体外循环肺损伤中c-fos的作用
作者：王辉山 易定华 汪曾炜
单位：王辉山(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；汪曾炜(沈阳军区总医院心血管外科)
关键词：缺血再灌注损伤；肺损伤；原癌基因；基因表达
第四军医大学学报000660 中图号：R541.1 文献标识码：B
文章编号：1000-2790(2000)06-封3-01
0 引言
我们通过兔体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)模型，应用斑点杂交的方法，对CPB后肺组织原癌基因c-fos mRNA的改变进行研究，从分子水平探讨c-fos的改变在CPB所致肺损伤中的意义.
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1 材料和方法
1.1 材料 健康家兔12只，雄雌不拘，由本校实验动物研究中心提供. 体质量2.5～3.5 kg，随机平分为对照和CPB两组.
1.2 方法 实验兔术前禁食水6 h. 采用戊巴比妥钠35 mg*kg-1腹腔注射，气管切开插管，小动物呼吸机辅助呼吸，股动脉插管测压. 胸骨正中开胸，3 mg*kg-1肝素化后，分别于右颈总动脉，右心房和左心房插入动脉泵管，腔静脉和作心房引流，连接小型CPB机. 采用体外循环温度为28～32℃. 中度血液稀释(HCT：0.20～0.24)，流量为(70～110)mL/(kg*min-1)，平均动脉压维持在8～12 kPa. 总转流时间为120 min，其中主动脉和肺动脉阻断60 min，心脏复跳，辅助循环60 min. 手术对照组动物单纯开胸，120 min后留取组织标本. 制备感受态细胞后，细菌转化并行质粒提取，pSP65 c-fos cDNA质粒，制备由Roche分子生物研究所Curran Tom教授惠赠，插入片段2.116 kb[1]. 使用碱裂解法取得c-fos质粒DNA，用EcoR I/BamH I进行酶切. 经电泳获得2.1 kb插入片段. 采用异硫氰酸胍法提取总RNA[2]. 取肺组织 称重200 mg，加入变性液2 mL匀浆(0～4℃)，震荡10 s，0～4℃ 15 min，离心(16 000 g, 20 min 4℃)，取水相加2.0 mL异丙醇，-20℃ 1 h，离心 16 000 g. 20 min 4℃，取沉淀+0.6 mL 变性液及0.8 mL异丙醇(0.8 mL)，-20℃ 1 h，离心16 000 g 10 min 4℃，取沉淀+750 mL*L-1乙醇 50～100 μL(覆盖沉淀)，震荡10 s，沉淀，真空干燥，溶入无RNase酶水中(定量)，RNA电泳. 紫外分光光度计定量，分别测定A260及A280值. 膜制备后，预杂交，杂交以切口平移法标记探针，切口平移系统购自华美公司. 洗膜，自动洗片机洗片. 杂交显影之X片由GQS-960型基因定量扫描分析系统计算各样本灰度值. 统计学处理，各样本所测之灰度值作为mRNA表达的相对值，进行t检验，P<0.05为差异显著.
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2 结果
总RNA提取：A260/A280>1.7 ，c-fos mRNA表达的改变(图 1). CPB组c-fos mRNA灰度值(19.45±0.19)明显高于对照组(7.51±0.09，P<0.01).
图 1 CPB后肺组织c-fos mRNA表达(斑点杂交)
3 讨论
原癌基因c-fos是多基因家族的成员之一. 由于该家族基因在应激后诱导表达迅速，又被称为立即早期基因(immediate early gene,IEG)[3-5]. 我们采用兔CPB模型，对肺的c-fos mRNA的表达进行研究，发现c-fos mRNA在CPB后表达明显增加. 我们的研究已经证实，CPB期间，肺经历了缺血、缺氧损害[6]，因此推测，CPB后c-fos mRNA表达的增高可能是肺在缺血再灌注后，内皮细胞、上皮细胞损害，引起钙离子的改变，诱导了c-fos的表达，而氧自由基的损害及cGMP等第二信使的变化则进一步诱导了c-fos的表达. 对CPB引起肺损伤中c-fos mRNA表达的研究结果表明，c-fos mRNA表达上调. 这可能是CPB中肺缺血再灌注所致，并推测c-fos可能是肺损伤的一个敏感指标.
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参考文献：
[1] Curran T, Gordon MB, Rubino KL et al. Isolation and characterization of Fos and Jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes[J]. J Biol Chem, 1993;268(8)：16852-16860.
[2] Chomxynske P, Sacchi N,Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987; 162(11)：156-161.
[3] Das DK, Manlik N, Morau II. Gene expression in acute myocardial stress, induction by hypoxia, ischemia, reperfusion, hyperthermia and oxidative stress[J]. J Mol Cell Cardial, 1995;27(9)：181-190.
, 百拇医药
[4] Andres J, Sharma HS, Knoll R, et al. Expression of heat shock proteins in the normal and stunned myocardium[J]. Cardiovasc Res, 1993; 27(10)：1421-1426.
[5] Brand H, Sharma HS, Fleischmann KE et al. Proto-oncogene expression in porcine myocardium subjected to ischemia and reperfusion[J]. Circ Res, 1992;71(11)：1351-1362.
[6] 王辉山, 易定华, 汪曾炜. 左精氨酸对体外循环肺损伤的保护作用[J]. 第四军医大学报,1998；19(4)：429-431., 百拇医药
单位：王辉山(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；易定华(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；汪曾炜(沈阳军区总医院心血管外科)
关键词：缺血再灌注损伤；肺损伤；原癌基因；基因表达
第四军医大学学报000660 中图号：R541.1 文献标识码：B
文章编号：1000-2790(2000)06-封3-01
0 引言
我们通过兔体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)模型，应用斑点杂交的方法，对CPB后肺组织原癌基因c-fos mRNA的改变进行研究，从分子水平探讨c-fos的改变在CPB所致肺损伤中的意义.
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1 材料和方法
1.1 材料 健康家兔12只，雄雌不拘，由本校实验动物研究中心提供. 体质量2.5～3.5 kg，随机平分为对照和CPB两组.
1.2 方法 实验兔术前禁食水6 h. 采用戊巴比妥钠35 mg*kg-1腹腔注射，气管切开插管，小动物呼吸机辅助呼吸，股动脉插管测压. 胸骨正中开胸，3 mg*kg-1肝素化后，分别于右颈总动脉，右心房和左心房插入动脉泵管，腔静脉和作心房引流，连接小型CPB机. 采用体外循环温度为28～32℃. 中度血液稀释(HCT：0.20～0.24)，流量为(70～110)mL/(kg*min-1)，平均动脉压维持在8～12 kPa. 总转流时间为120 min，其中主动脉和肺动脉阻断60 min，心脏复跳，辅助循环60 min. 手术对照组动物单纯开胸，120 min后留取组织标本. 制备感受态细胞后，细菌转化并行质粒提取，pSP65 c-fos cDNA质粒，制备由Roche分子生物研究所Curran Tom教授惠赠，插入片段2.116 kb[1]. 使用碱裂解法取得c-fos质粒DNA，用EcoR I/BamH I进行酶切. 经电泳获得2.1 kb插入片段. 采用异硫氰酸胍法提取总RNA[2]. 取肺组织 称重200 mg，加入变性液2 mL匀浆(0～4℃)，震荡10 s，0～4℃ 15 min，离心(16 000 g, 20 min 4℃)，取水相加2.0 mL异丙醇，-20℃ 1 h，离心 16 000 g. 20 min 4℃，取沉淀+0.6 mL 变性液及0.8 mL异丙醇(0.8 mL)，-20℃ 1 h，离心16 000 g 10 min 4℃，取沉淀+750 mL*L-1乙醇 50～100 μL(覆盖沉淀)，震荡10 s，沉淀，真空干燥，溶入无RNase酶水中(定量)，RNA电泳. 紫外分光光度计定量，分别测定A260及A280值. 膜制备后，预杂交，杂交以切口平移法标记探针，切口平移系统购自华美公司. 洗膜，自动洗片机洗片. 杂交显影之X片由GQS-960型基因定量扫描分析系统计算各样本灰度值. 统计学处理，各样本所测之灰度值作为mRNA表达的相对值，进行t检验，P<0.05为差异显著.
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2 结果
总RNA提取：A260/A280>1.7 ，c-fos mRNA表达的改变(图 1). CPB组c-fos mRNA灰度值(19.45±0.19)明显高于对照组(7.51±0.09，P<0.01).
图 1 CPB后肺组织c-fos mRNA表达(斑点杂交)
3 讨论
原癌基因c-fos是多基因家族的成员之一. 由于该家族基因在应激后诱导表达迅速，又被称为立即早期基因(immediate early gene,IEG)[3-5]. 我们采用兔CPB模型，对肺的c-fos mRNA的表达进行研究，发现c-fos mRNA在CPB后表达明显增加. 我们的研究已经证实，CPB期间，肺经历了缺血、缺氧损害[6]，因此推测，CPB后c-fos mRNA表达的增高可能是肺在缺血再灌注后，内皮细胞、上皮细胞损害，引起钙离子的改变，诱导了c-fos的表达，而氧自由基的损害及cGMP等第二信使的变化则进一步诱导了c-fos的表达. 对CPB引起肺损伤中c-fos mRNA表达的研究结果表明，c-fos mRNA表达上调. 这可能是CPB中肺缺血再灌注所致，并推测c-fos可能是肺损伤的一个敏感指标.
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参考文献：
[1] Curran T, Gordon MB, Rubino KL et al. Isolation and characterization of Fos and Jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes[J]. J Biol Chem, 1993;268(8)：16852-16860.
[2] Chomxynske P, Sacchi N,Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J]. Anal Biochem, 1987; 162(11)：156-161.
[3] Das DK, Manlik N, Morau II. Gene expression in acute myocardial stress, induction by hypoxia, ischemia, reperfusion, hyperthermia and oxidative stress[J]. J Mol Cell Cardial, 1995;27(9)：181-190.
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[4] Andres J, Sharma HS, Knoll R, et al. Expression of heat shock proteins in the normal and stunned myocardium[J]. Cardiovasc Res, 1993; 27(10)：1421-1426.
[5] Brand H, Sharma HS, Fleischmann KE et al. Proto-oncogene expression in porcine myocardium subjected to ischemia and reperfusion[J]. Circ Res, 1992;71(11)：1351-1362.
[6] 王辉山, 易定华, 汪曾炜. 左精氨酸对体外循环肺损伤的保护作用[J]. 第四军医大学报,1998；19(4)：429-431., 百拇医药