微波诱导视网膜神经细胞凋亡及硒的保护作用
作者：刘学东 龚书明 杨瑞华 陈景元 邓中荣 刘秀红
单位：刘学东(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；龚书明(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；杨瑞华(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；陈景元(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；邓中荣(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；刘秀红(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033).
关键词：微波；硒；视网膜；细胞凋亡；激光共聚焦显微镜
第四军医大学学报000617 摘要: 目的 观察微波诱导视网膜神经细胞凋亡及硒的保护作用. 方法 体外培养视网膜神经细胞，按微波辐照强度分为4组辐照1 h. 选30 mW.cm-2组为防护组，在培养液中加入Na2SeO3后辐照. 照后测培养液温度、细胞存活率，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡并进行荧光强度的定量分析. 结果 培养液温度、细胞凋亡数量及荧光强度随微波辐照强度增大而增加. 加Na2SeO3后辐照可使凋亡细胞数量减少，荧光强度减弱. 结论 微波可诱导视网膜神经细胞凋亡，Na2SeO3对此有保护作用.
, 百拇医药
中图号：R135.92 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0702-03
Apoptosis of retina nervous cells induced by microwave and the protective effects of selenium
LIU Xue-Dong GONG Shu-Ming YANG Rui-Hua CHEN Jing-Yuan DENG Zhong-Rong LIU Xiu-Hong
(Department of Military Hygiene, Faculty of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
, 百拇医药
Abstract:AIM To observe apoptosis of retina nervous cells induced by microwave and the protective effects of selenium. METHODS Retina nervous cells were cultured in vitro, divided into 4 groups according to microwave intensity and then exposed to microwave for 1 hour. The cells of 30 mW.cm-2 chosen as protective group were exposed to microwave after Na2SeO3 being added to cultured fluid. The temperature of cultured fluid and the survival rate of cells were measured. Apoptosis was observed under laser scanning confocal microscope, and the quantitative analysis of fluorescence intensity was measured.RESULTS The temperature of cultured fluid, the amount of apoptosis cells and fluorescence intensity improved with the increase of microwave intensity. The amount of apoptosis cells and the fluorescence intensity decreased after exposure to microwave with the addition of Na2SeO3 to cultured fluid. CONCLUSION Apoptosis of retina nervous cells could be induced by microwave, Na2SeO3 could prevent this effect.
, 百拇医药
Keywords:microwave; selenium; retina; apoptosis; laser confocal microscope
0 引言
近年来，随着微波技术在各个领域的广泛应用，微波的生物学效应越来越引起人们关注. 眼睛是微波作用的重要靶器官，但微波对眼损伤的研究多集中于晶体，而对视网膜损伤的报道较少[1]. 我们采用激光共聚焦显微镜观察了2450 MHz微波诱发体外培养视网膜神经细胞的凋亡作用，并观察了Na2SeO3对细胞凋亡的保护作用，为探讨微波对视网膜的损伤及防护提供一定的依据.
1 材料和方法
1.1 细胞培养 猪眼球取自屠宰场，宰杀后立即摘取眼球，剪除周围多余的组织，清水充分洗涤，200 u的庆大霉素浸泡20 min，移入超净台，用Takahashi法[2]培养视网膜神经细胞.
, 百拇医药
1.2 辐照条件与实验分组 辐射源为上海微波医疗仪器厂生产的微波理疗机，频率2450 MHz，连续波 ，微波屏蔽室内辐照. 气温23℃～25℃，相对湿度30%～40%. 按微波强度分为对照组、10 mW.cm-2组、30 mW.cm-2组和60 mW.cm-2组，辐照时间为1 h，选30 mW.cm-2组作为防护实验组，在培养液中加入1 mmol.L-1的Na2SeO3. 培养瓶中均加入等量培养液.
1.3 指标测定 ①7151型半导体温度计测定培养液温度. ②显微镜下观察细胞形态的改变. ③台盼蓝染色检测细胞存活率. ④激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡: 微波辐照后，收集细胞，PBS漂洗2～3次，生理盐水调整细胞密度为1×107 mL-1的细胞悬液，将细胞涂于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，吹干，用新配制的40 g.L-1多聚甲醛室温下固定30 min，宝灵曼公司生产的细胞凋亡原位检测试剂盒进行检测，Bio-Rad MRC-1024激光共聚焦显微镜观察，每张玻片选取3个视野进行荧光强度的定量分析，结果以灰度值表示.
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2 结果
2.1 细胞培养 12～24 h后，部分细胞贴壁，细胞呈圆形或椭圆形，体积较小，核圆且相对透明，细胞分散存在，部分细胞伸出轴突.
2.2 微波辐照后培养液温度的变化 对照组培养液温度为(23.8±0.4)℃，10 mW.cm-2组为(24.1±0.3)℃，30 mW.cm-2组为(29.3±0.4)℃，60 mW.cm-2组为(33.6±0.3)℃，除10 mW.cm-2组与对照组间无显著性差异外，其余各组与对照组间均有显著性差异. 加硒组温度为(28.8±0.4)℃，与30 mW.cm-2组相比无显著性差异.
2.3 细胞形态观察 10 mW.cm-2组细胞部分聚集成团，边缘较模糊，30 mW.cm-2组成团细胞较多，部分细胞脱壁，细胞碎片增多，60 mW.cm-2组正常细胞明显减少，可见大量呈碎片状细胞.
, 百拇医药
2.4 细胞存活率 对照组细胞存活率为(99.8±1.3)%，10 mW.cm-2组为(99.2±0.9)%，与对照组相比无显著性差异，30 mW.cm-2组与60 mW.cm-2组分别为(88.9±3.4)%和(65.6±2.9)%，细胞存活率明显降低(P<0.05). 加硒组细胞存活率为(92.8±4.1)%，与30 mW.cm-2组相比无显著性差异(P>0.05). 染料排斥阴性说明这些细胞仍为存活细胞或程序性死亡细胞.
2.5 激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡 微波辐照10 mW.cm-2 组细胞，加TUNEL反应液后，激光共聚焦显微镜下可见黄绿色荧光，染色质密度增高，并凝聚于核膜周围，即为凋亡的视网膜神经细胞(Fig 1)，但凋亡细胞数量很少. 随着微波辐照强度的增加，凋亡细胞明显增加(Fig 2, 3). 加硒后进行微波辐照，可见凋亡细胞数量明显减少(Fig 4). 荧光强度分析可见，10 mW.cm-2 组荧光强度在 20～40 之间， 30 mW.cm-2 组荧光强度在70～75之间，60 mW.cm-2组荧光强度在70～110范围内波动，荧光强度随着微波辐照强度的增大而增加. 加硒组荧光强度为20～40之间，明显低于未加硒组.
, 百拇医药
图 1 10 mW.cm-2组的凋亡细胞
Fig 1 Apoptosis cells of 10 mW.cm-2 group ×1000
图 2 30 mW.cm-2组的凋亡细胞
Fig 2 Apoptosis cells of 30 mW.cm-2 group ×1000
图 3 60 mW.cm-2组的凋亡细胞
, 百拇医药
Fig 3 Apoptosis cells of 60 mW.cm-2 group ×1000
图 4 加硒组的凋亡细胞
Fig 4 Apoptosis cells of the adding selenium group ×1000
3 讨论
视网膜位于眼球壁最内层，主要功能是接受外界刺激，通过光化学作用转化为生理刺激，传到视觉中枢而产生视觉. 目前，微波对视网膜损伤的报道较少，有学者用微波诱导眼内短时高温,4 wk后进行病理检查,发现43 ℃时,可见视网膜色素上皮细胞及视网膜外节的损伤,色素颗粒移行,45 ℃可见视网膜结构的破坏,细胞萎缩,47℃可见明显的胶质反应[3]. 我们在本实验中以视网膜神经细胞为研究对象，观察了微波诱发细胞凋亡作用，用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，具有较高的灵敏度，而激光共聚焦显微镜具有很高的分辨率，图像清晰，并可排除焦点以外的荧光干扰，而且可在毫不损失分辨率的情况下测定标本的荧光强度，两者结合使用，可使实验数据更充分可靠，本实验结果目前尚未见文献报道. 研究表明，10 mW.cm-2微波辐照后即可见凋亡的视网膜神经细胞，30 mW.cm-2及60 mW.cm-2微波辐照后，培养液温度明显升高，细胞存活率下降，凋亡细胞数量明显增多，荧光强度增大，变化程度随微波辐照强度增大而增加. 可见，在本实验条件下，微波辐照可诱发视网膜神经细胞凋亡，凋亡细胞数量随微波辐照强度增大而增加. 微波可引起体内的氧化和抗氧化系统失衡[4]，而氧化产生的自由基可引发细胞凋亡[5]，因而微波诱发细胞凋亡可能与自由基产生过多有关. 硒作为人体必需的微量元素之一，参与GSH-Px的合成，具有抗氧化损伤作用. 机体缺硒可明显降低抗氧化能力，而适当的补硒可提高机体的抗氧化能力. 研究表明，微量亚硒酸钠与晶体上皮细胞孵育可减轻羟自由基对细胞的DNA损伤，提高细胞的抗氧化能力[6]. 硒还对电离辐射诱发的中国仓鼠卵巢细胞凋亡具有拮抗作用，其机制可能是通过清除电离辐射产生的活性氧而抑制细胞凋亡[7]. 本实验结果表明，培养液加硒后辐照，凋亡细胞数量明显减少，荧光强度减弱. 因而硒可能是一种有效的抑制自由基和ROS所诱发细胞凋亡的抑制剂，在微波对视网膜损伤的防护中具有潜在的应用价值.
, http://www.100md.com
作者简介：刘学东(1971- )，男(汉族)，河北省涿州市人. 硕士(导师龚书明)，助教. Tel.(029)3374866 Email.deoh26@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 刘学东.微波对眼的辐射损伤[综述][J]. 眼外伤与职业性眼病杂志, 1999;21(1):77-78.
[2] Takahashi N, Cummins D, Caprioli J. Rat retinal ganglion cells in culture[J]. Exp Eye Res, 1991;53(5):565-572.
[3] Bhatt N,Peyman GA, Khoobehi B et al. Microwave-induced retinal destruction with sparing of sclera and choriocapillaris[J]. Opthalmic Surg, 1993; 24(2):125-128.
, 百拇医药
[4] Babhincova M. Microwave-induced lipid peroxidation in liposomes[J]. Folia Biol Praha, 1993;39(5):250-255.
[5] Greenlund LJ, Deckwerth TL,Johnson EM. Superoxide dismutase delays neuronal apoptosis:A role for reactive oxygen species in programmed neuronal death[J]. Neuron, 1995;14(2):303-315.
[6] 秦 虹，赵光喜，吴惠群. 过氧化氢致大鼠晶体上皮细胞DNA损伤与修复的研究[J]. 中华眼科杂志，1996;32(6):453-456.
[7] 孙 娟，陈 瑗，周 玫 et al. Ebselen对电离辐射诱发的细胞凋亡的影响[J]. 第一军医大学学报，1996;16(3):195-196.
收稿日期：1999-10-21
修回日期：1999-12-02, 百拇医药
单位：刘学东(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；龚书明(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；杨瑞华(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；陈景元(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；邓中荣(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033)；刘秀红(第四军医大学预防医学系军队卫生学教研室，陕西 西安 710033).
关键词：微波；硒；视网膜；细胞凋亡；激光共聚焦显微镜
第四军医大学学报000617 摘要: 目的 观察微波诱导视网膜神经细胞凋亡及硒的保护作用. 方法 体外培养视网膜神经细胞，按微波辐照强度分为4组辐照1 h. 选30 mW.cm-2组为防护组，在培养液中加入Na2SeO3后辐照. 照后测培养液温度、细胞存活率，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡并进行荧光强度的定量分析. 结果 培养液温度、细胞凋亡数量及荧光强度随微波辐照强度增大而增加. 加Na2SeO3后辐照可使凋亡细胞数量减少，荧光强度减弱. 结论 微波可诱导视网膜神经细胞凋亡，Na2SeO3对此有保护作用.
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中图号：R135.92 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0702-03
Apoptosis of retina nervous cells induced by microwave and the protective effects of selenium
LIU Xue-Dong GONG Shu-Ming YANG Rui-Hua CHEN Jing-Yuan DENG Zhong-Rong LIU Xiu-Hong
(Department of Military Hygiene, Faculty of Preventive Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
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Abstract:AIM To observe apoptosis of retina nervous cells induced by microwave and the protective effects of selenium. METHODS Retina nervous cells were cultured in vitro, divided into 4 groups according to microwave intensity and then exposed to microwave for 1 hour. The cells of 30 mW.cm-2 chosen as protective group were exposed to microwave after Na2SeO3 being added to cultured fluid. The temperature of cultured fluid and the survival rate of cells were measured. Apoptosis was observed under laser scanning confocal microscope, and the quantitative analysis of fluorescence intensity was measured.RESULTS The temperature of cultured fluid, the amount of apoptosis cells and fluorescence intensity improved with the increase of microwave intensity. The amount of apoptosis cells and the fluorescence intensity decreased after exposure to microwave with the addition of Na2SeO3 to cultured fluid. CONCLUSION Apoptosis of retina nervous cells could be induced by microwave, Na2SeO3 could prevent this effect.
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Keywords:microwave; selenium; retina; apoptosis; laser confocal microscope
0 引言
近年来，随着微波技术在各个领域的广泛应用，微波的生物学效应越来越引起人们关注. 眼睛是微波作用的重要靶器官，但微波对眼损伤的研究多集中于晶体，而对视网膜损伤的报道较少[1]. 我们采用激光共聚焦显微镜观察了2450 MHz微波诱发体外培养视网膜神经细胞的凋亡作用，并观察了Na2SeO3对细胞凋亡的保护作用，为探讨微波对视网膜的损伤及防护提供一定的依据.
1 材料和方法
1.1 细胞培养 猪眼球取自屠宰场，宰杀后立即摘取眼球，剪除周围多余的组织，清水充分洗涤，200 u的庆大霉素浸泡20 min，移入超净台，用Takahashi法[2]培养视网膜神经细胞.
, 百拇医药
1.2 辐照条件与实验分组 辐射源为上海微波医疗仪器厂生产的微波理疗机，频率2450 MHz，连续波 ，微波屏蔽室内辐照. 气温23℃～25℃，相对湿度30%～40%. 按微波强度分为对照组、10 mW.cm-2组、30 mW.cm-2组和60 mW.cm-2组，辐照时间为1 h，选30 mW.cm-2组作为防护实验组，在培养液中加入1 mmol.L-1的Na2SeO3. 培养瓶中均加入等量培养液.
1.3 指标测定 ①7151型半导体温度计测定培养液温度. ②显微镜下观察细胞形态的改变. ③台盼蓝染色检测细胞存活率. ④激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡: 微波辐照后，收集细胞，PBS漂洗2～3次，生理盐水调整细胞密度为1×107 mL-1的细胞悬液，将细胞涂于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，吹干，用新配制的40 g.L-1多聚甲醛室温下固定30 min，宝灵曼公司生产的细胞凋亡原位检测试剂盒进行检测，Bio-Rad MRC-1024激光共聚焦显微镜观察，每张玻片选取3个视野进行荧光强度的定量分析，结果以灰度值表示.
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 细胞培养 12～24 h后，部分细胞贴壁，细胞呈圆形或椭圆形，体积较小，核圆且相对透明，细胞分散存在，部分细胞伸出轴突.
2.2 微波辐照后培养液温度的变化 对照组培养液温度为(23.8±0.4)℃，10 mW.cm-2组为(24.1±0.3)℃，30 mW.cm-2组为(29.3±0.4)℃，60 mW.cm-2组为(33.6±0.3)℃，除10 mW.cm-2组与对照组间无显著性差异外，其余各组与对照组间均有显著性差异. 加硒组温度为(28.8±0.4)℃，与30 mW.cm-2组相比无显著性差异.
2.3 细胞形态观察 10 mW.cm-2组细胞部分聚集成团，边缘较模糊，30 mW.cm-2组成团细胞较多，部分细胞脱壁，细胞碎片增多，60 mW.cm-2组正常细胞明显减少，可见大量呈碎片状细胞.
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2.4 细胞存活率 对照组细胞存活率为(99.8±1.3)%，10 mW.cm-2组为(99.2±0.9)%，与对照组相比无显著性差异，30 mW.cm-2组与60 mW.cm-2组分别为(88.9±3.4)%和(65.6±2.9)%，细胞存活率明显降低(P<0.05). 加硒组细胞存活率为(92.8±4.1)%，与30 mW.cm-2组相比无显著性差异(P>0.05). 染料排斥阴性说明这些细胞仍为存活细胞或程序性死亡细胞.
2.5 激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡 微波辐照10 mW.cm-2 组细胞，加TUNEL反应液后，激光共聚焦显微镜下可见黄绿色荧光，染色质密度增高，并凝聚于核膜周围，即为凋亡的视网膜神经细胞(Fig 1)，但凋亡细胞数量很少. 随着微波辐照强度的增加，凋亡细胞明显增加(Fig 2, 3). 加硒后进行微波辐照，可见凋亡细胞数量明显减少(Fig 4). 荧光强度分析可见，10 mW.cm-2 组荧光强度在 20～40 之间， 30 mW.cm-2 组荧光强度在70～75之间，60 mW.cm-2组荧光强度在70～110范围内波动，荧光强度随着微波辐照强度的增大而增加. 加硒组荧光强度为20～40之间，明显低于未加硒组.
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图 1 10 mW.cm-2组的凋亡细胞
Fig 1 Apoptosis cells of 10 mW.cm-2 group ×1000
图 2 30 mW.cm-2组的凋亡细胞
Fig 2 Apoptosis cells of 30 mW.cm-2 group ×1000
图 3 60 mW.cm-2组的凋亡细胞
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Fig 3 Apoptosis cells of 60 mW.cm-2 group ×1000
图 4 加硒组的凋亡细胞
Fig 4 Apoptosis cells of the adding selenium group ×1000
3 讨论
视网膜位于眼球壁最内层，主要功能是接受外界刺激，通过光化学作用转化为生理刺激，传到视觉中枢而产生视觉. 目前，微波对视网膜损伤的报道较少，有学者用微波诱导眼内短时高温,4 wk后进行病理检查,发现43 ℃时,可见视网膜色素上皮细胞及视网膜外节的损伤,色素颗粒移行,45 ℃可见视网膜结构的破坏,细胞萎缩,47℃可见明显的胶质反应[3]. 我们在本实验中以视网膜神经细胞为研究对象，观察了微波诱发细胞凋亡作用，用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，具有较高的灵敏度，而激光共聚焦显微镜具有很高的分辨率，图像清晰，并可排除焦点以外的荧光干扰，而且可在毫不损失分辨率的情况下测定标本的荧光强度，两者结合使用，可使实验数据更充分可靠，本实验结果目前尚未见文献报道. 研究表明，10 mW.cm-2微波辐照后即可见凋亡的视网膜神经细胞，30 mW.cm-2及60 mW.cm-2微波辐照后，培养液温度明显升高，细胞存活率下降，凋亡细胞数量明显增多，荧光强度增大，变化程度随微波辐照强度增大而增加. 可见，在本实验条件下，微波辐照可诱发视网膜神经细胞凋亡，凋亡细胞数量随微波辐照强度增大而增加. 微波可引起体内的氧化和抗氧化系统失衡[4]，而氧化产生的自由基可引发细胞凋亡[5]，因而微波诱发细胞凋亡可能与自由基产生过多有关. 硒作为人体必需的微量元素之一，参与GSH-Px的合成，具有抗氧化损伤作用. 机体缺硒可明显降低抗氧化能力，而适当的补硒可提高机体的抗氧化能力. 研究表明，微量亚硒酸钠与晶体上皮细胞孵育可减轻羟自由基对细胞的DNA损伤，提高细胞的抗氧化能力[6]. 硒还对电离辐射诱发的中国仓鼠卵巢细胞凋亡具有拮抗作用，其机制可能是通过清除电离辐射产生的活性氧而抑制细胞凋亡[7]. 本实验结果表明，培养液加硒后辐照，凋亡细胞数量明显减少，荧光强度减弱. 因而硒可能是一种有效的抑制自由基和ROS所诱发细胞凋亡的抑制剂，在微波对视网膜损伤的防护中具有潜在的应用价值.
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作者简介：刘学东(1971- )，男(汉族)，河北省涿州市人. 硕士(导师龚书明)，助教. Tel.(029)3374866 Email.deoh26@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 刘学东.微波对眼的辐射损伤[综述][J]. 眼外伤与职业性眼病杂志, 1999;21(1):77-78.
[2] Takahashi N, Cummins D, Caprioli J. Rat retinal ganglion cells in culture[J]. Exp Eye Res, 1991;53(5):565-572.
[3] Bhatt N,Peyman GA, Khoobehi B et al. Microwave-induced retinal destruction with sparing of sclera and choriocapillaris[J]. Opthalmic Surg, 1993; 24(2):125-128.
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[4] Babhincova M. Microwave-induced lipid peroxidation in liposomes[J]. Folia Biol Praha, 1993;39(5):250-255.
[5] Greenlund LJ, Deckwerth TL,Johnson EM. Superoxide dismutase delays neuronal apoptosis:A role for reactive oxygen species in programmed neuronal death[J]. Neuron, 1995;14(2):303-315.
[6] 秦 虹，赵光喜，吴惠群. 过氧化氢致大鼠晶体上皮细胞DNA损伤与修复的研究[J]. 中华眼科杂志，1996;32(6):453-456.
[7] 孙 娟，陈 瑗，周 玫 et al. Ebselen对电离辐射诱发的细胞凋亡的影响[J]. 第一军医大学学报，1996;16(3):195-196.
收稿日期：1999-10-21
修回日期：1999-12-02, 百拇医药