基(OH·) 形成较稳定的加合物DMPO-OH，经EPR测试可表现为具有4个峰，强度比为1∶2∶2∶1，超精细分裂常数为aN=aH＝14.9 G的典型谱线，本实验中H2O2与FeSO4体系中加入DMPO所生成的谱线即为这一形状，是因H2O2在Fe2+催化下经Fenton反应生成的OH·被DMPO捕捉的结果.
正常豚鼠耳蜗组织也可测出较弱的上述形状信号峰，可能是因组织细胞在正常情况下产生少量羟基. 当动物注射硫酸庆大霉素后，EPR峰明显增强，说明用药后豚鼠耳蜗组织自由基产生增加.
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据研究，氨基甙类抗生素在耳蜗毛细胞的积聚部位主要是线粒体[7]，有研究发现，庆大霉素可使动物耳蜗组织细胞线粒体肿胀，嵴减少甚至空化[8]. 线粒体是细胞能量代谢、蛋白合成的主要部位. 线粒体功能障碍，可能影响自由基代谢相关酶的合成和活性，同时电子传递链中也可能有更多电子溢出. 自由基的生成增加和代谢障碍，将使耳蜗毛细胞受损.
但自由基损害在AmAn引起耳聋的过程中所起作用的程度还不很清楚，是自由基直接导致耳蜗毛细胞脂质、蛋白质或核酸的氧化损害，还是自由基水平的升高作为一种启动因子，启动了毛细胞进一步损害的另一病理过程？目前还不清楚，尚需进一步研究.
作者简介:陈贤明(1964-)，男(汉族)，安徽省滁州市人. 博士生(导师王锦玲)，医师. Tel.(029)3375386(H)
参考文献：
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[1] Pierson MG,Moller AR. Prephylaxis of kanamycin-induced ototoxicity by a radiopretectant[J]. Hear Res, 1981;4(1):79-87.
[2] Song BB,Anderson DJ, Schacht J. Protection from gentamycin ototoxicity by iron helators in guinea pig in vivo[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1997;282(1):369-377.
[3] 陈文弦，成诗银，王多宁et al.自由基在卡那霉素内耳中毒中的作用[J]. 第四军医大学学报,1996;17(1):8-10.
[4] Garetz SL,Altschuler RA,Schacht J. Attenuation of gentamycin ototoxicity by lutathione in the guinea pig in vivo[J]. Hear Res,1994;77(1):81-87.
, http://www.100md.com
[5] Book GR, Yates GK, Miller JJ et al. Effects of N-acetylcysteine on kanamycin totoxicity in the guinea pig[J]. Hear Res, 1983;9(2):255-262.
[6] Buettner GR,Oberley LW.Considerations in the spin trapping of supperoxide and ydroxyl radical in aqueous systems using DMPO[J]. Biochem Biophys Res Commun,1978;83(1):69-74.
[7] 丁大连. 卡那霉素在耳蜗毛细胞中的积聚部位[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志， 1997;32(6):348-351.
[8] 陈 阳，王锦玲，黄维国et al. 甲磺酸去铁受抗庆大霉素耳毒性作用及机制研究[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志，1999;32(3):154-156.
收稿日期:1999-09-03
修回日期:1999-12-18, 百拇医药