高血压大鼠肾内一氧化氮合酶活性
作者：张珊红 吴昌归 李源 龚卫琴
单位：张珊红 李源 龚卫琴(第四军医大学西京医院老年病科)；吴昌归(第四军医大学西京医院呼吸内科,陕西 西安 710033)
关键词：高血压病；一氧化氮合酶；肾脏
第四军医大学学报001032 摘 要: 目的 观察自发性高血压大鼠肾脏内一氧化氮合酶(NOS)活性变化，以探讨高血压病的发病机制. 方法 采用3H-精氨酸转变成3H-胍氨酸方法测定NOS活性. 结果 自发性高血压大鼠(SHR)肾蛋白内神经型NOS(nNOS)活性(21.9±7.4) kBq.g-1明显低于WistarKyoto(WKY)大鼠(4.32±9.3) kBq.g-1,P<0.05. 在乙酰胆碱(Ach)刺激后，SHR肾内内皮型NOS(eNOS)活性为(67.3±14.6 )kBq.g-1，而WKY肾内eNOS则为(85.7±23.8 )kBq.g-1，SHR也显著低于WKY(P<0.05). 结论 nNOS和eNOS活性不足在高血压病的发生和发展过程中可能起一定作用.
, http://www.100md.com
中图号:R544.1 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)10-1271-02
Nitric oxide synthase activity in kidney of spontaneously hypertensive rats
ZHANG Shan-Hong，LI Yuan，GONG Wei-Qin
(Department of Gerontology, Xijing Hospital)
WU Chang-Gui
(Department of Respiratory,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
, 百拇医药
Abstract:AIM To investigate the change of activity of the nitric oxide synthase (NOS) in the kidney of spontaneously hypertensive rats and the role in the mechanism of hypertension. METHODS Activity of NOS was assayed by monitoring the convertion of 3H-arginine to 3H-citruline. RESULTS The activity of neural type of NOS (nNOS) in the kidney protein of spontaneously hypertensive rats (SHR) was much lower than that in Wistar Kyoto (WKY)(activity of nNOS: (21.9±7.4) kBq.g-1and (43.2±9.3) kBq.g-1 for SHR and WKY,respectively(P<0.05). After the stimulation by the acetylcholine(Ach)1, activity of endothelia type of NOS (eNOS) in SHR was also lower than that in WKY(activity of eNOS: (67.3±14.6) kBq.g-1 and (8.57±23.8) kBq.g-1 for SHR and WKY, respectively(P<0.05). CONCLUSION The insufficient activity of nNOS and eNOS could play important role in the genesis and development of hypertension.
, 百拇医药
Keywords: hypertension; nitric oxide synthase; kidney
0 引言
高血压病的发生与肾功能的改变密切相关. 一氧化氮(NO)作为最简单的信使分子对肾脏血流动力学和肾小管功能起重要调节作用[3]. 因此探讨高血压病个体肾脏内一氧化氮合酶(NOS)活性变化，具有重要的理论和实践意义.
1 材料和方法
1.1 材料 18 wk龄自发性高血压大鼠(SHR)和Wistar-Kyoto大鼠各16只(购自中国医学科学院实验动物中心),SHR和WKY各分成两组即常规组和乙酰胆碱(Ach)处理组，每组8只，雌雄数目平衡.大鼠以ip戊巴比妥钠(40 mg*kg-1)麻醉后，切开腹壁，右肾动脉插管.在常规组先经导管输注Kreb's缓冲液1.0 mL (37℃,充入950 mL*L-1O2/50 mL*L-1CO2混合气体)，5 min注完；而在Ach组则先经导管输注1.0 mL 含Ach的Kreb's缓冲液(37℃,含10-5 mol*L-1 Ach,充入950 mL*L-1O2/50 mL*L-1CO2混合气体),5 min注完. 紧接着两组动物均经导管灌注4℃生理盐水15 mL(期间切开肾静脉)，然后切取肾组织，按1∶3比例加入50 mmol*L-1 Tris-HCl[pH 7.4,含1 mmol*L-1 EGTA,1 mmol*L-1苯甲基磺酸氟(PMSF),1 μmol*L-1抑胃肽A和2 μmol*L-1亮抑蛋白酶肽]，在4℃下匀浆2次，每次5 s，以1 000 000 g离心60 min(4℃),收集可溶液性部分，加入100 mL*L-1甘油，-80℃保存. 沉淀部分以50 mmol*L-1Tris-HCl 5 mL (pH 7.4,含1.0 mmol*L-1 EGTA,1 mmol*L-1PMSF,1 μmol*L-1抑胃肽A,2 μmol*L-1亮抑蛋白酶肽，100 mL*L-1甘油和1 mmol*L-1KCl)悬浮5 min再加入终浓渡为20 mmol*L-1的3-(3-cholamidopropyl)dimethylammoniod-1-propanesulfonate(CHAPS),充分混匀后，-80℃保存.
, 百拇医药
1.2 方法 NOS活性测定采用3H-精氨酸转化生成3H-胍氨酸测定法[1].匀浆组织的每一组分取50 μL,加入50 μL反应缓冲液[50 mmol*L-1Hepes(pH 7.4)中含0.1 mmol*L-1 NADPH,30 μmol*L-1BH4,10 nmol*L-1钙调素,1.25 mmol*L-1CaCl2和1 mmol*L-1EGTA(iNOS测定管中不加钙调素和CaCI2)],加7.4 kBq 3H-精氨酸，于37℃水浴中反应15 min,用2 mL预冷的终止缓冲液(20 mmol*L-1Hepes液,pH 5.5,内含2 mmol*L-1EDTA,0.2 mmol*L-1 EGTA,1 mmol*L-1L-胍氨酸)终止反应，再经1.0 mL Dowex50 W-X8(Na+型)阳离子交换树脂层析柱分离反应液中的3H-精氨酸和新生成的3H-胍氨酸. 上样前层析柱先用1 mL终止反应液平衡. 上样后收集2 mL流出液和2 mL蒸馏水洗脱液，将收集的样品混匀后取出1.0 mL于闪烁杯中，加入甲苯-Triton x100闪烁液7 mL,在液体闪烁计数仪(Beckman产)上测定样品3H-胍氨酸的放射性活性(Bq)；在本底管中除加入1 mmol*L-1 L-硝基-精氨酸外，其余均同样品管. NOS活性分别由各自样品管与本底管Bq之差除以标本中蛋白含量(g),以kBq*g-1表示. 样品中蛋白含量测定采用Bradford方法[2]测定.
, 百拇医药
2 结果
2.1 肾匀浆颗粒组分中原生型NOS(cNOS)活性 基础状态下，在SHR和WKY常规组间cNOS活性分别为(65.9±13.6 )kBq*g-1和(67.7±19.5) kBq*g-1，两组相比差异不明显(P>0.05).然而，经Ach处理后,SHR和WKY肾内cNOS活性分别为(67.3±14.6 )kBq*g-1和(85.4±23.8)kBq*g-1，相差有显著意义(P<0.05).
2.2 肾匀浆可溶性组分中cNOS活性 基础状态下SHR和 WKY 肾脏可溶性组分中cNOS活性分别为(21.9±7.4 )kBq*g-1和(43.2±9.3 )kBq*g-1，相差意义明显(P<0.05).Ach处理后cNOS 活性分别为(20.6±7.1) kBq*g-1和(42.1±9.4 )kBq*g-1，与基础状态相比无显著性差异(P>0.05).
, 百拇医药
2.3 肾匀浆两组分中诱生型NOS(iNOS)活性 SHR和WKY无论在基础状态下还是在Ach刺激后，颗粒组分中均未检测到iNOS 活性；在可溶性组分中iNOS活性分别为(16.0±7.3) kBq*g-1和(17.8±6.5 )kBq*g-1，两组相比差异无统计学意义(P>0.05),Ach刺激对之无明显影响.
3 讨论
我们的研究显示：SHR肾内nNOS活性明显低于WKY；在Ach刺激后，肾内 eNOS 活性增加幅度也显著低于WKY. NOS活性受抑后中枢和周围交感神经兴奋性升高，从而导致高血压的发生. Sakuma等[4]研究表明,交感神经兴奋性增加与注射 NOS抑制剂后的血压升高相一致. 由于这种升压反应因脊髓切断而缓解，但并不因迷走神经切断和窦弓压力感受器切除而消失，提示NO作用于中枢交感神经，使其受抑. Toda等[5]还发现以六甲铵(神经节阻断剂)预处理后可消除对NOS抑制剂的加压反应. 这些结果提示,NO通过降低交感神经兴奋性达到舒张血管的目的. 由于NO可减少多段肾小管对钠的重吸收，因此 nNOS和eNOS活性绝对或相对不足可直接减少Na+和H2O的排泌. 此外还使个体对钠摄入的耐受性明显降低，较少的钠摄入即可导致显著的水潴留而升高血压. 本研究所证实的SHR肾内eNOS活性在Ach刺激后增加幅度显著低于WKY这一结果，提示SHR血管内皮细胞功能障碍. 由于某些舒血管活性物质对血管张力的调节是通过内皮细胞释放NO而引起，eNOS活性的相对不足可能是 SHR血管对某些舒血管活性物质反应性减弱的重要原因之一，这在高血压的形成和发展过程中可能起一定作用. iNOS活性与Dahl/Rapp大鼠的血压高低呈负相关[6]. 但我们未发现两组间 iNOS活性有任何不同. 造成这种差异的确切原因目前尚不清楚，可能与所使用的动物模型不同有关.
, 百拇医药
作者简介：张珊红(1958-),女(汉族),陕西省华县人. 主治医师，讲师. Tel.(029)3375243
参考文献:
[1] 强文安,刘 捷,吕芳玲et al. 3H-精氨酸转化测定一氧化氮合酶活性[J].中华医学杂志, 1996; 76(8): 567-571.
[2] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dyebinding[J]. Anal Biochem, 1976; 72:248-254.
[3] Stoos BA, Carretero OA, Farhy RD et al. Endothelium-derived relaxing factor inhibits transport and increases cGMP content in culture mouse cortical collecting duct cells[J]. J Clin Invest, 1992; 89: 761-765.
, http://www.100md.com
[4] Sakuma I, Togashi H, Yoshida M et al. NG-methyl-L-arginine, an inhibitor of L-arginine derived nitric oxide synthesis, stimulates renal sympathetic nerve activity in vivo; a role for nitric oxide in the central regulation of sympathetic tone?[J]. Circ Res, 1992; 70: 607-611.
[5] Toda N, Kitamura Y, Okamoto T. Neural mechanism of hypertension by nitric oxide synthase inhibitor in dogs[J]. Hypertension,1993; 21: 3-8.
[6] Chen PY, Sanders PW. Role of nitric oxide synthesis in salt-sensitive hypertension in Dahl/Rapp rats[J]. Hypertension, 1993; 22: 812-818.
收稿日期:2000-03-29; 修回日期:2000-08-21, http://www.100md.com
单位：张珊红 李源 龚卫琴(第四军医大学西京医院老年病科)；吴昌归(第四军医大学西京医院呼吸内科,陕西 西安 710033)
关键词：高血压病；一氧化氮合酶；肾脏
第四军医大学学报001032 摘 要: 目的 观察自发性高血压大鼠肾脏内一氧化氮合酶(NOS)活性变化，以探讨高血压病的发病机制. 方法 采用3H-精氨酸转变成3H-胍氨酸方法测定NOS活性. 结果 自发性高血压大鼠(SHR)肾蛋白内神经型NOS(nNOS)活性(21.9±7.4) kBq.g-1明显低于WistarKyoto(WKY)大鼠(4.32±9.3) kBq.g-1,P<0.05. 在乙酰胆碱(Ach)刺激后，SHR肾内内皮型NOS(eNOS)活性为(67.3±14.6 )kBq.g-1，而WKY肾内eNOS则为(85.7±23.8 )kBq.g-1，SHR也显著低于WKY(P<0.05). 结论 nNOS和eNOS活性不足在高血压病的发生和发展过程中可能起一定作用.
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中图号:R544.1 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)10-1271-02
Nitric oxide synthase activity in kidney of spontaneously hypertensive rats
ZHANG Shan-Hong，LI Yuan，GONG Wei-Qin
(Department of Gerontology, Xijing Hospital)
WU Chang-Gui
(Department of Respiratory,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
, 百拇医药
Abstract:AIM To investigate the change of activity of the nitric oxide synthase (NOS) in the kidney of spontaneously hypertensive rats and the role in the mechanism of hypertension. METHODS Activity of NOS was assayed by monitoring the convertion of 3H-arginine to 3H-citruline. RESULTS The activity of neural type of NOS (nNOS) in the kidney protein of spontaneously hypertensive rats (SHR) was much lower than that in Wistar Kyoto (WKY)(activity of nNOS: (21.9±7.4) kBq.g-1and (43.2±9.3) kBq.g-1 for SHR and WKY,respectively(P<0.05). After the stimulation by the acetylcholine(Ach)1, activity of endothelia type of NOS (eNOS) in SHR was also lower than that in WKY(activity of eNOS: (67.3±14.6) kBq.g-1 and (8.57±23.8) kBq.g-1 for SHR and WKY, respectively(P<0.05). CONCLUSION The insufficient activity of nNOS and eNOS could play important role in the genesis and development of hypertension.
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Keywords: hypertension; nitric oxide synthase; kidney
0 引言
高血压病的发生与肾功能的改变密切相关. 一氧化氮(NO)作为最简单的信使分子对肾脏血流动力学和肾小管功能起重要调节作用[3]. 因此探讨高血压病个体肾脏内一氧化氮合酶(NOS)活性变化，具有重要的理论和实践意义.
1 材料和方法
1.1 材料 18 wk龄自发性高血压大鼠(SHR)和Wistar-Kyoto大鼠各16只(购自中国医学科学院实验动物中心),SHR和WKY各分成两组即常规组和乙酰胆碱(Ach)处理组，每组8只，雌雄数目平衡.大鼠以ip戊巴比妥钠(40 mg*kg-1)麻醉后，切开腹壁，右肾动脉插管.在常规组先经导管输注Kreb's缓冲液1.0 mL (37℃,充入950 mL*L-1O2/50 mL*L-1CO2混合气体)，5 min注完；而在Ach组则先经导管输注1.0 mL 含Ach的Kreb's缓冲液(37℃,含10-5 mol*L-1 Ach,充入950 mL*L-1O2/50 mL*L-1CO2混合气体),5 min注完. 紧接着两组动物均经导管灌注4℃生理盐水15 mL(期间切开肾静脉)，然后切取肾组织，按1∶3比例加入50 mmol*L-1 Tris-HCl[pH 7.4,含1 mmol*L-1 EGTA,1 mmol*L-1苯甲基磺酸氟(PMSF),1 μmol*L-1抑胃肽A和2 μmol*L-1亮抑蛋白酶肽]，在4℃下匀浆2次，每次5 s，以1 000 000 g离心60 min(4℃),收集可溶液性部分，加入100 mL*L-1甘油，-80℃保存. 沉淀部分以50 mmol*L-1Tris-HCl 5 mL (pH 7.4,含1.0 mmol*L-1 EGTA,1 mmol*L-1PMSF,1 μmol*L-1抑胃肽A,2 μmol*L-1亮抑蛋白酶肽，100 mL*L-1甘油和1 mmol*L-1KCl)悬浮5 min再加入终浓渡为20 mmol*L-1的3-(3-cholamidopropyl)dimethylammoniod-1-propanesulfonate(CHAPS),充分混匀后，-80℃保存.
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1.2 方法 NOS活性测定采用3H-精氨酸转化生成3H-胍氨酸测定法[1].匀浆组织的每一组分取50 μL,加入50 μL反应缓冲液[50 mmol*L-1Hepes(pH 7.4)中含0.1 mmol*L-1 NADPH,30 μmol*L-1BH4,10 nmol*L-1钙调素,1.25 mmol*L-1CaCl2和1 mmol*L-1EGTA(iNOS测定管中不加钙调素和CaCI2)],加7.4 kBq 3H-精氨酸，于37℃水浴中反应15 min,用2 mL预冷的终止缓冲液(20 mmol*L-1Hepes液,pH 5.5,内含2 mmol*L-1EDTA,0.2 mmol*L-1 EGTA,1 mmol*L-1L-胍氨酸)终止反应，再经1.0 mL Dowex50 W-X8(Na+型)阳离子交换树脂层析柱分离反应液中的3H-精氨酸和新生成的3H-胍氨酸. 上样前层析柱先用1 mL终止反应液平衡. 上样后收集2 mL流出液和2 mL蒸馏水洗脱液，将收集的样品混匀后取出1.0 mL于闪烁杯中，加入甲苯-Triton x100闪烁液7 mL,在液体闪烁计数仪(Beckman产)上测定样品3H-胍氨酸的放射性活性(Bq)；在本底管中除加入1 mmol*L-1 L-硝基-精氨酸外，其余均同样品管. NOS活性分别由各自样品管与本底管Bq之差除以标本中蛋白含量(g),以kBq*g-1表示. 样品中蛋白含量测定采用Bradford方法[2]测定.
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2 结果
2.1 肾匀浆颗粒组分中原生型NOS(cNOS)活性 基础状态下，在SHR和WKY常规组间cNOS活性分别为(65.9±13.6 )kBq*g-1和(67.7±19.5) kBq*g-1，两组相比差异不明显(P>0.05).然而，经Ach处理后,SHR和WKY肾内cNOS活性分别为(67.3±14.6 )kBq*g-1和(85.4±23.8)kBq*g-1，相差有显著意义(P<0.05).
2.2 肾匀浆可溶性组分中cNOS活性 基础状态下SHR和 WKY 肾脏可溶性组分中cNOS活性分别为(21.9±7.4 )kBq*g-1和(43.2±9.3 )kBq*g-1，相差意义明显(P<0.05).Ach处理后cNOS 活性分别为(20.6±7.1) kBq*g-1和(42.1±9.4 )kBq*g-1，与基础状态相比无显著性差异(P>0.05).
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2.3 肾匀浆两组分中诱生型NOS(iNOS)活性 SHR和WKY无论在基础状态下还是在Ach刺激后，颗粒组分中均未检测到iNOS 活性；在可溶性组分中iNOS活性分别为(16.0±7.3) kBq*g-1和(17.8±6.5 )kBq*g-1，两组相比差异无统计学意义(P>0.05),Ach刺激对之无明显影响.
3 讨论
我们的研究显示：SHR肾内nNOS活性明显低于WKY；在Ach刺激后，肾内 eNOS 活性增加幅度也显著低于WKY. NOS活性受抑后中枢和周围交感神经兴奋性升高，从而导致高血压的发生. Sakuma等[4]研究表明,交感神经兴奋性增加与注射 NOS抑制剂后的血压升高相一致. 由于这种升压反应因脊髓切断而缓解，但并不因迷走神经切断和窦弓压力感受器切除而消失，提示NO作用于中枢交感神经，使其受抑. Toda等[5]还发现以六甲铵(神经节阻断剂)预处理后可消除对NOS抑制剂的加压反应. 这些结果提示,NO通过降低交感神经兴奋性达到舒张血管的目的. 由于NO可减少多段肾小管对钠的重吸收，因此 nNOS和eNOS活性绝对或相对不足可直接减少Na+和H2O的排泌. 此外还使个体对钠摄入的耐受性明显降低，较少的钠摄入即可导致显著的水潴留而升高血压. 本研究所证实的SHR肾内eNOS活性在Ach刺激后增加幅度显著低于WKY这一结果，提示SHR血管内皮细胞功能障碍. 由于某些舒血管活性物质对血管张力的调节是通过内皮细胞释放NO而引起，eNOS活性的相对不足可能是 SHR血管对某些舒血管活性物质反应性减弱的重要原因之一，这在高血压的形成和发展过程中可能起一定作用. iNOS活性与Dahl/Rapp大鼠的血压高低呈负相关[6]. 但我们未发现两组间 iNOS活性有任何不同. 造成这种差异的确切原因目前尚不清楚，可能与所使用的动物模型不同有关.
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作者简介：张珊红(1958-),女(汉族),陕西省华县人. 主治医师，讲师. Tel.(029)3375243
参考文献:
[1] 强文安,刘 捷,吕芳玲et al. 3H-精氨酸转化测定一氧化氮合酶活性[J].中华医学杂志, 1996; 76(8): 567-571.
[2] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dyebinding[J]. Anal Biochem, 1976; 72:248-254.
[3] Stoos BA, Carretero OA, Farhy RD et al. Endothelium-derived relaxing factor inhibits transport and increases cGMP content in culture mouse cortical collecting duct cells[J]. J Clin Invest, 1992; 89: 761-765.
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[4] Sakuma I, Togashi H, Yoshida M et al. NG-methyl-L-arginine, an inhibitor of L-arginine derived nitric oxide synthesis, stimulates renal sympathetic nerve activity in vivo; a role for nitric oxide in the central regulation of sympathetic tone?[J]. Circ Res, 1992; 70: 607-611.
[5] Toda N, Kitamura Y, Okamoto T. Neural mechanism of hypertension by nitric oxide synthase inhibitor in dogs[J]. Hypertension,1993; 21: 3-8.
[6] Chen PY, Sanders PW. Role of nitric oxide synthesis in salt-sensitive hypertension in Dahl/Rapp rats[J]. Hypertension, 1993; 22: 812-818.
收稿日期:2000-03-29; 修回日期:2000-08-21, http://www.100md.com